克隆操作中使用的工具酶

关于克隆操作中使用的工具酶第1页，课件共52页，创作于2023年2月第一节基因操作工具酶第2页，课件共52页，创作于2023年2月酶酶限制性核酸内切酶逆转录酶DNA连接酶末端转移酶大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ

S1核酸酶Klenow酶DNA酶Ⅰ

TaqDNA聚合酶RNA酶A多核苷酸激酶碱性磷酸酶基因工程操作中最常用的工具酶第3页，课件共52页，创作于2023年2月主要内容1限制性核酸内切酶2DNA连接酶3DNA聚合酶4修

饰

酶5小结第4页，课件共52页，创作于2023年2月酶主要用途限制性核酸内切酶识别DNA特定序列，切割DNA分子DNA连接酶连接两个DNA分子或片段大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ或Klenow酶1制作DNA探针；2合成cDNA第二链；3填补双链DNA3`凹端；4DNA测序。TaqDNA聚合酶聚合酶链式反应（PCR）多核苷酸激酶多核苷酸5`-OH磷酸化，制末端标记探针末端转移酶使3`-末端加同聚物尾S1核酸酶降解单链DNA或RNADNA酶Ⅰ在双链DNA上产生随机切口RNA酶A降解RNA逆转录酶补平反应，合成cDNA或制探针碱性磷酸酶切除核酸末端磷酸基SUMMARYHome第5页，课件共52页，创作于2023年2月1限制性核酸内切酶1.1引言1.2命名1.3分类1.4活性及影响因素Home第6页，课件共52页，创作于2023年2月核酸酶（Nuclease）：通过切割相邻两个核苷酸残基间磷酸二酯键，导致核酸分子多核苷酸链水解断裂的蛋白酶。（1）按作用对象分:DNAase&RNAase（2）按断裂核酸分子不同方式分：

Endonuclease&Exonuclease1.1引言—两个概念第7页，课件共52页，创作于2023年2月限制性内切核酸酶（restrictionendonuclease):

指一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并在识别序列内或附近特异切割双链DNA的核酸内切酶。限制酶与甲基化酶共同构成细菌的限制-修饰系统（Restriction-ModificationSystem)。Back第8页，课件共52页，创作于2023年2月1.2命名命名原则：第一个字母（大写,斜体）：该酶来源的微生物属名；第二、三个字母（小写、斜体）：微生物种名；若该微生物有不同的变种和品系，再加上该变种和品系的第一个字母（大写）若从同一微生物发现多种限制性内切酶，则依照发现和分离的先后顺序用罗马字母表示。例如：EcoRⅠ从大肠杆菌R株分离的第一种限制酶命名为EcoRⅠ，其中E代表属名（Escherichia)，co代表种名（coli)，R代表株系（RY13），Ⅰ代表该菌株中首次分离到。Back第9页，课件共52页，创作于2023年2月1.3分类1.3.1Ⅰ型限制性内切酶1.3.2

Ⅱ型限制性内切酶1.3.3Ⅲ

型限制性内切酶Back第10页，课件共52页，创作于2023年2月1.3.1Ⅰ型限制性内切酶（1）功能：限制、修饰（2）特点：需辅助因子Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸为；随机切割，切割位点识别位点和不一致，无固定切割位点；（3）应用：不常用。Back第11页，课件共52页，创作于2023年2月1.3.3Ⅲ型限制性内切酶（1）功能：限制、修饰（2）特点：需辅助因子Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸为；特异切割，切割位点在距识别位点3`端24-26bp处。（3）应用：数量很少，无实际作用。Back第12页，课件共52页，创作于2023年2月1.3.2Ⅱ型限制性内切酶（1）功能：识别并特异切割DNA分子。

即通常所指DNA限制性核酸内切酶；（2）特点：仅需辅助因子Mg2+作催化反应；特异切割，能识别双链DNA特殊序列，并产生特异片段；（3）应用：种类繁多，分子克隆中最为常用第13页，课件共52页，创作于2023年2月1.3.2.1基本特性①识别序列：长度：为4-8个核苷酸的特异序列；结构：且许多识别序列具回文结构，如HindⅢ的识别序列：5`AAGCTT3`3`TTCGAA5②切割产生的末端有粘端(cohesive/stickyend)如BamHI(G↓GATCC)和平端(bluntend)如SmaI(CCC↓GGG)第14页，课件共52页，创作于2023年2月EnzymeRecognitionseuqenceEnzymeRecognitionseuqenceBamHIG↓GATCCPstICTGCA↓GBglIIA↓GATCTSalIG↓TCGACEcoRIG↓AATTCSau3AI↓GATCHindIIGTPy↓PuACSfiIGGCCNNNN↓NGGCCHindIIIA↓AGCTTSmaICCC↓GGGKpnIGGTAC↓CXbaIT↓CTAGANotIGC↓GGCCGCXhoIC↓TCGAGRecognitionSequencesandCuttingsitesofRestrictionEndonucleases第15页，课件共52页，创作于2023年2月1.3.2.2同功异源酶(isoschizomer)

定义：来源不同但能识别和切割同一位点的酶。又称同裂酶。如：BamHI和BstI(G↓GATCC)注：有一些同功异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感度有所不同。第16页，课件共52页，创作于2023年2月1.3.2.3同尾酶（isocaudamer)

定义：识别序列不同，但产生相同粘性末端的限制酶。如：BamHI:G↓GATCC

BglII:A↓GATCTBack第17页，课件共52页，创作于2023年2月1.4

活性及影响因素(1)活性大小：酶对DNA水解程度不同。(2)酶的活性单位：

指1μg纯的指定DNA在指定缓冲液中，于37℃（最适温度更准确）1h完全酶解DNA中所有该限制酶识别位点所需的酶量。第18页，课件共52页，创作于2023年2月(3)影响因素①DNA模板的纯度②DNA的甲基化程度③酶切反应温度④DNA的分子结构⑤缓冲液Back第19页，课件共52页，创作于2023年2月2DNA连接酶2.1定义2.2种类及作用机理2.3使用时的注意事项Home第20页，课件共52页，创作于2023年2月2.1定义及功能定义：可使一段DNA3`-OH末端和5`-P末端形成3`,5`-磷酸二酯键，把两DNA片段连在一起封闭双链上形成的切口的酶（DNAligase）。第21页，课件共52页，创作于2023年2月OHP5`3`3`5`5`3`3`5`DNAligaseDNAligase连接缺刻(nick)Back第22页，课件共52页，创作于2023年2月（1）种类:

◆T4DNA连接酶(ATP提供能量）

◆大肠杆菌DNA连接酶（NAD+提供能量）2.2种类及作用机理第23页，课件共52页，创作于2023年2月（2）作用机理：T4DNAligaseBack第24页，课件共52页，创作于2023年2月（1)不能催化两单链DNA分子连接；（2)只能连双链DNA分子的单链缺刻(nick)；不能连接双链中一个或多个核苷酸缺失所致缺口(gap)。2.3使用注意第25页，课件共52页，创作于2023年2月DNAligase的活性Back第26页，课件共52页，创作于2023年2月3DNA聚合酶（DNApolymerase）3.1DNA聚合酶I3.2Klenow聚合酶3.3TaqDNA聚合酶3.4逆转录酶3.5T4DNA聚合酶3.6T7DNA聚合酶Home第27页，课件共52页，创作于2023年2月3.1DNA聚合酶Ⅰ活性：5`→3`聚合活性，5`→3`外切和3`→5`外切活性。发挥生物学活性的条件：（1）DNA模板（可以是单链或双链）（2）带有3`-端游离羟基的引物链（3）底物和激活剂注：对双链DNA，当有dNTP存在时，3`→5`降解活性会被5`→3`方向的聚合活性所抑制。应用：缺口平移法制备DNA分子杂交探针第28页，课件共52页，创作于2023年2月缺口DNaseIDNA聚合酶IDNA聚合酶IdNTP*缺口缺口平移法制备DNA分子探针Back第29页，课件共52页，创作于2023年2月活性：5`→3`聚合活性，3`→5`外切酶活性。无5`→3`外切酶活性。用途：（1）填补或标记DNA的3`隐蔽末端；（2）催化合成cDNA第二链；（3）DNA序列测定3.2Klenow聚合酶第30页，课件共52页，创作于2023年2月EcoRI酶切末端同位素标记的EcoRI酶切末端α-32P-dATPBack第31页，课件共52页，创作于2023年2月（1）显著特点：热稳定性。70℃反应2h残留活性90%；93℃反应2h残留活性60%；94℃反应2h残留活性40%。（2）应用：

①特定DNA片段的体外扩增；②DNA测序。3.3TaqDNA聚合酶Back第32页，课件共52页，创作于2023年2月（1）定义：RNA指导下的DNA聚合酶(reversetranscriptase)。（2）活性：5`→3`聚合酶活性和RNaseH活性。聚合作用所需模板可以是RNA或DNA，引物是带3`-OH的RNA或DNA。3.4逆转录酶第33页，课件共52页，创作于2023年2月逆转录酶的活性第34页，课件共52页，创作于2023年2月（3）用途①在体外以mRNA为模板合成cDNA；②对有5`突出末端的DNA片段作末端标记或补平；③双脱氧法测序；④以DNA或RNA为模板合成核酸探针。Back第35页，课件共52页，创作于2023年2月（1）活性：

5`→3`聚合酶活性和3`→5`外切酶活性。注意：3`→5`外切酶活性对单链DNA的作用比对双链DNA强；高浓度dNTP环竟下前者活性更强。（2）应用：标记DNA平末端或隐蔽3`末端3.5T4DNA聚合酶Back第36页，课件共52页，创作于2023年2月（1）活性：5`→3`聚合酶活性；有单链及双链的3`→5`外切酶活性。但无5`→3`外切酶活性；（2）特点：极佳的连续合成能力（3）应用：①长DNA片段体外扩增；②通过单纯延伸或取代合成途径标记DNA3`末端；③补平：使双链DNA5`或3`突出末端变平末端。3.6T7DNA聚合酶Back第37页，课件共52页，创作于2023年2月4修饰酶4.1碱性磷酸酶4.2末端转移酶4.3T4多核苷酸激酶4.4S1核酸酶

Home第38页，课件共52页，创作于2023年2月4.1碱性磷酸酶（1）功能：催化核酸脱5`-磷酸基团，使DNA或RNA片段5`-P末端转换成5`-OH末端。（2）来源：大肠杆菌：

bacterialalkalinephosphatase(BAP);小牛肠道:

calfintestinalalkalinephosphatase

(CIP)。第39页，课件共52页，创作于2023年2月碱性磷酸酶的活性第40页，课件共52页，创作于2023年2月注意：CIP的比活性比BAP高出10-20倍，且CIP在SDS中68℃就可完全失活，而BAP却是热抗性酶。Back第41页，课件共52页，创作于2023年2月（1）来源:

前淋巴细胞和分化早期的类淋巴细胞。（2）功能：催化DNA进行5`→3`方向的聚合作用,逐个将dNTP分子加到线性DNA分子3`-OH端。4.2末端转移酶(terminaltransferase)第42页，课件共52页，创作于2023年2月末端转移酶的催化作用第43页，课件共52页，创作于2023年2月（3）用途：①给外源DNA片段和及载体加互补同聚物尾巴；②标记DNA片段的3`末端。Back第44