质粒提取14级dna的和rflp1022jxx

姜晓星2015-10-22质粒DNA的制备质粒

染色体外能够进行自主复制的遗传单位现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子△在基因工程中质粒常被用做基因的载体质粒的特性分子量相对小（小于15kb）双链环状共价闭合分子含有高效自主复制成分不相容性（incompatibility）：有些质粒不能共存于一个细菌转移性选择的标记（selectivemarkers)限制性内切酶单一切口相同点（质粒）不同点1、均携带遗传信息2、可自主复制1、并非细菌生存所必须2、可通过传递的方式获得3、可自行失去或人工消除染色体DNA质粒DNA

分离质粒DNA基本步骤

1、培养细菌使质粒扩增

2、收集和裂解细菌3、分离和纯化质粒DNA1、细菌培养物的生长

琼脂平板上挑取一个单菌落（单克隆）培养物中（含有适当抗生素）37℃增菌2、细菌的收获和裂解收集：离心质粒DNA的小量制备2-5ml

质粒DNA的大量制备500ml

裂解：

碱变性裂解法（说明质粒抗碱打击力强）煮沸裂解法去污剂裂解法

煮沸裂解法

利用溶菌酶和TritonX-100破坏细胞壁，在将裂解液煮沸原理：加热可使蛋白质和染色体DNA变性，但环状质粒DNA结构紧密而不会解链，温度下降后，质粒DNA又重新恢复超螺旋结构。通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA，回收上清液中质粒DNA

煮沸裂解法比较剧烈，只用于提取小质粒。对于会释放出大量糖类的菌株不适宜

SDS裂解法

比较温和的抽提方法。将细菌悬浮在等渗的蔗糖溶液中，以溶菌酶和EDTA裂解酚-氯仿抽提适合于大于15kb的质粒DNA的抽提，但产率不高碱变性法抽提质粒DNA[原理]

基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的在pHl2.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环(CC)质粒DNA仍为自然状态pH=12.6pH中性染色体DNA氢键断裂，双螺旋解开，变性不能复性，沉淀质粒DNA氢键断裂，闭合环状的互补链不完全分离复性，可溶[试剂]溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖

增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械切力作用而降解10mmol/LEDTA

螯合Mg2+、Ca2+等金属离子，抑制DNase对DNA的降解作用25mmol/LTrisHClpH8.0

不存在金属离子的干扰溶液Ⅱ（制造碱性环境）：200mmol/LNaOH（必须新鲜配置，否则会结合空气中的二氧化碳，形成碳酸氢钠）pH＞12引起双链间氢键的断裂1%SDS①溶解细胞膜上的脂质与蛋白；②解聚细胞中的核蛋白；③使蛋白变性而沉淀；④抑制核酸酶活性溶液ⅢpH4.8KAc（醋酸钾）缓冲液

①将pH12.6的抽提液调至中性，使变性的DNA能够复性②高盐有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS蛋白复合物凝聚而沉淀其他试剂TE缓冲液苯酚：氯仿1×LB溶液100μg/ml氨苄青霉素对数期菌体溶液III中和溶液I充分重悬裂解溶液II变性上清液抽提离心洗涤乙醇沉淀干燥溶解沉淀质粒DNA溶液碱裂解法流程图实验步骤1.取液体培养菌液1.5ml置塑料离心管中，10000r/min离心lmin，去掉上清液（吸取，不要倒）。加入150μl溶液I，充分混匀（用枪打匀），在室温下放置10min2.加入200μl新配制的溶液II，加盖后温和颠倒5～10次，使之混匀，冰上放置2min（不能长时间变形）3.加入150μl冰冷的溶液III，加盖后温和颠倒5～

10次，使之混匀，冰上放置10min（充分反应）4.用台式高速离心机，10000r/min离心5min，将上清液移入干净的离心管中（要记下上清体积，为下步准备）[器材][操作]详见实验指导

质粒DNA的酶切鉴定

限制性内切酶

RestrictionEnzyme，RE

主要从原核细胞中分离获得的一类能识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列并水解的酶从核酸分子链内部切断核酸链，故称内切酶限制性内切酶是基因技术中不可缺少的工具II型酶（最常用）

通常指DNA限制性内切酶

II型限制酶分子量小仅需Mg2＋作为催化反应辅助因子能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的DNA片段因而在基因重组、DNA序列分析、基因组甲基化分析及基因物理图谱等技术中广泛应用命名：（按酶来源的微生物学名）

1、取属名的第一个大写字母种名的前两个小写字母

2、同种内有不同的株系加于基本名后

3、罗马数字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ来表示一株具有不同特异性的酶基本名

H

in

d

Ⅲ属名Haemophilus种名influenzae株d种类ⅠⅡⅢ流感嗜血杆菌中酶的命名

Ⅱ型内切酶的特点识别特定的核苷酸序列，并在核苷酸的特定部位切开核酸链识别的序列一般为4～6个核苷酸碱基对，且呈二重对称的特异序列，称为回文序列(palindrome)如：HindⅢ

-AAGCTT--TTCGAA-酶切的形式：1、平端切口

在两段互补链对称处的两个碱基间切断磷酸二脂键，产生没有单链片断的平端2、3’端粘性末端

错位切割，并偏向3’端，使3’端出现凸出的单链序列，称为3’端粘性末端

3、5

’端粘性末端

错位切割，并偏向5’端，使5’端出现凸出的单链序列，称为5’端粘性末端5’粘性末端3’粘性末端平端切口4、估算RE识别序列在DNA上出现的频率识别序列的频率=(1/4)N

HaeIII(4bp)=(1/4)4256bp

EcoRI、PstI(6bp)=(1/4)64096bp

NotI(8bp)=(1/4)865536bp(rarecutters)

仅是理论推测酶切反应实验注意事项1、酶切反应一般在20μl或更小的体积中进行，内含0.2～1μgDNA2、酶切时间一般为1～3小时3、酶切温度一般为37℃4、酶切pH值一般为7.5～8.0

（1）限制酶在50%的甘油中保存于-20℃时较稳定（2）在冰箱外放置时间尽可能缩短（3）每次取酶时应换一个无菌吸头（4）确保加入体积不超过反应体积的1/10

（5）延长消化时间可使所需酶量减少5、限制性内切酶使用注意356.限制性内切酶的星号活力（1）定义：限制性内切酶在非标准反应条件下，能够切割一些与其特异识别顺序类似的序列，这种现象称星号活力

（2）表示：在相应限制酶的名称，右上角加一个星号（*）

（3）特点：星号活力的识别形式常对标准识别顺序中两侧的碱基没有特异性

GACTAGCNAATTNTACGCAATTTCTGATCGNTTAANATGCGTTAAA

EcoRI*37

（4）产生的原因高甘油含量（>5%V/V)内切酶用量过大，一般为>100U/gDNA低离子强度<25mmol/L高pH值pH8.0含有机溶剂：DMSO、乙醇、乙烯二乙醇Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的离子存在（5）常见容易发生星号活力的酶有：

EcoRIHindIIIKpnIPstI

ScaI

SalIXmnIHinfI

BssHIIEcoRV

1、鉴定是否是需要的DNA片段

2、建立基因组图谱

3、遗传性疾病的研究和诊断

4、疾病易感性或抵抗基因的检测

5、器官移植的配型

6、病原体的分型

7、药物遗传学和药物基因学的研究

8、其它应用

限制性内切酶图谱

也称DNA物理图谱，是DNA链上某些限制性内切酶酶切位点的图谱，可作为DNA片段的特殊标记。是DNA特征的证据

内切酶活性定义

在适当反应条件下，1小时内完全酶解1ug特定DNA底物所需要的限制性内切酶的量，为一个活性单位限制性片段长度多态性（RestrictionFragmentLengthPolymorphism,RFLP）多态性

不同个体中同一位点上DNA核苷酸序列产生变异，且在人群中发生频率大于1%RFLP产生的原因：单核苷酸多态性（SingleNucleotidePolymorphism，SNP

）

由单个核苷酸变异引起的DNA顺序多态性，估计人类基因组中存在约几百万个，约每1000个bp左右就有一个

RFLP——如在限制性内切酶酶切位点发生核苷酸的变异（或多态性），就