重组DNA技术的基本工具课件【高效备课精析+知识精讲提升】 高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

第三章基因工程第1节

重组DNA技术的基本工具人教版·选择性必修3（第一课时）问题探究：

我国是棉花的生产和消费大国，棉花在种植过程中常常会受到棉铃虫的侵袭，使棉花大量减产，严重时甚至绝收。大量施用农药杀虫不仅提高了生产成本，还可能造成农产品和环境的污染，如果能培育出自身就能抵抗虫害的棉花新品种，就能解决这一问题。

棉花本身不具有“杀虫基因”，而苏云金杆菌有一种“杀虫基因”，它能通过编码产生抗虫蛋白来杀死棉铃虫。问题探究：1.基因工程的概念

是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。科技探索之路：基因工程的诞生与发展原理操作水平目的基因重组DNA分子水平定向地改造生物的遗传性状，获得人类所需要的生物类型和生物产品水母的绿色荧光蛋白基因科技探索之路：基因工程的诞生与发展2.基因工程诞生的理论基础科技探索之路：基因工程的诞生与发展拼接的基础1.DNA的基本组成单位相同（四种脱氧核苷酸）表达的基础2.都遵循碱基互补配对原则3.DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构1.基因是控制生物性状的结构与功能单位2.遗传信息的传递都遵循中心法则基因在空间上转移并成功表达3.生物界共用一套遗传密码。（相同的遗传信息在不同的生物体内表达出相同的蛋白质）。DNA（基因）

转录翻译mRNA蛋白质问题探究：

番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭，当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。DNA双螺旋的直径只有2nm，对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。环斑病毒的非转基因木瓜转基因木瓜问题探究：

番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭，当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。DNA双螺旋的直径只有2nm，对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。1.那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？思考·讨论：环斑病毒的非转基因木瓜转基因木瓜“分子运输车”“分子手术刀”“分子缝合针”限制性内切核酸酶（限制酶）DNA连接酶基因进入受体细胞的载体（如质粒）一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”1.限制性内切核酸酶——“分子手术刀”①来源：主要是原核生物TACGGCATGCGCAT5´3´5´3´④作用特点：

能够识别双链DNA分子的特定脱氧核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。②化学本质：蛋白质③种类：数千种（限制酶不是一种酶，而是一类酶）一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”1.你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？2.为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？思考·讨论：

原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。

通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶识别的特定核苷酸序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已被修饰切割外源DNA、使之失效，以保证自身安全一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”2.限制酶的识别序列

大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。思考·讨论：中轴线

限制酶所识别的序列，呈现碱基互补对称。无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线（如图），中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向、对称、重复排列的，称为回文序列。想一想限制酶所识别的序列有什么特点？

Sma

I限制酶只能识别

序列，切割

和

之间的

切开，切割后产生

。一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”3.限制酶的作用结果AGTCATTCGATAGGATCATCATAT

大肠杆菌(E.coli)的EcoRⅠ

限制酶能特异性识别_________序列，并切割___和___之间的____________，切割后产生__________。GAATTCGA磷酸二酯键黏性末端EcoRI限制酶SmaI限制酶CCCGGGCG磷酸二酯键平末端CCCGGGGGGCCCGGGCCCCCCGGG限制酶限制酶一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”知识巩固1.请写出下列限制酶切割形成的黏性末端，并思考同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？提示：同种限制酶产生的黏性末端相同，不同的限制酶切割可能形成相同的黏性末端。一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”4.限制酶的命名

限制酶是用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了三个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。限制酶的命名是根据细菌种类而定，以EcoRI为例:

E：Escherichia

（属名）

co：coli

（种加词）

R：RY13（品系）

I：首先发现在此类细菌中发现的顺序EcoRⅠ：大肠杆菌（Escherichiacoli）R型菌株中分离出的第一个限制酶；SmaⅠ：粘质沙雷氏菌（Serratiamarcescens）中分离出的第一个限制酶。练习：流感嗜血杆菌的d菌株（Haemophilusinfluenzaed）中先后分离到3种限制酶，则分别命名为：

。HindⅠ、HindⅡ、HindⅢ二、DNA连接酶——“分子缝合针”1.DNA连接酶——“分子缝合针”

将双链___________“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_____________。

DNA片段磷酸二酯键①作用：②分类：类型来源功能相同点差别E.coliDNA连接酶T4DNA连接酶大肠杆菌T4噬菌体能连接黏性末端和平末端（效率较低）只能连接黏性末端恢复磷酸二酯键二、DNA连接酶——“分子缝合针”AGTCATTCGATA可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来；E.coliDNA连接酶TCGATC注意：

DNA连接酶可连接双链DNA中的DNA单链缺口，但不能将单个脱氧核苷酸连接到DNA链上！二、DNA连接酶——“分子缝合针”T4DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低CCCGGGGGGCCC二、DNA连接酶——“分子缝合针”解旋酶DNA聚合酶DNA聚合酶游离的脱氧核苷酸5´5´3´3´新合成的子链二、DNA连接酶——“分子缝合针”DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？课堂小结二、DNA连接酶——“分子缝合针”DNA连接酶与DNA聚合酶的比较DNA连接酶DNA聚合酶相同点作用实质化学本质不同点模板作用对象作用结果用途都能催化形成磷酸二酯键都是蛋白质 不需要需要DNA的一条链作模板形成完整的重组DNA分子形成DNA的一条链基因工程DNA复制只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键二、DNA连接酶——“分子缝合针”知识巩固①DNA聚合酶②DNA连接酶③DNA解旋酶④

限制酶下列是有关DNA的各种酶，请选择对应的作用位点：氢键磷酸二酯键TACGGCATGCGC5´3´5´3´几种相关酶的比较课堂小结二、DNA连接酶——“分子缝合针”名称作用部位作用结果限制酶DNA连接酶DNA聚合酶DNA(水解)酶解旋酶磷酸二酯键碱基对之间的氢键将DNA切成两个片段磷酸二酯键将两个DNA片段连接为一个DNA分子磷酸二酯键将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端磷酸二酯键将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链。三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”有标记基因的存在，可用含青霉素的培养基鉴别。能复制，并带着插入的目的基因一起复制质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。1.质粒有切割位点三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”①载体的作用②载体的必要条件③载体的种类：质粒（常用）、噬菌体、动植物病毒等。①能在宿主细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。②有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入其中。④对受体细胞无害，容易分离。③常有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。①作为运载工具，将外源基因导入受体细胞中②在受体细胞内对目的基因进行大量复制1.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。它们的来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别。三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”知识扩展

载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示：标记基因的筛选原理导入受体细胞培养加入氨苄青霉素只有含有载体，并且载体上的抗性基因表达的大肠杆菌才能存活并增殖含有氨苄青霉素抗性基因载体（如质粒）三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”思考·讨论：重组DNA分子

请你根据图3-3中的相关信息找到两条片段上EcoRI

的识别序列和切割位点。然后，用剪刀进行“切割”。待切割位点全部切开后，将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处，并用透明胶条将切口粘连起来。…TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…GCCGTATG……TCCTAG…AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGAATTCCATAC…

GGTATG…GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”思考·讨论：重组DNA分子1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？

剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。

如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对，可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。

不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？…TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…GCCGTATG…GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”思考·讨论：重组DNA分子…TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…GCCGTATG…GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG2.从以上操作可推知，在切割含“目的片段”的DNA分子时，需用限制酶切割____次此DNA分子，产生____个黏性末端。3.目的片段翻转过来，可以连接吗？______4.目的片段可以自身环化吗？_______5.切割目的基因和载体时，需要用______限制酶，目的是____________________24可以可以同种产生相同的黏性末端*必须是同一种限制酶吗？不一定，不同的限制酶切割可能形成相同的黏性末端。三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”知识巩固下列操作中选用哪种限制酶切割来构建重组质粒？1、选目的基因两端和运载体都有的酶切位点；2、所选酶切位点不能破坏目的基因以及标记基因。规律——选择酶切位点的原则：BamHI

和

HindIII①

防止目的基因的自身环化不能用E.coRI的原因②

防止目的基因反向连接到载体图1图2三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”限制酶作用部位：种类E.coliDNA连接酶运载工具条件③

有一个至多个限制酶切割位点质粒、噬菌体、动植物病毒DNA连接酶课堂小结作用部位：切开DNA分子的磷酸二酯键来源：主要存在于原核生物中特点：具有专一性（能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列）T4DNA连接酶①

对受体细胞无害②

能自我复制或整合到宿主DNA上。④

常有特殊的标记基因种类：磷酸二酯键作用结果：产生黏性末端或平末端三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”【概念检测】1.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（）

A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键

B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键

C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键

D.只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端练习与应用教材P742.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是（

）

A.大肠杆菌的质粒

B.切割DNA分子的酶

C