中药中黄曲霉毒素的检测

关于中药中黄曲霉毒素的检测第1页，课件共39页，创作于2023年2月目录真菌毒素简介黄曲霉毒素概述黄曲霉毒素现有检测方法介绍黄曲霉毒素检测药典收载情况药典检测方法详解注意事项及实验室建议第2页，课件共39页，创作于2023年2月真菌毒素简介真菌毒素：由产毒真菌在适宜的环境条件下产生的有毒代谢产物，由真菌菌核产生。Mycotoxin：源于希腊语（Mykes）和拉丁语（Toxicum）第3页，课件共39页，创作于2023年2月常见真菌毒素分类真菌种类所产毒素曲霉属黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A镰刀菌属玉米赤霉烯酮、T-2毒素、呕吐毒素、伏马毒素青霉属展青霉素、桔青霉素第4页，课件共39页，创作于2023年2月真菌毒素监控意义真菌毒素对食品安全的危害真菌毒素对种、养殖业的危害真菌毒素对制药行业的危害（中药）国际贸易中作为技术壁垒在国际反恐和战争中，真菌毒素可作为大规模杀伤性生化武器第5页，课件共39页，创作于2023年2月黄曲霉毒素概述黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉等菌种产生的次生代谢产物第6页，课件共39页，创作于2023年2月黄曲霉毒素的发现1960年，在英国东南部一些农场中，有大约10万只火鸡不明原由地突然死亡。1961年发现火鸡饲料中混有的花生粉能够使大鼠诱发肝癌。1962年，研究发现花生粉中含有一种荧光物质是导致。火鸡死亡的病因，这种荧光物质被证实为黄曲霉的代谢产物，故命名为“黄曲霉毒素(Aflatoxins)”。第7页，课件共39页，创作于2023年2月存在极其广泛主要存在于土壤，动植物及各种坚果中。家庭自制发酵食品等也经常发现黄曲霉毒素。一般在热带和亚热带地区，食品中黄曲霉毒素的检出率比较高。未能及时晒干或储藏不当的粮食容易产生，在农作物正常的生长期中也可以形成。第8页，课件共39页，创作于2023年2月毒性极强1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构（IARC）划定为Ⅰ类致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质，仅次肉毒毒素，是目前已知霉菌中毒性最强的。急性毒性：比氰化钾大10倍，比砒霜大68倍慢性毒性：肝脏损害，呈急性肝炎、出血性坏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生。脾脏和胰脏也有轻度的病变。第9页，课件共39页，创作于2023年2月中药中容易产生黄曲霉毒素的品种种子、果实、粮谷类中药材发酵类中药材动物类中药材油性成分多的中药材含上述种类药材的中成药第10页，课件共39页，创作于2023年2月黄曲霉毒素的种类及性质根据在紫外线照射下产生荧光颜色的不同，分为B族和G族两大类及其衍生物B族G族蓝色荧光黄绿色荧光第11页，课件共39页，创作于2023年2月化学结构基本结构：是一组化学结构类似的二呋喃香豆素的衍生化合物目前发现约20余种，已分离鉴定出12种：B1、B2、G1、G2、M1、M2、P1、Q、H1、GM、B2a和毒醇。B1：最常见、毒性及致癌性最强第12页，课件共39页，创作于2023年2月化学结构式第13页，课件共39页，创作于2023年2月理化性质黄曲霉毒素相对分子量312～346难溶于水，易溶于油、甲醇、丙酮和氯仿等有机溶剂，但不溶于石油醚、己烷和乙醚在中性及酸性溶液中较稳定，但在pH为1～3的强酸性溶液中稍有分解，在pH为9～10的碱性溶液中分解迅速第14页，课件共39页，创作于2023年2月纯品为无色结晶耐高温，黄曲霉毒素B1的分解温度为268℃紫外线对低浓度黄曲霉毒素有一定的破坏性第15页，课件共39页，创作于2023年2月黄曲霉毒素现有检测方法介绍薄层层析法：灵敏度低，定量困难HPLC-紫外检测法：不衍生，灵敏度低，采用UPLC可以增强灵敏度HPLC-荧光检测法：需衍生，灵敏度高高效液相色谱-串联质谱法：不需衍生，灵敏度高，假阳性少，成本高第16页，课件共39页，创作于2023年2月免疫化学分析方法

•酶联免疫吸附法：快速、简便、单一毒素、假阳多

•免疫亲和柱-荧光分光光度法：高效、无毒、假阳多

•微柱筛选法：半定量，测总量

•一步式黄曲霉毒素检测金标试纸法：快速、现场大批量初筛第17页，课件共39页，创作于2023年2月黄曲霉毒素检测药典收载情况2005年增补本附录

第一次增加了黄曲霉毒素测定法2010年版一部

•正文：僵蚕、陈皮、酸枣仁、桃仁、胖大海品种项下增加了黄曲霉毒素残留量检查

•附录：继续收载了黄曲霉毒素测定法第18页，课件共39页，创作于2023年2月2010年版一部第二增补本修订了附录方法•删除了流速规定•增订了另一种衍生方法：即光化学衍生法•取消了免疫亲和柱的品牌规定2015年版四部通则2351黄曲霉毒素测定法•增加了第二法：高效液相色谱-串联质谱法•增加附注：“当测定结果超出限度时，采用第二法进行确认”第19页，课件共39页，创作于2023年2月2015年版四部通则增加中药中真菌毒素测定指导原则•基本原则（中药中真菌毒素的分类、监控品种、测定方法、限值拟定）•基本内容（高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用法）第20页，课件共39页，创作于2023年2月2015年版四部通则9302中药有害残留物限量制定指导原则中关于黄曲霉毒素的规定“由于黄曲霉毒素毒性强，目前国际上不建议设定黄曲霉毒素的安全耐受量和无毒作用剂量，也无最大限量理论值计算公式，限量越低越好”。第21页，课件共39页，创作于2023年2月《中国药典》2015年版正文收载品种根及根茎类：远志果实种子类：大枣、肉豆蔻、决明子、麦芽、陈皮、使君子、柏子仁、胖大海、莲子、桃仁、槟郎、酸枣仁、薏苡仁动物类：僵蚕、水蛭、地龙、全蝎、蜈蚣共19种，较2010年版药典增加14种第22页，课件共39页，创作于2023年2月黄曲霉毒素药典检测方法详解液相条件：C18，甲醇-乙腈-水（40:18:42）衍生方式：柱后碘衍生、柱后光化学衍生混合对照品溶液的制备：液体标液（B1\B2\G1\G2=1\0.3\1\0.3ug/ml）梯度稀释500倍第23页，课件共39页，创作于2023年2月供试品溶液的制备：15g粉末，3gNaCl，70%甲醇提取，免疫亲和柱纯化测定：吸取混合对照品溶液5μl、10μl、15μl、20μl、25μl，注入色谱仪，绘制标准曲线。吸取供试品溶液20-25μl，测定第24页，课件共39页，创作于2023年2月方法来源：《中国药典》2015年版四部通则2351黄曲霉毒素测定法基本步骤•提取

•净化（活化、上样、洗杂、洗脱）

•测定

•随行质量控制（质控样、随行加样回收）第25页，课件共39页，创作于2023年2月泵流操作架免疫亲和柱HPLC-荧光检测器光化学衍生器自动固相萃取仪第26页，课件共39页，创作于2023年2月净化步骤取15ml（离心后的提取液），加水至50ml滤过，取20ml，通过免疫亲和柱，流速3ml/min加水洗涤两次，每次10ml过空气10秒，将水挤出柱子分次加甲醇1.5ml，自然洗脱，过空气，定容至2ml第27页，课件共39页，创作于2023年2月免疫亲和柱的原理利用抗原－抗体免疫反应的原理，使用大剂量的单克隆抗体，选择性的将样品提取液中的黄曲霉毒素吸附，用水将杂质洗脱除去，再用甲醇定量将黄曲霉毒素洗脱，达到分离净化目的黄曲霉毒素单克隆抗体杂质第28页，课件共39页，创作于2023年2月黄曲霉毒素的衍生化衍生原因

黄曲霉毒素B1、G1荧光遇水要淬灭，检测前需要衍生化第29页，课件共39页，创作于2023年2月药典附录收载的两种衍生方法

•碘衍生法：碘作为衍生剂，对衍生温度有要求，试剂对仪器有腐蚀性，需要冲洗

•光化学衍生法：紫外光灯（254nm）照射，操作简单，对衍生温度无要求，不需要其他衍生剂，无需冲洗对黄曲霉毒素B1和G1进行衍生，黄曲霉毒素B2和G2不受该衍生步骤的影响第30页，课件共39页，创作于2023年2月AFB1AFG1黄曲霉毒素的衍生化第31页，课件共39页，创作于2023年2月黄曲霉毒素的衍生化第32页，课件共39页，创作于2023年2月结果报告低于检测限（标出检测限）

报告具体值

未检出限度内限度外报告具体值第33页，课件共39页，创作于2023年2月方法难点痕量分析——ppb级，要求高灵敏度毒性强，具有一定的风险性——安全防护措施基质复杂第34页，课件共39页，创作于2023年2月注意事项取样的代表性

黄曲霉毒素在样品中分布不均匀免疫亲和柱的使用

储存、使用温度（使用说明书）安全防护

操作人员专门培训，全程穿工作服佩戴手套注意事项及实验室建议第35页，课件共39页，创作于2023年2月对照品的使用使用黄曲霉毒素混合对照品，不使用黄曲霉毒素固体纯品自行配置

对照品贮备液避光、低温、密闭保存，工作液现配现用第36页，课件共39页，创作于2023年