免疫细胞的分离

免疫细胞的分离免疫学检验技术—*—

提问免疫细胞的分离一位HIV感染患者，现要全面评价其免疫功能，需要进行T细胞计数，怎样分离纯化T细胞呢？—*—

免疫细胞的分离标本血液离心后的抗凝血血液成分组成及比密①血浆（1.030-1.035）②血小板PLT（1.030-1.035）

白细胞WBC（单核细胞M+淋巴细胞L：1.075-1.090；粒细胞N+E+B：1.092）③红细胞RBC（1.093）外周血单个核细胞（PBMC）：L+M—*—

免疫细胞的分离PBMC的分离（比密不同）

1、Ficoll分离法1）分层液：聚蔗糖-泛影葡胺（Ficoll-Hypaque，均为商品名）分层液（1.077±0.001）2）方法：单次密度梯度离心分离法（离心一次）—*—

免疫细胞的分离PBMC的分离（比密不同）

1、Ficoll分离法3）过程：取外周血，置于肝素抗凝管中→PBS液稀释→沿管壁轻轻叠加在Ficoll-Hypaque分层液上→离心、观察→沿管壁轻轻吸取单个核细胞→洗涤、离心、计数→台盼蓝染色（活细胞不着色、死细胞呈蓝色）4）结果：细胞获得率80%（T＞25℃有影响），纯度95%，其中淋巴细胞占60%~70%。动画：Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞的基本过程—*—

免疫细胞的分离PBMC的分离（比密不同）

2、Percoll分层液法1）分层液：Percoll【经聚乙烯吡咯烷酮（PVP）处理的大小不一的硅胶颗粒】（大小不一、重量不一）2）方法：连续密度梯度离心分离法（离心两次）—*—

免疫细胞的分离PBMC的分离（比密不同）

2、Percoll分层液法3）过程：第一次离心：PVP处理的硅胶颗粒形成从下到上依次递减的连续密度梯度；将抗凝全血稀释液加在离心后的硅胶颗粒上；第二次离心：血液中的每一种细胞根据自己的重量，在连续的密度梯度中找到自己的位置，形成上图中的细胞带。动画：Percoll分层液法分离血细胞的基本过程—*—

免疫细胞的分离淋巴细胞的纯化PBMC去除成分①红细胞RBC②血小板PLT③单核细胞M—*—

设计情景提问免疫细胞的分离准备三个烧杯，分别加入低渗盐水（<0.85%NaCl）、等渗盐水（=0.85%NaCl）和高渗盐水（>0.85%NaCl），将正常人的红细胞放进去，它的形态会发生怎样的变化呢？哪一种液体适合破坏红细胞？动画：红细胞在低渗、等渗和高渗NaCl溶液中的形态变化—*—

免疫细胞的分离1）低渗裂解法（无菌蒸馏水适量）2）氯化铵裂解法去除红细胞1）少量血小板→洗涤2）很多血小板→胎牛血清梯度离心去除血小板—*—

免疫细胞的分离去除单核细胞1）黏附法（M黏附玻璃、塑料、棉花纤维和葡聚糖凝胶，37℃，Ca2+）（黏附去除）—*—

免疫细胞的分离去除单核细胞2）羧基铁吞噬法（M具有吞噬功能）（磁铁吸附去除）动画：羧基铁吞噬法去除PBMC中的单核细胞—*—

免疫细胞的分离去除单核细胞2）苯丙氨酸甲酯去除法（M含溶酶体）动画：苯丙氨酸甲酯法去除PBMC中的单核细胞—*—

免疫细胞的分离淋巴细胞亚群的分离（主要分离T、B细胞）待分离T细胞/B细胞分离方法1、E花环沉降法2、尼龙棉分离法3、免疫磁珠分离法4、流式细胞术分离法（最好）—*—

免疫细胞的分离E花环沉降法（主要分离T细胞）机理：成熟T细胞表面有SRBC受体（CD2/E受体），能与SRBC结合，形成玫瑰花环样细胞团（E花环）。动画：E花环沉降法分离T细胞的过程—*—

免疫细胞的分离E花环沉降法（主要分离T细胞）过程：1）SRBC和PBMC混合，SRBC和T细胞充分反应，形成E花环；2）用Ficoll分层液分离E花环；3）低渗法裂解SRBC，可得到T细胞。结果：纯度为95%~99%，T细胞可刺激活化。—*—

免疫细胞的分离尼龙棉分离法（主要分离B细胞）机理：B细胞易黏附尼龙棉纤维，T细胞不易黏附。过程：1）尼龙棉均匀地填充在内径5-6nm的聚乙烯塑料管内，制成尼龙棉柱；2）经Hank’s液，浸泡平衡；动画：尼龙棉分离法分离T、B细胞—*—

免疫细胞的分离尼龙棉分离法（主要分离B细胞）3）将待分离的细胞悬液加入柱中，37℃，静置1-2h；4）用预热的含10%-20%小牛血清细胞培养液洗柱，收集洗脱液，内含T细胞;5）用冷培养液边冲洗边挤压塑料管壁，此时洗脱液内含B细胞。结果：T细胞纯度＞90%（T细胞不活化），B细胞纯度＞80%。—*—

提问免疫细胞的分离如果要分离出L里的T细胞和B细胞，T细胞表面特异表达CD3，B细胞表面特异表达CD19，现有磁珠包被的抗CD3和抗CD19，怎样分离T细胞呢？抗CD3抗CD19—*—

免疫细胞的分离免疫磁珠分离法（阳性选择）阳性选择：目标细胞T参与反应基本过程：1）磁珠包被的抗CD3与溶液中的T细胞反应；2）磁铁吸附，倒出上清液；3）杯中含T细胞。动画：免疫磁珠分离法分离T细胞（阳性选择）—*—

免疫细胞的分离免疫磁珠分离法（阴性选择）阴性选择：目标细胞T不参与反应基本过程：1）磁珠包被的抗CD19与溶液中的B细胞反应；2）磁铁吸附，倒出上清液；3）上清液中含T细胞。动画：免疫磁珠分离法分离T细胞（阴性选择）—*—

免疫细胞的分离流式细胞术分离法细胞