抑制性削杂交PCR

抑制性削减杂交PCR削减杂交是一强有力的使研究人员能够比较两种mRNA群和获得仅在一mRNA群表达而在另一mRNA群没有表达克隆的强有力的技术。虽然有几种不同的方法，但削减杂交背后的基本理论却非常简单。首先，两组mRNA均转化为cDNA：我们将含有特异（差异表达的）转录物称为“tester”,对照cDNA称为“driver”。Tester和DrivercDNA进行杂交，接着去除杂交序列。结果，保留的未杂交的cDNA就代表了那些仅在tester组表达，而在driver组不表达的mRNA。虽然传统的减法杂交方法在某些研究中已成功运用，但要求几轮的杂交且也不适合鉴定稀有信息。CLONTECHPCR-SelectTMcDNA削减杂交是唯一克服了传统减法杂交的这些缺点的方法。图1表示PCR-Select过程的简短回顾。本方法的几个特点使其具有高效和可重复性。方法仅要求0.5--2jigpolyA0+RNA，花3—4天时间，也不用分离ss和ds分子。而且，抑制性PCR预防了不需要的扩增而使目标分子得到富集。图2详细地描述了发生在PCR-SelectcDNA消减杂交分子事件。首先，cDNA从0.5--2|ig的polyA+RNA合成。Tester和drivercDNA以RsaI酶切，该酶为一四碱基限制性内切酶，产生平末端。TestercDNA接着分成两部分，每一部分连一不同的cDNAadaptoroAdaptor的末端无磷酸基团，因此仅有adaptor的一链与cDNA5’末端相连。两adaptor具有不同的序列，这样当残留末端被补平后就能够同两个不同的PCR引物退火（AppendixB）。接着进行两轮杂交。首先，过量的drivercDNA加入到每一tester样品，然后热变性和退火，在每一样品产生a、b、c和d分子（图2）o由于杂交二级动力学的原因，高丰度分子退火快，因此高和低丰度序列在a型分子中的浓度趋于均衡。同时，与在driver中没有差异表达的分子c型ss分子明显富集。在第二次杂交期间，两第一次杂交的样品不经变性直接混合。现在，仅有保持平衡的和消减的sstestercDNA能够重新配对形成新的e型杂交体。这些新杂交体成为具有不同的dsDNA分子，分别为tester1（与adaptor1相连）和tester2（分别与adaptor2相连）。将新变性的drivercDNA加入无需再次变性的已经第一次杂交反应的两混合物，进一步富集差异表达序列e型分子。经DNA多聚酶补平末端后，e型分子一差异表达的tester序列一在5’和3’端具有不同的退火位点。接着整个分子群进行PCR以扩增需要的差异表达序列。在PCR中，a和d分子无引物退火位点，因而不能被扩增。由于抑制性PCR效应，绝大多数b型分子形成盘状结构而阻止其指数扩增（AppendixA）。c型分子仅有一个引物结合位点而仅能被线性扩增。仅有e型分子，有两个不同adaptor，能被指数扩增，产生均衡的差异表达序列。进而，进行第二次PCR扩增以进一步减少背景和富集差异表达序列。此时，差异表达的cDNA就能直接插入T/A克隆载体（例，使用CLONTECH’sAdvanTAgePCRCloningKit,#k190【1）或任何使用RsaI位点作为adaptor/cDNA连接的载体。然后，差异表达的RNA能被测序、杂交分析鉴定。PCR混合物也可用作杂交探针进行DNA文库筛选。PCR-Selectdifferentialscreening获得消减cDNA文库后，重要的是确认代表差异表达基因的的单个克隆，ThisistypicallyaccomplishedbyprobingNorthernblotswithrandomlyselected,subtractedclones。然而这既耗时又低效，尤其是关系很近的RNApopulations相互比较消减文库中可能包含相当数量的假阳性。在Northern杂交分析前利用消减文库的差异筛选有助于减少假阳性，节省时间和精力。如果你的起始材料有限，你可以用CapFinderPCRcDNASynthesisKit(#k1052-1)预先扩增你的总RNA以用于PCR-SelectKit,当总RNA用常规方法合成cDNA时，即便是使用Oligo(dT)引物，核糖体RNA也会同polyA+RNA一起被反转录。如果这种cDNA用于PCR-SelectKit，过量的核糖体RNA和低浓度的与PolyA+RNA相对应的cDNA浓度将导致无效减法杂交。使用CapFinderPCRcDNASynthesisKit可直接用于PCR-SelectcDNA合成tester和driverdscDNA从待比较的mRNA合成RsaI消化Tester和drivercDNA分别消化以获得短的平末端分子Adaptor连接试验组平分成两份，分别连上不同的adaptor,但drivercDNA无adaptor第一次杂交杂交动力学导致均衡和富集差异表达序列第二次杂交以产生用于PCR扩增模板的差异表达序列第一次PCR扩增使用抑制性PCR，仅差异表达的序列呈指数级扩增第二次PCR扩增背景减少，不同表达的序列进一步富集图1.CLONTECHPCR-Select过程的概况，含特异转录物cDNA称tester，对照称driverX-Gal&蓝白斑筛选(2008-12-2321:43:50)转载▼标签：教育分类：知识海洋消减杂交，即便是总RNA用作起始材料(注意：使用CapFinderPCRcDNALibraryConstructionKitAK1051-1产生的擦与PCR-SelectKit并不相容。)一旦你确定了差异表达cDNA，那么Marathon&tradecDNAAmplificationKit(#K1802-1)MarathonReady&tradecDNA可以提供优秀的克隆相应全长的方法(Chenchiketal.1996)。欲求更多的信息，参阅相关产物的描述。二、试剂成分表RNA存于-70°C，储存4x杂交液于室温。其它储存于-20°C。本试剂盒提供的足够7次cDNA合成的试剂。每次反应最好使用2^gpolyARNA，但也可少至0.5^g。但是，如果使用低于2^g的polyARNA，在消减过程中，低丰度的差异cDNA可能丢失。7次cDNA合成相当于6次完全的消减实验和1次对照。如果每次合成用于不同实验的tester和driver(在特殊系统鉴定上调或下调cDNA)，PCR试剂足够50次primary和100次secondaryPCR反应。参阅附录B的primer和adaptor序列。第一链的合成四、ClontechPCR-SelectcDNA消减步骤B、RNA的准备和处理1、一般注意事项完整的、纯的polyARNA是合成高质量cDNA所必须的。为了避免RNA污染和降解，将RNase减少到最低程度，使用下面注意事项：戴手套以避免手上的RNase污染。使用无气溶胶的吸尖以测量小体积和灭菌一次性吸管测量大体积2、RNA分离使用相同试剂和方法3、RNA分析总RNA和polyARNA分离后，用甲醛变性胶/EB检测其完整性。乳动物总RNA典型表现为两条带，28和18S位于4。5和1。9KB，比率1。5-2。5：1。如果比率小于1：1，检查所有RNA分离试剂是否有RNA酶污染或找另外组织细胞分离RNA。乳动物polyARNA表现为从0。5-12kb的Smear和弱的rRNA1.9,4.5kb。质量差的RNA会引起高背景，不应使用。C、 cDNA第一链的合成使用tester、driver和对照polyARNA完成本操作。本节得到的cDNA将作为以后步骤的对照cDNA。在下节，将通过加入少量质控cDNA(Hae3-消化的X174)到骨骼肌dsDNA以制作模拟testercDNA。用这些骨骼肌tester和drivercDNA与自己的消减实验平行作一完整的对照消减实验。对照消减实验可用于估计合成的cDNA的产量和大小范围。它也是证明实验的多步骤是否有效的最好办法。注：不要用水浴或PCR仪。蒸发可能减少反应混合物体积，减低反应效率。8、反应管置冰上以终止第一链合成并立即进入D节。D、 cDNA第二链合成使用每一第一链tester、driver和对照骨骼肌cDNAE、 Rsa1消化用每一实验dstester和drivercDNA，对照骨骼肌cDNA。这一步产生短的、平末端dscDNA片段以供消减杂交和F节与adaptor连接。准备实验drivercDNA和对照骨骼肌drivercDNA到此完成。按SectionF完成实验和对照骨骼肌testercDNAsF、Adaptor连接准备adaptor连接的testercDNA的实验计划如图3所示。对于每一个实验组testercDNA和对照骨骼肌cDNA，需要制备一与Adaptor-1相连的tester(Tester1-1)和一与Adaptor-2相连的tester(Tester1-2)和一连接了双adaptors的testercDNA(非杂交的testercontrol1-c)。非杂交的tester对照用作消减杂交的阴性对照。Adaptors提供了不同的PCR引物退火位点。下面的步骤用于完成每个不同的实验cDNA和对照骨骼肌testercDNA。Adaptor不能连于drivercDNAo1、 对于每一实验testercDNA,用7.5|il消毒dH2O稀释来源于SectionE的Rsal消化的实验cDNA。2、 准备对照骨骼肌testercDNA这就是对照骨骼肌testercDNA,含0.2%Hae3-消化的松174DNA,每一片段相当于总cDNA的0.02%。当用骨骼肌testercDNA和drivercDNA消减杂交后，在最后的PCR产生的主要条带应对应于这些对照片段。3、准备用于所有连接和一个额外反应的足够MasterMix,每一反应包括1皿消毒dH2O,2^l5x连接缓冲液和1.0|ilT4DNA连接酶（400u/|il）注意：连接所需的ATP在T4DNA连接酶里（初始为3Mm，结束时为300J1M）4、 对于每一实验testercDNA和对照骨骼肌testercDNA,按下表顺在一0.5ml离心管中混合下列试剂，上下吹打以完全混匀。表1、配制连接反应（重复实验testercDNA和对照骨骼肌cDNA）G、第一次杂交重要启示：在进行下面描述的杂交之前，我们推荐完成连接效率分析（SectionV.C结果分析和困难指导）。如果连接没有成功，在杂交之前应重复连接反应。在下面的过程中，每一testercDNA均加入过量的cDNA，然后标本热变性和退火。退火之后，高丰度和低丰度序列的ss形式被均衡，因为由于二级杂交动力学的原因，高丰度的分子退火快。而且，留下的差异表达的sscDNAs（为第二次杂交所需）明显富集，因为tester和drivercDNA非目标cDNA形成杂合体。重要事项：开始杂交前，一定要使4x杂交缓冲液已到室温至少15-20min。在使用缓冲液前，要保证没有可见颗粒和沉淀。如有必要，37^加热10min以溶解任何沉淀。1、对于每一实验和骨骼肌消减杂交，在一0.5ml离心管中按下表混合试剂表2、配制第一次杂交反应（重复每一实验testercDNA和对照骨骼肌cDNA）H、第二次杂交两份来自于第一次杂交的标本混合在一起，且新变性的drivercDNA也可以进一步富集差异表达的序列。末端具有不同adaptor的代表不同表达的cDNA新杂合体分子就形成了。注意:不要在此阶段变性第一次杂交的标本，也不要将杂交标本置于PCR仪外超过加入新的driver所需时间。对于每一实验testercDNA和对照骨骼肌cDNA重复下列步骤：I、PCR扩增差异表达的cDNA在这一节所描述的反应中得到选择性扩增。在热循环之前，需要75^短暂预孵育以填平adaptor丢失的链（步骤7）,这是为了创造PCR引物1的结合位点。在第一次扩增时，仅末端具有不同adaptor序列的dscDNA呈指数扩增。在第二次，巢氏PCR被用来进一步降低背景和富集差异表达的序列。推荐的最小实验为5个反应：①消减的实验cDNA；②非消减的testercontrol（1-c）；③消减的对照骨骼肌cDNA；④非消减的testercontrol（2-c）:⑤PCRControl消减cDNA（kit内提供）。PCRControl消减cDNA提供一个阳性PCR对照和含一成功的Hae3-消化松174DNA消减混合物。推荐再作一标准PCR对照（如AdvantagecDNAPCRkit中提供的对照模板）以验证酶有效工作与否。在第一次杂交步骤时，有sstester分子均衡化发生。因此，在第二次杂交时，形成了一非常低浓度的具有不同adaptor的cDNA分子（见简介，图2）。因而，仅有1000-10000个这种目标分子存在于1皿稀释的消减cDNA中，且在PCR后，在消减的cDNA中，差异表达的cDNA可能未被很好的represented。为了增加该消减文库的代表性，建议进行几次相同的独立的第一次PCR扩增，然后在第二次PCR前混合。注意：所有的循环参数均已经Perkin-ElmerDNAThermalCycler480和Perkin-ElmerGeneAmpPCRSystem2400/9600优化。如果使用不同的PCR仪，循环参数必须优化。如果不使用AdvantageKlenTaqPolymeraseMix，可以使用TaqDNA多聚酶。但是，在第一和第二次PCR中，需要增加3-5个循环，而且也必须使用热启动（更多的信息，请参阅简介，SectionIV.A）。Clontech’sTaqStartAntibody（#5400-1,-2；AdvantageMix中有）工作得很好。可以按下完成热启动：①准备没有Taq酶的第一次PCRMasterMix；②混合PCR标本并加热反应混合物至75°Cmin；③迅速加入所需的Taq酶；④75°C孵育5min；⑤按步骤8完成PCR。1、准备PCR模板a、取1皿每一稀释的cDNA（每一从步骤IV.H.8和来源于步骤IV.F.10相应未消减的对照）加入一合适的标记管b、取川1PCRControl消减cDNA(试剂盒提供)加入一合适的标记管2、准备所有第一次PCR加一额外管的MasterMix。对于每一计划的反应，按表3的顺序混合试剂。表3、准备第一次PCRMasterMixPerkin-ElmerDNAThermalCycle480PCR产物中应富集差异表达cDNAo另外，在原始mRNA中丰度不同的差异表达转录物粗略趋向于相同的比例。参阅SectionV.D和V.E的结果分析一图6显示的是用从骨骼肌polyARNA来的cDNA所作的成功了的对照消减杂交。图7和8显示的是单纯的消减效率检测。可以用T/A载体克隆产物(见SectionVI.C)或使用RsaI位点，用合适的载体完成平末端连接而形成消减文库。消减混合物也是筛选基因组DNA、全长cDNA文库、YAC、BAC或粘粒克隆的理想探针。当完成了消减cDNA文库后，可用Northern杂交分析证实个体克隆的表达特征。在我们的经验，消减文库中与差异表达mRNA相对应的克隆的百分数变化非常大，高的达95%，中等的40-60%，低的5%。推荐随机挑选10-20个克隆作为Northern杂交的探针。如果少于2个克隆被证实为差异表达基因，应当完成差别筛选过程(SectionVI.C)以排除假阳性。如果缺乏完成标准的Northern杂交的足够的polyARNA，可以创造虚拟的Northern杂交以产生类似的信息。要进行虚拟Northernblot，使用CapFinderPCRcDNA合成试剂盒(#k1052-1)以从总的或polyARNA样品产生CapFindercDNA。然后在琼脂糖凝胶上电泳CapFindercDNA，原位变性，转移到尼龙膜。有关CapFindercDNA合成技术和虚拟Northernblot的更多信息，请参阅1996年10月的CLONTECHniques。V、结果分析和疑难解答A、析dscDNA合成产物1、 一般推荐a、 为了监测cDNA合成的进展和产量，用实验样品和对照骨骼肌polyARNA完成cDNA第一链和第二链的合成。推荐在第一链合成反应混合物中加入［a-3宇］dCTP以监测cDNA合成和纯化。b、 使用高质量polyARNAodscDNA的产量依赖于RNA的质量。从骨骼肌来的对照polyARNA典型产生2^gdscDNA。从高质量实验polyARNA来的dscDNA产量类似(1-2吒)。用如图4所示的琼脂糖凝胶分析cDNA合成和RsaI消化的效率。2、dscDNA合成的疑难解答a、如果琼脂糖凝胶分析显示实验dscDNA产量较从骨骼肌polyARNA来的dscDNA低，但大小分布相似，仍可以使用实验cDNA。但是，可能已丢失了低丰度的差异表达序列。替代的方法是可以使用更高浓度的polyARNA重复第一链cDNA合成。、如果实验dscDNA琼脂糖凝胶电泳呈现为＜1-2kb的片状物，RNA可能不纯或已经降解了。在福尔马林变性琼脂糖凝胶使用开始材料检测RNA。完整的腐乳类动物polyARNA应该是一片状物(通常0.5-9kb)，分别在4.5和1.9kb处伴有清晰的28s和18sRNA带。对非腐乳类物种，polyARNA的分布可能较小(0.5-3kb)。如果实验polyARNA显得较期望的小(如不大于1-2kb)，或者在起始总RNA中28s对18sRNA强度比小于1：1，检测RNA纯化试剂是否含有RNase或其它杂质，而且，有必要的话，使用新的试剂制备RNA。如果问题依然存在，也许需要找另外的polyARNA源，例如CLONTECH’sPolyARNAs。c、第一链cDNA合成的polyARNA优化浓度为50-200|ig/ml。如果使用低浓度RNA，合成的cDNA产物大小分布可能减低。B、 分析RsaI消化取2.5皿未消化的dscDNA和5皿RsaI消化的cDNA于1xTAE缓冲液中，在1%琼脂糖上电泳，比较结果。从polyARNA来的dscDNA显示为0.5-10kb的片状物。亮的带与丰富的mRNAs或rRNAs相对应。对某些非哺乳类来源的RNA的大小分布可能仅0.5-3kb°RsaI消化后，平均cDNA大小较小(0.1-2kb对0.5-10kb)。如果样品或对照cDNA大小在RsaI消化后并未减小的话，重复酚/氯仿抽提，乙醇沉淀和消化。可选项目。为了鉴定样品是否完全消化，取1小部分1小时和1小时20分钟的DNA样品并在琼脂糖凝胶上比较。如果两份样本的DNA大小分布相似，消化完全。C、 分析连接推荐完成下列PCR实验以证明至少25%的DNA在其双末端具有adaptor。本实验是设计来用以扩增跨越Tester1-1和Tester1-2的adaptor/cDNA连接的片段(见SectionIV.F)。对照实验中的G3PDH引物适用于人、小鼠和大鼠。对其它物种，需要设计合适的引物。注：推荐作一标准PCR对照(如AdvatagecDNAPCR试剂盒的阳性对照模板)以证实酶是有效的。典型结果见图5。如果在20轮循环后不能看见产物，增加5个循环，再次凝胶分析产物。循环数取决于cDNA中G3PDH的量。在骨骼肌，G3PDH非常丰富，可以看到使用一个基因特异性引物（G3PDH3’引物）和PCR引物1的PCR产物应同使用两个基因特异性引物（G3PDH3’和5’引物）扩增的PCR产物有相似的强度，如图5。如果这些PCR产物的相应片段相差4倍以上，则连接效率低于25%。这将明显降低消减效率，需重复连接反应。如果使用小鼠或大鼠cDNA，使用G3PDH3’引物和PCR引物1扩增的PCR产物将是大小1.2kb而不是人的0.75kb带（因为大鼠和小鼠G3PDHcDNA两引物间缺失RsaI限制性内切酶位点）。但是，如果你使用人cDNA（含RsaI位点），而观察到了1.2kb带和预期大小的带，提示cDNA未被完全消化。如果有明显的未消化产物，重复RsaI消化。W、额外实验A、 减效率的PCR分析无论是PCR（本节）或杂交分析（SectionW.B）均可用来估计消减效率。这两种方法均是通过比较消减前后已知cDNA丰度而实现的。理想的是既比较已知的未差异表达的基因（如管家基因），也比较已知的差异表达基因。PCR方法较杂交分析快。下面描述的方法是使用试剂盒提供的G3PDH引物以证实PCR-Select过程后相对减低的G3PDH的丰度。注意这些G3PDH仅可用于人、小鼠及大鼠。并非所有管家基因平衡消减。虽然在大多数组织和细胞，G3PDH非常有效地消减，但也有例外，包括骨骼肌和心脏。由于这个原因，不推荐使用G3PDH丰度以分析骨骼肌对照的消减效率。从骨骼肌来源的其它大多数管家基因被非常有效地消减，因而可以使用。一般来说，如果G3PDH丰度在消减后没有明显下降，应该检查其它管家基因的丰度（如a-tubulin）。但是，在对照骨骼肌消减实验，松174/HaeIII消化的琼脂糖凝胶条带形式（图6,2歹列）已经显示消减是否成功。图7显示的是消减成功的混合物中G3PDH减少的例子。对于一非消减cDNA，可在18-23循环间看到G3PDH产物，这取决于特异cDNA中G3PDH的丰度。（例如，在骨骼肌和心脏polyARNA，G3PDH异常丰富）。但是，在消减样品，可在5-15个循环后才见。作为差异表达基因富集的阳性对照，使用已知仅在testerRNA中，但不在driverRNA中表达的已知基因的PCR引物重复上述过程。该cDNA在消减后应富集。从消减的和非消减的样品中等量扩增相应PCR产物所需的循环次数的差别反映了消减的效率。5个循环粗略相当于20倍cDNA浓度差别。由于发生于消减中的均衡化，富集的水平取决于每一差异表达基因的起始丰度及在tester和driver中的丰度差。TestercDNA中低丰度的差异表达基因较高丰度的差异表达基因富集得更多。汪意不要用在扩增cDNA片段两引物间含有RsaI酶切位点的PCR引物。某些序列可能不能被杂交或扩增，而来源于同样cDNA的其它cDNA片段可能剧烈富集。杂交分析可以提供更多有关似乎已丢失的cDNA片段的信息。B、 消减效率的杂交分析使用不同基因作为探针对消减的和非消减的（非消减Testercontrol1-c）进行斑点与Southern杂交分析可以帮助确定消减是否成功。如图8所示，消减后管家基因cDNA丰度应降低，而已知上调基因cDNA应当上升。虽然Southern杂交分析是检查消减效率的一敏感指标，但偶尔可观察到非预期大小的背景条带。区另卜真阳性条带”（真正代表消减的基因）和背景条带应用两条标准。首先，真阳性条带的强度应随消减期间PCR循环数呈比例增加。偶尔，非常强的条带会仅仅出现在最高循环的部分（即，大于30个循环扩增）。这样的条带应看着是背景。另外，一条带某些时候可能出现在一个部分而不出现于其它部分。这些条带可能是污染或者是因为消减杂交后非常低的目标分子浓度在特异PCR期间发生的随机事件。真阳性条带的第二个标准是应该被两套引物（primary和nested）所扩增。由于用巢氏引物来的PCR产物较flanking引物来的要小一点，第二次PCR扩增后真阳性条带在分子量上应轻微下移。图9显示了一可能在Southern杂交中观察到的背景类型例子。对这项实验，PCR-SelectcDNA消减是用刺激的和非刺激的T-细胞杂交瘤（即使用和未使用抗T-细胞受体抗体）的polyARNA完成的。消减效率的Southern杂交检测是用两管家基因作探针来完成的：G3PDH和a-tubulin。在G3PDH（A部）探针的Southern杂交中，条带A是真阳性，因为它符合两条标准：其强度随PCR循环数成正比增加，第二次PCR后分子量轻微下移。相反，另外的条带可归于背景，因为它们不符合标准。消减部分标记为B的三条带可能代表在消减文库中高度富集的PCR产物，仅仅由于其丰度而与G3PDH探针交叉杂交。确实，探针也于分子量Marker杂交（c），而后者并不含G3PDHDNA，但其量很大。这些背景条带的另外的可能的解释是PCR引物与基因特异性序列部分同源。相反，以a-tubulin作探针的Southern（图B）显示了非常弱的背景。所有的这些条带均为真阳性，值得进一步研究。勿容置疑，如在两Southern杂交所见，超过30个第一次PCR循环和14个第二次PCR循环导致明显的背景。C、消减文库的差别筛选在多数情况下，CLONTECHPCR-Select消减方法大大地富集了差异表达基因，但是，消减样品中仍含有一些与tester和driver共同都有的mRNA相对应的cDNA。虽然这种背景可能与RNA纯化的质量和特异消减的完成有关，但主要是因为在tester和driver中差异表达的mRNA种数非常少。一般来说，差异表达的mRNA越少，量的差别越小，意谓着越高的背景一即使获得了一好的差异表达cDNA的富集。当背景很高的时候，从消减文库随机挑取克隆进行Northern杂交分析是耗时且低效的。建议在进行Northern分析之前完成一差别筛选以缩小背景。差别筛选消减文库有两种方法。第一是用从tester和driver合成的［a-3弟］dCTP标记的第一链cDNA作探针杂交消减文库。与差异表达mRNA相对应的克隆仅会被tester探针杂交，而不被driver探针杂交。虽然本方法被广泛应用，但有一主要缺点，仅相对于高丰度mRNA的cDNA分子（即合成cDNA占总cDNA探针0.2%以上的mRNA）能够与克隆杂交。与低丰度的差异表达mRNA不能被本筛选方法检测。为了避免丢失低丰度的差异表达基因，推荐使用另外一种方法。根据该方法，消减文库将被其本身（“+”消减探针）和“反-未消减”cDNA（“-”消减探针）杂交。为了制备“-”消减探针，将原始的testercDNA作为driver而将drivercDNA作为tester进行消减杂交。代表真正差异表达mRNA的克隆仅被“+”探针杂交，与“-”探针杂交的克隆可以看着是背景。本方法绕过了丢失低丰度mRNAs的困难，但是，它要求一额外的步骤，去除PCR-Select过程所产生的cDNA分子两端的adaptor序列。尽管adaptor序列很小，但当以“+”和"-”探针杂交