氨基酸菌种扩大培养及菌种保藏技术

氨基酸菌种扩大培养及菌种保藏技术1工业微生物菌种的来源自然界中有目的微生物分离的原则菌种选育、分子育种工业微生物的要求常用工业微生物菌种保藏菌种来源诱变育种：诱变是工业发酵稳产高产的重要保证；从自然界分离：目前土壤中已分离的微生物不到总数的1%，微生物的多样性仍然是以后若干年的研究重点；

基因重组：基因定向改造技术大大加快了生物产品开发的进程。从自然界中分离菌种的一般过程采样→预处理→培养→菌落的选择→产品的鉴定

(1)待改良性状的本质及与发酵工艺的关系

(2)对这一特定菌种的遗传生化的认识程度

(3)经济费用如果对特定菌种的基本性状及其工艺知晓甚少，则多半采用随机诱变、筛选及选育等技术：如果对其遗传及生物化学方面的性状已有较深的认识，则可选择基因重组等手段进行定向育种。选择育种方法时综合考虑的因素一些常用工业微生物抗生素生产有关的微生物放线菌（链霉素四环素；红霉素等）真菌（青霉素、头孢等）一些产芽孢的细菌植物或动物来源氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚，代谢途径比较简单谷氨酸发酵的菌种：其它氨基酸生产菌：棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌氨基酸生产有关的微生物食品工业微生物包括：酿造业，酶制剂等食品用的微生物需经过严格的毒理试验，目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌和地衣牙孢杆菌

能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物

有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操作性要强

遗传性能要相对稳定

不易感染它种微生物或噬菌体

产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）

生产特性要符合工艺要求工业微生物的要求工业微生物菌种保藏技术

(1)低温冷冻保藏；(2)转接培养或斜面传代保藏；(3)矿物油保藏；(4)土壤或陶瓷珠等载体干燥保藏。保藏原理：创造休眠环境保藏要求：保持菌种优良特性，经济方便 保藏后需再次检测和确定保藏菌种的形态学和生化特征(如代谢产物的产生、酶活力、遗传特征及生化指标)。冷冻保藏：-20℃以下冷冻，使微生物代谢活动停止分类：普通冷冻保藏(-20℃)

超低温冷冻保藏(-60一-80℃)

液氮冷冻保藏冻干保藏特点：简单有效培养物运输较困难冻干保藏：是通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使培养物干燥。此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一。特点：冻干状态下一般可保藏10年不丧失活力冻干后的菌株可常温保存，便于运输必须使用冷冻保护剂，常用脱脂乳、蔗糖等在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是：1．离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞2．用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞；3．加入等体积的20％甘油或10％二甲亚砜；4．混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70℃超低温冰箱中保藏。 超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1-2℃／min。一些细菌和真菌菌种可保藏5年而活力不受影响。传代保藏：斜面培养基，平行传代，普通冰箱，三个月以下保存，供试验用矿物油保藏：将琼脂斜面或液体培养物浸入矿物油中于室温下保藏，简便有效，可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。特别用于难以冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌载体保藏：麦壳，砂土灭菌后可用作载体防止菌种衰退衰退的表现：生长，代谢（产品）衰退的原因：保藏不妥，不利环境，回复突变等防止衰退的方法：合理培养条件，减少传代次数复壮：分离单细胞，抗性筛选，苛刻条件种子：将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。2种子扩大培养种子扩培的目的接种量的需要菌种的驯化缩短发酵时间、保证生产水平种子的要求：总量及浓度能满足要求生理状况稳定，个体与群体活力强，移种至发酵后，能够迅速生长无杂菌污染实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此将其称为实验室阶段的种子培养。培养基：保证培养基的质量，有利于菌体的生长减少传代次数孢子培养时注意湿度，子斜面使用一般不超过1个月生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工厂归发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。

培养基：控制成本，驯化；营养比发酵培养基丰富。种子扩培的两个阶段2.1工业微生物培养方法静置培养法：嫌气发酵，如酒精、丙酮、丁醇、乳酸等通气培养法深层浅层固体液体液体固体工业微生物常见培养方法及其特点解释特点适用范围固体培养即曲法培养，源于传统制曲技术酶活力高可调温湿度酿造业液体深层培养液体培养，深层通风可调节各种环境因素：营养物浓度，温湿度等；无菌操作要求高几乎所有好气发酵：如有机酸、氨基酸等载体培养可重复使用的多孔材料，严格控制营养条件，结束后挤压培养液抽提产物兼具固体培养法与液体培养法的优点可培养霉菌、酵母、放线菌等两步法液体深层培养将营养生长期与生产期分开，分别控制不同条件工艺可达到最优过程繁琐氨基酸生产2.2影响种子质量的因素培养基秧龄与接种量温度pH值通气与搅拌泡沫染菌的控制种子罐级数种子的质量要求：一定的浓度形态（生长处于某个阶段、均匀等等）理化指标：C、N、P的含量，pH，酶活等无污染2.3种子扩大培养举例例一、谷氨酸生产的种子制备斜面菌种→一级种子培养→二级种子培养→发酵1、斜面(AS1.299)培养基：蛋白胨1%，牛肉膏1%，氯化钠0.5

琼脂2%，pH7.0-7.2培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细培养条件：32℃，生长18-24小时生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过

3次2.一级种子（摇瓶）培养条件：于1000ml三角瓶中，装液200-250ml,32℃培养12小时。培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆2.5%，

K2HPO40.1%培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基本接近于发酵培养基3.二级种子(种子罐)培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%），

32℃培养7-10个小时培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，浓度为2.5%培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基种子的质量要求：108-109个/ml大小均匀，呈单个或八字排列PH7.0-7.2时结束，6.8→8→7.0-7.2活力旺盛二、青霉素生产的种子制备安培管→斜面孢子→大米孢子→一级种子→二级种子→发酵一、斜面孢子培养基：甘油、葡萄糖、蛋白胨等培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细培养条件：25℃、7天,注意湿度50%左右二、大米孢子培养基：大米及氮源（玉米浆）培养基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表面积和氧的传质，营养适当（要求大米的白点小）有利于孢子的生长。培养条件：25℃、7天，控制湿度大米孢子的要求：1粒米含1.4*106个孢子3、一级种子培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆目的：长菌体培养条件：27℃，40小时接种量：200亿孢子/吨4、二级种子培养基：同上培养条件：27℃、10-14小时接种量：10%种子的质量要求菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于Ⅲ—Ⅳ期青霉素发酵菌丝体的生长共分为6个期，1-4为年青期，4-6期合成青霉素的能力最强种龄种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较大，但是最终由实验结果定。接种量的确定

移入种子的体积接种量＝—————————

接种后培养液的体积过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为7-15%。但是一般认为大一点好。双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。发酵级数的确定一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有