RNA转录后的剪接与加工

第五章RNA转录后的剪接与加工5.1概述真核生物基因的表达在时间和空间上存在明显的间隔，ＲＮＡ转录在细胞核内进行，而翻译则在细胞质内完成，因此不能像原核细胞那样几乎同步同时地进行。RNAprocessing5’端加帽３’端形成polyA内含子的去除与外显子的连接链的断裂核苷酸修饰糖苷键的改变RNA编辑5.2原核生物rRNA的转录加工rrnA-rrnGm4CmN4,2’-O-二甲基胞苷5.3原核生物tRNA前体的加工1.tRNA前体分子的形式：不同的tRNA串联排列多个相同tRNA串联排列tRNA与rRNA混合串联排列2.tRNA前体的加工修饰内切核酸酶使tRNA分子５’端成熟RNA外切酶使tRNA分子３’端成熟在tRNA分子３’端添加CCAOH核苷酸的修饰与异构化①tRNA分子３’端成熟A.参与的酶：RNaseP﹑RNaseF﹑RNaseD﹑RNaseBN﹑

RNaseT﹑RNasePH﹑RNaseⅡ﹑polynucleotidePNPase

B.步骤RNaseP将tRNA前体分子水解，但是水解后的片段的3’端与5’端端仍还有额外的核苷酸RNaseF从靠近3’端处水解切割，对tRNA前体3’端逐步加工RNaseD从前体3’端再逐个切除附加序列，修剪tRNA的3’端在tRNA核苷酰转移酶的作用下添加3’端CCA②tRNA分子5’端成熟由RNaseP催化切除5’端额外核苷酸。该酶是一种核糖核蛋白，由两个亚基组成，大亚基是分子量约为125kDa

的RNA,另外一个为分子量为14kDa的蛋白质。5.4原核生物mRNA前体的加工5.5真核生物RNA的转录后加工（一）剪接方式的分类①

第一类：自我剪接内含子,又可分为Ⅰ型和Ⅱ型内含子②第二类：需蛋白质（酶）参与剪接的内含子③第三类：依赖snRNP剪接的内含子（二）真核生物tRNA前体的转录后加工1.结构特点及加工概述A.与原核生物的差异①

基因组内的tRNA基因成簇排列,各基因间有一定间隔,tRNA前体是单顺反子,且各个tRNA可作为独立的转录单位②tRNA基因数目比原核生物多③tRNA基因有内含子,需经过剪接加工B.特点长度和序列没有共同性,一般有16~46个核苷酸位于反密码子的下游内含子和外显子间的边界没有保守序列,因此tRNA前体的剪接方式不符合一般规律,需要RNase的参与

tRNA分子的二级结构：氨基酸受体臂、D环、TψC环和反密码环2.加工过程内含子的剪接tRNA前体分子中内含子的切除,两个tRNA半分子的连接3’端添加CCA：在tRNA核苷酸转移酶（tRNAnucleotidetransferase）催化下进行3’端添加,由CTP和ATP提供胞苷酸和腺苷酸核苷酸修饰

:甲基化酶、异戊烯转移酶、鸟嘌呤转糖苷酶、硫转移酶（三）真核生物rRNA前体的转录后加工1.结构组成与特点小亚基:16～18SrRNA大亚基:26～28SrRNA

、5SrRNA

和5.8SrRNA

基因拷贝数多,在基因组内成簇排列,成串重复数百次集中在核仁内,并由转录区（transcribedspacer）与非转录区（non-transcribedspacer,NTS）交替排列2.rRNA前体加工的基本步骤5’端非编码序列的切除,41S中间产物的生成41S的RNA被切割成32S（２８

S和5.8S）与20S（18S）两段32S被剪切成２８

S和5.8S，并且部分序列互补配对20S被剪切成18S

切割位点如何确定①核仁小分子RNA（smallnucleolarRNA,snoRNA）参与核糖核酸酶对特定立体结构的识别②rRNA前体分子的甲基化3.snoRNA的结构与功能①

结构特点a.BoxC框/D框，C框的序列为AUGAUGA,D框为CUGA,可借助互补序列识别rRNA前体中甲基化和切割的位点b.BoxH/ACA,H框为ANANNA，能识别假尿苷酸化位点②功能与蛋白质结合成snoRNP参与rRNA前体的加工boxC/D具有互补序列，是指导rRNA中2’-O-核糖的甲基化修饰系统，boxC参与甲基的转移反应boxH/ACA能形成茎环二级结构，与rRNA特定序列互补(四)真核生物mRNA前体的加工1.5’端的帽子结构及加工步骤核苷酸磷酸水解酶从生长着的RNA5’端切去5’端γ磷酸基团鸟苷酸7-甲基转移酶催化一分子游离GTP中的GMP攻击5’端第二个磷酸，形成5’

，5’-三磷酸的连接，阻塞了RNA的5’端2’-O-甲基转移酶催化S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl

methionine,AdoMet）的甲基基团转移到cap-0帽子结构鸟嘌呤的N7位另外一分子甲酰基转移酶催化将另一分子的AdoMet连接到从5’端的第二个核苷酸cap-1的2-OH’上，使之甲基化继续由甲酰基转移酶催化随后的cap-2的2-OH’甲基化及嘌呤核苷酸N7位甲基化，形成不同的帽子结构2.5’端帽子结构的功能对mRNA的保护作用，是mRNA免受核苷酸酶从5’端开始的降解使mRNA具有可翻译能力（translatability）有利于成熟mRNA从细胞核输送到细胞质3.mRNA3’端的多聚腺苷酸化(polyadenylation)保护mRNA，提高mRNA在细胞质中的稳定性能增强mRNA的可翻译能力，在真核细胞的mRNA翻译过程中，有一种能结合在polyA上的蛋白质称为polyA结合蛋白I（polyA-bingdingproteinI,PABI）,当PABI结合在polyA时，mRNA的翻译从效率大大增强4.

核内不均一RNA

①

概述核内不均一RNA(heterogeneousnuclearRNA,hnRNA)的碱基组成与总DNA组成类似，所以又称为类似DNA的RNA(D-DNA)②与mRNA的关系a.有相同的序列b.在体外能作翻译模板，与mRNA有相同功能c.两者的5’端都有帽子结构，3’端有polyAd.两者的转录合成都可以被高剂量放线菌素D抑制

③

hnRNA的结构特点5’端有帽子结构(5’-cap)3’端有polyA+结构帽子结构的下游3个寡聚U区，长度约30nt寡聚U区下游有重复序列茎环结构分布于编码区的两侧编码区为非重复结构，含有内含子④

hnRNA的加工过程a.5’端形成特殊的帽子结构(m7G5’ppp5’N1mpN2p-)b.修剪链的3’端，并加上polyAc.通过剪接除去由内含子转录而来的序列d.RNA链内的核苷酸被甲基化5.mRNA前体加工的简要过程①

mRNA前体中内含子的结构特点a.两端边界有共同序列，这些序列是mRNA前体的剪接信号b.与第一类II型内含子剪接有些类似，必须形成套索结构（lariat）,区别在于真核生物的mRNA的剪接要求形成剪接体②

剪接体剪接的简要过程a.在内含子的5’切断，通过5’、2’键将内含子5’-G与分支点A残基的2’为连接成套索结构b.在内含子的3’端剪接位点，外显子1与外显子2连接，内含子以套索形式被释放6.真核生物mRNA前体的剪接机制①

snRNP:由U1、U2、U4、U5&U6snRNP组成a.U1

snRNP:8中蛋白质与1种RNA链b.

U2

snRNP:能与内含子的分支点共同序列互补，另外还与U6

snRNP碱基配对，协助snRNA在剪接体上定向c.

U4

snRNP:与U6snRNP偶联形成配对的茎I和茎II，当剪接体装配时，U4与U6解离开后发挥作用。U4主要是结合U6直到在剪接需要U6时才释放它，使之参与5’端剪接d.U5snRNP

:与其它snRNA或剪接底物pre-mRNA的保守区无明显的互补，但它的确同pre-mRNA的5’和3’端剪接位点有相互作用e.U6

snRNP与内含子5’端剪接区域配对②

剪接体（spliceosome)a.概念

:

mRNA前体在剪接过程中组装形成的多组分复合物，主要是由细胞核内小分子RNA和蛋白质组成b.组成:

每种都含有1-2种snRNA和数种蛋白质因子③

剪接体的组装与循环a.组成snRNP非snRNPSR蛋白SR相关蛋白:Tra、Tra2、U2AFb.步骤早期剪接复合体的形成前剪接复合体的组装过渡复合物的形成剪接体内结构重排剪接产物的形成mRNA剪接产物和内含子的释放Step1.早期剪接复合体的形成U1snRNP结合到pre-mRNA的5’端剪接点上剪接因子(splicingfactorI)又称BBP(branchpointbindingprotein)结合到分支点上U2snRNP的辅助因子U2AF(U2auxiliaryfactor)的65kDa和35kDa两个亚基分别结合到分支点和3’剪接位点的AG碱基上在SR蛋白作用下，已经结合在5’剪接位点的U1snRNP和结合在3’剪接位点的SR/U2AF相互靠近，形成早期剪接复合物（earlyspliceosomecomplex)Step2.前剪接复合体的组装在U2辅助因子U2AF协助下，U2snRNP与内含子的分支点结合ATP水解释放能量使内含子180°弯曲U1snRNP和U2snRNP两种复合物相互作用，使内含子５’端和3’端靠近SR蛋白协助U1snRNP和U2AF结合，使早期剪接复合体组建成跨越内含子复合物，即前剪接体复合物(pre-spliceosomecomplex)Step3过渡态复合物的形成U4/U6和U5snRNP开始参与，使得U6内部序列和U4的5’端互补，前剪接体与U4snRNP、U5snRNP和U6snRNP的三聚体结合U4与U6解离，U6在5’端剪接位点由ATP激活取代U1，使得U4离开前剪接复合体，同时在ATP的激活下，U1离开前剪接体复合物，形成过渡态复合物Step4剪接体内的结构重排在ATP激活下，U6与结合于分支点序列的U2snRNP的5’端序列互补U1离开5’端剪接位点后，U5能够与两个外显子的剪接位点互补，使剪接体内发生结构重排，从而形成有利于催化剪接反应的构象Step5

形成剪接产物并释放在剪接体被激活的情况下，形成剪接产物释放mRNA剪接产物和内含子U5snRNP环通过外显子1和外显子2接触，使两个剪接位点在空间上靠近，由于它能引导其它RNA区域到剪接体的适当位置，以催化剪接功能的发挥，故又将U5snRNP环称为导向RNAb.U2snRNP与内含子的分支点形成螺旋区域，分支点A周围的碱基对使A突出，该结构为II型内含子的一种核酶（ribozyme)结构，是催化剪接的活性中心c.剪接体组装过程中的重排反应内含子5’端剪接点与U1snRNP的相互作用转变为与U6snRNP间的相互作用U2snRNP与分支点相互作用代替了在分支点上结合蛋白BBP与分支点的相互作用U2snRNP分子内部发生重排，形成茎-环构象的活化U4/U6之间RNA配对形成的茎II结构被破坏，U6snRNP在其3’端形成分子内的茎-环结构U4/U6茎I区配对被破坏，使游离的U6snRNP与U2snRNP相互作用，而形成U2/U6螺旋IU2snRNP的5’茎-环结构被破坏使其5’端游离，并与U6相应部分作用形成U2/U6螺旋II

至此，前剪接体转变为成熟的剪接体，剪接催化反应通过U4的释放启动，ATP水解供能7.mRNA前体剪接中的转酯反应概述:在成熟剪接体上完成剪接反应实际上是磷酸二酯键的转移，又称为转酯反(transesterification)①

第一次转酯反应②

第二次转酯反应第二次剪接反应是外显子1的3’端对内含子3’端剪接点进行亲核进攻，U5snRNA在反应中起着排布外显子的功能，使5’端外显子移动、定位，然后在外显子I和II粗发生第二次转酯反应，形成5’，

3’-磷酸二酯键，产生两个外