第二章菌种与种子扩大培养

种与种子扩大培养一节微生物工业用菌种一、菌种的分离筛选1、菌种的来源Q根据资料直接向有科研单位、高等院校、LJ或菌种保藏部门索取或购买：。从大I'l然中分离筛选新的微牛物商种。—4一一―2、分离思路。新南种的分离是要从混杂的各类微生物中依照•生产的要求、菌种的特性.采用芥种筛选方法"快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。•:・实验室或生产用繭种状不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。•:•仃了优良的菌种,还要有合适的匸艺条件和合理先进的设备与之配合。H S3、新种分离与筛选的步骤。定方案：计先要代阅资料，r解所需尙种的生r培养特性.。釆样：有针对性地采集样林。。增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种増殖培养后，在数量上占优势.。分离筛选：釆用选择性培养基利用分离技术得到纯种II的爾.。发屛性能测定：进行生产性能測定.这吗特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性.发僧周期.产品品种和产最.耐受最高温度、士长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺誓.（1）采样卷采样对象：以采集土壤为主。•:•采样多节：以温度适中，雨虽不多的秋初为好。采取土壤样品要考虑的几个问题♦上质肥，微牛物含鼠高,特别肥沃的土壊中细菌多•放线菌少;在植物残体枯枝落叶F的上填中较多含仃拮抗性真繭.。高地面5~20cm处的土墳通气良好、不受阳光直射•含爾最最髙.。釆土季节以春秋两季技好。•栗上方法：选择适“1地点、铲除表土、取土样败I•克，盛入野先准备的无iS防水纸袋中,其上记录*土时间、地点、椚被情况等。 ；。多点采上、混合分离.町以代发每•地块上的微生物分布平均情况 '（2）增殖培养的，应殖加K雄8为書菌H养人的分的使始以快r冃到集凹史使£富,物/利以要低上例仃•需锹度用件不含常不条样#|其中：养£ k的村1111法培•右的wS的目以样方籍的中£产作多般券H用其物。质—较,窗利以上汰WW茜况它的界源.微淘宀糸的冇器养物上碳等段线目顷，提培生例如油源亡6<■!果MilftJ集微比例石磯死些大含如堆从富关中占一能•过◎♦©❖©无体」群利在不种而凿•种的或这••!多通，用鼻占索利物利II八维仃小顺•纤只微会集、久,氓富粉那Jt肉易淀,而分容•源.种不嘲碳长纯，i一牛的种选唯常段菌•14为麻强机M卜力取制一大对费LJ '(3)培养分离•＞尽管通过増殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态Q因此还必须分离,纯化。俛一步,增殖培养的选择性控制条件还应进•步应用,而且控制得细一点,好一点。纯种分肉的方法仃划线分离法、稀释分离法。•划线分髙法一平板划线法(4)筛I、I、初筛:从分离得到的大量微生物中,将日标微生物筛选出来的过程.一般釆用平板筛选.常用的初选方法:•水解IW产生菌的筛选：将酶的作用底物加在培养基中，接种后适温培养，根据菌苔周围是否产生水解圈筛选出水解牌产生菌.•拮抗菌的筛选一对峙培养将病原指示菌与待测菌株相对接种在平板上适温培养，根据病原菌的生长情况筛选出拮抗性蘭•株.II■复筛:在初筛的基础上，进一步饕定有希望菌株的生产能力强弱的过程.•复筛釆用揺瓶培养后，发酵液采用精确的分析方法进行测定・•复筛过程中.要结合培养条件进行.培养条件包括3培养基pH值发酵温度供氧量等.（5）菌种鉴定（5）菌种鉴定hi•:・经典分类鉴定方法：形态特征、生理生化特征、血清学试验等。hi•:•现代分类鉴定方法：遗传特性、细胞化学组分、计算机数值分析。(6)毒性试验<• 自然界的些微生物是在•定条件卜产為的，将其作为生产菌种应当I•分当心，尤其与食品工业仃关的的种,更应慎重•据仃的国家规定,微生物中除啤酒酒母、脆联壁母、黑曲队米曲岬和枯草杆菌作为仗用无须作毒性试捡外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。f|土一—'二、菌种的保藏与复壮(•)闌种的保藏1、蘭种保藏的意义歯种是从小微生物学以及生命科学研究的基本材料,将别是利用微生物进行仃美生产如抗生素、钗基酸、龈造等「•业，更离不开菌种。所以菌种保藏是进行牛物学研究和微生物育种匸作的重要组成部分。其任务首先是使菌种不致死亡,同时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持F来而不致向坏的方面转化。2、菌种保藏的原理，歯种保藏匕要是根据齒种的生理生化特点人丄创造条件使佝*或菌体的生长代谢活动尽最降低,以减少箕变异。舶U通过保持培养基管养成分在最低水平缺氧状态,F燥和低温，使菌种处F“体眠”状态，抑制其繁殖能力。・•种好的保藏方法首先应能长期保持菌种原有的优良性状不变，同时还需考虑到方法本身的简便和经济，以便生产上能推广使用。、歯种保保的方法、歯种保保的方法匀种保祓的方法很仑.一般存下面几辞：▲斜面冰箱保蔵法（濤母）斜面保藏是种短期、过渡的保藏方法.卅浙衅斜他按忡后.覺昆适条什卜培券到曲体我抱r•牛kl渦脂.放m冰箱保存.一般保存期为三个月到六个月.B石峭油貌存法（陳母）向培养成熟的着神斜血I:.倒入层火过儡的石蝸油,用fit要高出斜面一座米•然蒔".冰節中此法可通用于不能利用石錯油作碳源的细蘭、專繭、酵母等很生物的保存保存期约一年左右.

（细际防线南）（细际防线南）真空冷冻干n保威法*丨|询常川的収邱恩的肿万法.1基本顷理倾邮的汨坦卜（一15。〉•快増饨将细組）结.并Hfti特细軽：初L。部。宇中他水分升华在斷的环埼中.後牛物的4K和代谢格谷时伶H.不&发生安异・国此• 以保，njK时间.一般5年左右.tt#ft«ziaaiiK；£«定的坟备.会求亦比较产格.何由丁・诙方法保祓效果好.《备＜微牛物帝适用.所以.国内外。已絞曾财地阿用.UH/nA的雑本操作先将微牛物制成悬浮液•卩｝与保护剤混合.然后放。山制的安瓶曾内.用低沮酒Wh妇！上,』E在低■下用真空1UH%最后将安械计必空tfLH.井低温保載.保护剂-短釆用脱朋牛奶或血清）保护利的件川叫耗足•冷沧I怏的脱水过程中代替站合水而格定细励成分（细«R）的构型，防此坦因为灰菇而破坏保护剂还W以只支持作用•使微1物締松H«疋灯1仙牛奶可以高心或加热的方法脱脂液氯超低温保藏法（细菌，真菌）液氯超低温保藏法（细菌，真菌）液気超低温保臧法足近儿年才发展起来的，此法国外（2较普遍聚用.是适用范围最广的微生物保蔽法.尤KA些不产砲子的菌丝体.用只它保破方法不珅想・”川液氤保帔法11保存期期长・a原理用液気能长期保存:術种.这是因为液氮的温度可达一196P,近近低IH新陈代谢作用停止的温度（一130C）,所以此时蘭抻的代谢活动已停止.化学作用亦随之消失。任操作方tt及步骤1（1）安甑管要求由1液気保｛fJ低温状态，所使用的安韻管需能承受大的温差而不致于破裂.股用95料或GCI7的玻璃管・安姬竹选好后印上标记，加棉塞后灭菌.烘干后备用。（2）菌种准备及分装因为液気法南种座经受超低温的冷冻过程,所以也需要保护剂•常川的保护剤为10%甘油用保护刑制备好備液后,加入准备虾的安瓶管中.一般安瓶管的装bi为0.2—ImL>主要菌种保藏机构介绍种是•个国家的重要资源,世界各国都对備种极为垂视.设賞r、种专业性保城机构，u要的倫种保拔机构介绍如r(1)ATCCAmericanIXpeCullureCollection.Rockvil1.Maryland.U.S.A.美国标准蘭种收蔵所・美I叭4里兰洲，罗克维尔市。(2)CSH((('oldSpringHarborLaboratory)tU.S.A冷泉港研究室，美国.M(InstituteofAppliedMicrobiology),ofTokyofJapan«日本东京大学应用徹生物研究所，日本东京.(4)IFO(InstituteforFermentation)>Osaka>Japan>发酔研究所，日本大阪。(5)KCC(KakenChemicalCompanyLtd),Tokyo,Japano科研化学有限公司，日本东京.(NathCollectionofType(ulLurv).I.ondonInilrtl,英国伦敦.(7)MH(NationalInstitutesofHealth>.Brlhcsdn,Manland•USaA •国立卫生研究所，美国，马里兰洲，贝塞斯达.(S)NRRL(NorthernIlili/jilionRrwarchandDevckipmcntDiviMon.US.DpnrtmstofAgriculture.PsrimUSA.美国农业部,北方开发利用研究部，美国皮奥里亜布.为了推动■种保臧事业的发R.197017月在国家翎|中国科4■主持下,君开了第次仝国商种保«1.*会议.在会上成旻厂中国徹生物蘭种保减管理委员会（CCCMS）委托中国科学院负责担负全国蘭种保贼管理业务,下设六个菌种保懺管理中心.1） 普通微生物圜种保域管理中心（CCGNC）；中国科学院微生物研究所，北京（AS）:真菌，细蘭.中国科学院武汉病毒研究所，武汉（AL-IV）:病毒.2） 农业徹生物菌种保蔵管理中心（ACCC）;中国农业科学院土壊肥料研究所，4）医学做生物蘭种保酸管理中心«M（C）:4）医学做生物蘭种保酸管理中心«M（C）:管理中心＜ci（r）:部食品发幣工业科学研究所，北京.中国件学科学院皮肤病研究所.南京＜JD）:真菌.卫生部药品生物制皿检定所，北京，细曲.中国殴学科学院病毒研究所.北京,病毒- ,5） 抗生素茴种保狀管理中心（CACC）I '中圏医学科学院抗生素研究所，北京和四川扰生素工业研究所，成都：新抗生素普种.华北药厂抗生素研究所，石家庄，生产用抗生素菌神6） 兽医微生物菌种保薩管理中心（CVCC）I农业部兽医药耳监察所.北京.）（二）菌种的衰退与复壮1、菌种衰退:菌种经过长期人匸培养或保藏,111「自发突变的作用而引起某些优良特性变弱或消失的现象。"（2：而补退化的原因：。基因突变；。变异菌株性状分离；。诱变的单商落是由一个以上抱f或细胞形成。偶落由一个泡r或单个细胞形成.仇它是多核细胞。单核抱K发生突变时,双链DNAI•.仅一条链I•.某个位点发生变化争连续传代令其它因素。曲种保藏不当。生长条件不満足（培养堆组成、培养条件）3、防止菌种退化的措加/控制传代次数＜选择合适的培养条件v选择合适的保藏方法。菌种徳定性检査-分离复壮4、菌种复壮：使衰退的蔺种更新恢复原来的优良特性。<•复壮措施:。对L1衰退菌种配合一定培养条件进行单细胞分离纯化S淘汰衰退的个体i选择合适的培养基三、菌种选育•:•菌种选育是-门应用科学技术.其理论基础是微生物遗传学，生物化学會.而其研究目的是微生物产品的高产优质和发展新品种为生产不断地提供优良菌种，从而促进生产发展。幸 H前螺种选有常采用自然选育和诱变育种筈万法，带仃-•定的盲目性，尚属「经典育种的范畴。随着微生物学、生化遗传学的发展,出现了转化、转导、原生质体融合、代谢调控和基因工程等较为定向的育种方法。第二节种子扩大培养•:•神于扩大培养:是指将保存在砂上管、冷冻干燥管中处「休眠状态的生产爾种接入试管斜而活化后,在经过扁瓶或摇瓶及种『罐逐级放大培养而获得一定数nt和质虽的纯种过程。这些纯种培养物称为如s1作为种子的准则•:・惆种细胞的生长活力强，移种至发酵縦后能迅速生长，迟缓期短；。•生理性状稳定；•菌体总虽及浓度能满足大容虽发酵罐的要求;。无杂菌污染；4•保持稳定的生产能力。•、种子的制备过程。种K制备的过程大致可分为:w实裁室种「制备阶段，生产车间种了制备阶段■IIIIt—子.l I MglRUh1、实验室种子的制备・:・实处室种子的制备一般采用两种方式。对于产砲r•能力强的及砲尸发芽、生长繁殖快的南种砰以采用固体培弄基培养抱仁泡k可rt接作为种了•罐的种了,这样操作简便,不易污染杂知，对「产北!K能力不强或泡子发芽慢的南种•可以用液体培养法。T2、生产车间种子制备•:・实凝空制备的抱子或液体种子移种至种子縦扩大培养,种子絲的培养基虽因不同菌种而异.flI其原则为采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉:米浆、磷酸盐等,如果是需氧菌,同时还需供给足够的无蘭空气，并不断搅拌,使保i（统）体在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。（1）种子罐的作用：。主要是使拖子发芽,生长繁殖成菌（丝）体,接入发酵罐能迅速生长,达到-定的菌体量,以利于产物的合成。•确定种子罐级数需注意的问题，种了级数越少越好,可简化工艺和控制,减少染菌机会。种f级数太少.接种最小,发酵时间延长,降低发酵雄的生产率，増加染爾机会然种了•鹹级数随产物的品种及生产规模而定.但也与所选用工艺条件有关。如改变种子雄的培养条件，加速了弛了发芽及蘭体的繁玳，也可相应地减少种了城的級数。I一、影响种子质最的上要因素1、培养基❖营养成分适合种子培养的需要/选择仃利尸他子发芽和倘体生长的培养基；y营养上要易「•被蘭体直接吸收和利用；f管养成分要适当丰富和完全，紈源和维生索含量要高•:•营养成分要尽可能与发醇培养基相近。'羸部辨籍螺麝质辭就的现象’其主。例如在四环床.顷♦生产屮•配制产仰于斜面壻养鼎他卷霸腸㈱产种川濃及遍的不同。釘僱加I•原料不同如鱼陈或骨腺对他子影响也不同。。諏瞬牘臨備费性警尷罐麒他「的形成.磷含批太多或太少也会影响抱J印勺质•:•水质的影响：地IX不同、季节•变化和水源污染，均U造成水质波动，影响种于质量。e菌种在同体培养基上可呈现多种不同代谢类型的蘭落,氮源品种越多,出现的ES谢类型的蘭落,氮源品种越多,出现的ES歯落类型也越多,不利「生产的稳定。

。措施/培养基所用妹料要经过发酵试疚合格才可使用〈严格控制灭爾后培券基的质量i斜面培养基使用前,需在适当温度下放徂-定时间。供生产用的』子培养基要用比较单•的敏源，作为选种或分崗用的培养基则采用较夏杂的仃机征源种齢种龄：一种中培养的清统体丿「始移入卜级种了撮或发醉雄时的培养时间。♦通常种齢是以处「牛命力极旺盛的对数生长虬爾体量还未达到段大值时的培养时间较为合适.时间太电菌种趋「老化,生产能力卜降,歯体自溶:种龄太短.造成发酵前期生长缓慢。。不同繭种或同菌种匚艺条件不同.种龄是不—杵的，-股需经过多种实验来偷定。嗜碱性芽弛杆菌生产碱性蛋g12小时最好。

个接种;4是指移入的种子液体枳和接种后培养液体积的比例U。接种刊的大小决定于生产菌种在发屛册中牛K繁疝的速度，釆用较大的接种妆可以缩短发屛H中曹釦|斂到高蟬的时间.使产物的形成提前到来•并可减少杂商的牛•长机会.但接种林过大或占过小.均会影响发fib过大会引起溶轼不足.影响产物合成:而且会的移入代谢废物,也不经济：过小会延K培养时间,降低发醇雌的生产率。、温度个通常接种％细繭1~5%,M阡曲5~10%•宓蘭7~15%.有时20-25%、温度任何微生物的生长都需尖:仃适H的生长温度，在此温度范围内，微牛物生长繁殖域快Q温度对多数品种斜而抱子质量有显著的影响。如上霉素生产菌种在高J37°C培养时,抱了接入发酵繩后出现糖代谢变慢，后基現回升提前・1W丝过卩门溶，效价降低等现〈象"般芥生产单位都严格控制弛子斜面的培养温度.•:•培养基的点离『浓度对微生物牛命活动仃拟著影响。各种微生物都有自己生长与合成酶的最适pH°同•蘭种合成酶的类型与酶系组成nj随ph的改变im产生不h寸程度的变化o•:•泡盛酒曲阳突变株/l：pH6.0培养时以产生a•淀粉IW为主，在pH2.4条件卜培养，转向合成糖化型淀粉勤与麦芽糖酮，a•淀粉酶合成受到抑制。6、通风量在种『攏中培养的种子除保证供给易被利用的培养基外,冇足够的通气量可以的高种子质虽。例如，有霉素的生产蘭种在制备过程中将通气充足和不足两种情况卜得到的种了分别接入发酵罐内,它们的发酵单位可相差1倍。但也有例外，例如上霉素生产菌,一级种子罐的通气与小对发酵有利。、其它因素(1)培养时间•:•一般来说，衰老的来子不如年轻的抱子,因为衰老的砲了已在逐步进入发芬阶段，核物质趋F分化状态。过「衰老的弛了会导致生产能力的下降。•:・措施：抱r•培养的时间应该控制在抱广量多抱子成熟、发酵产址正常的阶段终止培养。(2)冷藏时间。斜面冷藏对胞子质早的影响与与子成熟程度度关。如土霉素生产菌种抱『斜面培养4犬左右即于4，C冰箱保存,发现冷藏7~8天菌体细胞开始发溶。而培养5天以后冷藏，20天未发现白溶。寺冷藏时间对砲子的牛产能力也仃影响。例如花链寄素生产中，斜面抱了在6.C冷藏两个月后的发酵单位比冷藏•个丿J降低18%,冷藏3个月后降低35%。(3)泡沫泡沫的大量存在,易影响微生物对溶氧的吸收降低种r罐的利用率,甚至跑液染歯等不利影响，不利于种子的培养。、种子质量标准、种子质量标准1、细胞或菌体焰菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观(色素、颗粒等)-单细胞：蘭体健壮、菌形一致、均匀整齐，仃的还要求有一定的抨列或形态：-霉菌、放线菌：繭丝粗壮、对某些染料着色力强、生氏吒盛、術丝分枝情况和内含物情况好。2、生化指标。种子液的糖、氮,磷的含量和pH变化。3、产物生成量•:•在抗生素发酵中，产物生成址是考察种子质届的重要指标，因为种了液中产物生成量的多少间接反映种子的生产能力和成熟程度。4、酶活力•:•种K液中某种悔的活力，与11的产物的产代有一定的关联。S 四、实例——啤酒酵母的扩大培养啤酒醉母纯正与否，对啤酒发醉和啤酒质站的影响很大。啤酒工厂生产使用的酵母由保存的纯种酵母,经过扩大培养，达到•定数辱后，供生产现场使用。每个啤酒厂都应保存适合本厂使用的纯种酵母,以保证生产的啤酒貝“稳定的风格和特性。（二）扩大培养的儿项原则和问题（二）扩大培养的儿项原则和问题（一）扩培流程1、 实验室扩大培养•斜面试管（原菌种）一富氏瓶或试管培养一巴氏版或三角瓶培养一卡氏罐培养2、 生产现场扩大培养•:•汉生辨培养一酔母扩大培养縦一醵母繁殖罐一发酵罐。（1）骼母扩大培养的关键在于使用优良的位如胞出发菌。此出发慎株先经生理特牛和生产性能鉴定，然后投人应用，并呆证在扩大培养过程中无污染、无变异。f一步扩大后的残留液都应进行无污染和无变异的检査。(2)培界前期,为了提髙酵母增殖速率,缩短培养时间，实验室扩大培养阶段，釆用酵母最适繁殖温度25S而后每扩大一次,温度均相应有所降低.使酵母逐步适应低温发发的要求。但每次降温幅度不能太大,以防酵母活性受到抑制。随制培养温度的降低,培养时间视稀释倍数而相应延长.例为了缩短酵母生长停滞期和缩短扁亲时间，每阶段扩大培證的酵母,最好在秣母对数生长期移植,具体體矗是鱗辭髓翳回降»商，死12率最低，移植后，迅速增bb，绝养鑑氧扩出此是培溶成与场。如因氧邮容，.母现