液相常见故障及技术问答

目录1色谱柱使用寿命27最抱负的流速2保存时间变化28键和的碳链3保存时间漂移29pH缓冲4不同色谱柱和不同批次之间的重现性30流动相组分5样品配制问题31柱子污染6峰形拖尾因素32方法验证7正相色谱33糖类分析中的双峰8系统体积，死体积，滞后体积34方法控制9梯度方法转移35流动相pH10系统堵塞36改善信噪比11色谱柱塔板数37过载12柱压38柱子的耐用性13峰面积变化 39快速分析和柱压14鬼峰40反冲柱子15pH对保存时间的影响41选择性的改变16柱平衡42新方法17柱改性43倒峰18复杂的样品44麻烦，冗长乏味，费时19疏水坍塌45快速分析20基线噪音46LC/MS的缓冲液21小孔柱47反相色谱中的碱性缓冲液22样品溶液48柱后衍生23梯度比例49梯度滞留体积24柱子保存50缓冲能力25离子对色谱51流速的变化与定量关系26反相填料的水解稳定性52极性物质的分析1色谱柱使用寿命问：我的色谱柱进样大约100针后峰形变差了，踏板数很低，怎么回事？答：100针的确很少，一般情况下使用时间会长很多的。一方面我们要确认你的使用条件是不是导致色谱柱寿命下降的因素。两种基本情况：1在相同实验中以前使用的色谱柱寿命长很多2在本实验中用过的所有的色谱柱在使用相同次数后所有损坏假如是第一种情况，应当检查一下实验是否保持一致。样品的组成改变了吗？样品中强吸取的污染物会破坏色谱柱的柱效。或者管路的密封圈是否完好？脱落的密封圈会堵塞色谱柱过滤器和填料的顶层，从而影响样品的分布。假如可以确认色谱条件没有变化，那么可以推测是柱床松动的因素。在实验室和运送过程中色谱柱剧烈的震动都会导致柱床松动。（色谱柱有没有掉到地上？）或者也有也许使生产商的问题。并且这种问题标准色谱柱检测中心是检测不出来的，只有在用过一段时间后才会显露出来。这种情况生产商会免费替换色谱柱。问：那些生产商真好，但是我的情况不是这样的。我的色谱柱总是用不了多长时间。有时候100针，有时候200针。200针还可以忍受，但是100针太差了。色谱柱开销太大了，我该怎么办？答：我完全批准你所说的。我们必须要找到因素然后看看我们能做些什么。最大也许是样品中的成分吸附在色谱柱的顶端。也许是在流动相中不溶的沉淀物或者是强吸取的物质。随着进样的增长这些污染物在色谱柱顶端累积，阻止样品正常吸附和扩散。从而导致峰形变差。通常这种问题和柱压升高同时出现。问：嗯，也许就是这个因素。我应当怎么避免这种问题呢？答：有几种方法可以采用。一，采用合适的样品准备技术解决样品。用和分析柱相似的固相萃取柱进行固相萃取（SPE：solidphaseextraction）1效果很好。此外一种非常有效的方法是使用保护柱。保护柱是作为牺牲柱装在色谱柱前使用的，出现问题的时候就会被替换掉。为了获得最佳的分析效果，保护柱的填料和装填技术必须和分析柱同样。假如用不同品牌的填料就不能获得最佳的分析性能和保护作用。不要用大些的颗粒型号，大的颗粒或装填不好的预柱会因谱带扩展而导致分离效果变差。问：使用预柱听起来不错，尚有其他方法吗？答：尚有其他一些方法，但是他们都有缺陷。我不提倡用那些也许溶解色谱柱顶端污染物的溶剂去冲洗柱子。很多情况下，这个方法是没有作用的。例如，假如沉积在色谱柱顶端的污染物是蛋白质，你冲洗的时候他们已经变性很久了，甚至也许交联在一起，变得难以溶解。此外，通常色谱柱是处在水解平衡状态，而每次冲洗都会除掉水解键合相。因此，反复的冲洗柱子会加速柱子的老化。并且，冲洗后还要用流动相平衡柱子，假如是做离子对色谱的话会消耗大量的时间。另一个经常用的方法是反冲柱子。假如用和流动相不同的溶剂冲洗会产生和上面相同的问题。假如用流动相的话，需要很长的时间才干除去污染物，也有也许主线就没作用。同时，反冲柱子会削弱柱子。尽管现在的装填技术可以使柱子承受反冲，但是一般情况下不要采用这种做法。问：那么最佳的建议就是使用预柱了？答：绝对是。预柱也没那么贵-一般随品牌和型号的不同价格在10$-50$之间，而他们所保护的柱子的价格是预柱的10倍左右啊。并且他们还可以避免其他来源的污染物的，这些污染物更加难以发现。这些来源涉及比如流动相中的灰尘，泵脱落的密封圈的碎片，或者从流动相吸附的污染物等等。其中有些难以对付，而保护柱就可以阻挡这些。问：尚有其他缩短柱子使用寿命的因素吗？答：有的，但是只要你按照生产商的说明使用柱子的话一般很少发生。有一个也许就是流动相pH超过使用范围而导致的柱子坍塌。样品用强酸或强碱溶解的话也会发生此外，一些特别的柱子有特别注意的地方例如氨基柱可以和醛，酮反映。氨基柱在不含缓冲盐的水溶液中会显强碱性，分解部分硅胶。暴露在错误溶剂中的柱子也会发生坍塌。由于这些柱子是基于非常松散的结构。他们是因颗粒之间的黏着而部分的结合在一起的。假如置于能破化这种黏着的流动相中，柱床很有也许会坍塌。氰基柱在中性溶液，苯基柱在THF中有时就会发生这种问题。这也是不要冲洗柱子的另一个理由。2保存时间变化问：我的样品峰的保存时间不一致，什么因素？答：一方面我们要知道是什么样的变化，这有助于我们找到问题潜在的因素。假如在连续进样过程中出峰时间不规则的变化，那么一方面查看一下泵和溶剂混合装置。可以用量筒和秒表来测定流速，从而确认泵是否在工作。在其中一种溶剂中加入示踪剂，通过观测基线拟定流动相的比例是否发生变化。假如流动相的比例不变，基线就是平稳的。假如流动相的比例有变化，基线会发生相应的变化。比如你当你是使用紫外检测器的反相色谱法时，可以在有机溶剂中添加0.1%的丙酮，在254nm监测基线。此外，你也可以手动配制流动相而不用通过溶液混合装置。这样假如保存时间没有变化，那么问题就是在混合装置这里。问：连续进样过程中保存时间还是相称一致的，但是隔天进样的话就不同样了。答：这种情况的话不大也许使仪器的问题。最大也许是流动相组成的问题。在反相色谱中，保存因子k和流动相中有机相的比例是成指数关系的。通常，有机相变化1%，保存时间会变化5%-15%，一般是10%。这就是说你要非常准确的配制溶液。最佳是按重量而不是按体积来配制。此外，脱气的方法也会导致保存时间变化。最佳是真空超声1min。这种方法溶剂蒸发的最少，效果很好。此外还可以采用氦气脱气法。在流动相和氦气达成最初的平衡后，应当减少氦气的流速。否则氦气会带走溶液的蒸气，从而改变溶液的比例。假如你的样品时离子型或者可以电离的化合物，控制流动相的pH就变得很重要了。pH变化0.1会导致保存时间变化10%。所以要准确的测量pH，并且要校正好pH计。在反相色谱中随着pH的增长，酸性化合物保存时间缩短，而碱性化合物延长。顺便提一下，我的老师经常说：一个缓冲液之所以被称为缓冲液是应为他对pH有缓冲作用。假如没有缓冲作用，就不是一个缓冲液了。比如醋酸铵溶液就只是醋酸铵溶液，它不是缓冲液。一个醋酸盐缓冲液有醋酸离子和醋酸。假如两者在溶液中档量存在，溶液的pH就是就是该缓冲液的pK值，醋酸盐的pK值是4.75。缓冲液在pK值处有最大缓冲能力。问：我以前都不知道到控制流动相的组分和结果的重现性有这么密切的关系。尚有其它需要注意的变化吗？答：此外一个重要的因素是温度。假如所有的峰的保存时间都朝同一个方向变动，可以推测是温度的影响。通常温度每变化1℃保存时间变化1%-2%。一般情况下影响没有那么大。在反相色谱中检测离子型或离子化的化合物时，保存时间会因缓冲液的离子化能力不同而变化。但是这种影响微乎其微，通常都可以忽略的。标准情况下缓冲液的摩尔数改变20%保存时间会改变1%。由于配制缓冲液经常是称量的，所以不大也许犯这么大的错误。问：有没有其他一些特别的情况需要考虑一些额外的参数？答：有的。在离子对色谱中，离子对试剂的浓度会影响离子型化合物组分的保存时间。带有和离子对试剂相反电荷的分析物的保存时间会缩短，带同样电荷的会延长。中性化合物几乎不受影响。在低浓度情况下，比如5mM/L，样品和离子对试剂互相作用（竞争吸附），保存时间随离子对试剂浓度的变化呈比例变化，在高浓度情况下，比如10mM/L左右，吸附剂的表面的离子对试剂呈饱和状态，此时离子对试剂浓度的变化不会导致分析物保存时间的改变。在开发方法的时候应当考虑到这点。假如想要你的方法对某一变量不敏感的话可以这样做。正相色谱的保存时间对流动相中的极性成分非常敏感。任何情况下水都是一个麻烦。不同数量的水导致不同的保存时间。有一个窍门是使用半饱和水的非极性溶剂比如正己烷和二氯甲烷来避免这个问题。使用方法是这样，取一定体积的溶剂，加入一些水，搅拌使水呈饱和状态，混合该水饱和溶剂和等体积的不含水的溶剂。该过程可使含水的非极性溶剂得到非常好的重现性。同样也可以防止保存时间的漂移，下面将具体介绍。3保存时间漂移问：我的色谱峰保存时间发生漂移，会是什么因素呢？答：这个问题很故意思。因素有很多，让我们一个一个来看。人们通常认为保存时间漂移是平衡的问题。假如你是做正像色谱用纯硅胶柱的话就很有也许是这个问题。正像色谱的保存时间对吸附在硅胶表面的水的含量是非常敏感的，所以流动相中溶有水的话，保存时间就会漂移。由于水在正己烷或二氯甲烷等溶剂中的溶解性非常低，所以柱子要很长时间才干平衡好。我曾碰到过一个例子，用非常纯的正己烷平衡一个星期后保存时间还是漂移。所以我建议避免使用非常纯的试剂。通常使硅胶达成水平衡的做法是使用半饱和水的试剂。制备方法是一体积的水饱和的疏水试剂：一体积的纯试剂混合。这个方法可以大大缩短平衡的时间。在反相色谱中，通常不久就可以平衡的。只需要几个（5-10）柱体积的流动相就可以。当然并不是所有情况都这样。一个典型的例外就是具有离子对试剂的离子对色谱。离子对试剂的使用量一般是2-5mmol/L或更少。它们吸附在反相键和相表面，表面浓度在0.5-2μmol/m2。键和相的比表面积为330m2/g，一根4.6mm*250mm的柱子具有3g的键和相，其表面积达成1000m2。要1L的2mmol/L的离子对试剂才干平衡好柱子。当然这只是极限的情况，但是一般用几百mL平衡柱子也不少见的。不要把用过离子对试剂的柱子换成有机相保存过夜，由于换溶剂的过程中离子对试剂被洗脱下来，而再平衡又需要很长时间。问：这些现象都有一个共同点：流动相中具有低浓度的强吸取的物质。这就是导致保存时间漂移的普遍因素吗？答：是的。其他的没这么普遍。但是强吸取的物质也也许来自样品。这种情况下强吸取的物质会随着进样的增长而累积，从而导致色谱柱化学性质的改变。样品中赋形剂的吸取就是一个例子。通过观测保存时间改变的比率可以判断污染物是来自于流动相还是样品中。下面来做个实验：1反复进样几次，如：反复进4次，每次运营1小时。2不进样，泵入相同时间的流动相3反复第一步4将保存时间作图A：相对于时间B：相对于进样次数假如第一张图谱呈平滑的曲线，就是流动相中携带有污染物。假如第二张图呈平滑的曲线，样品就是污染物的来源。问：尚有其他导致保存时间漂移的因素吗？答：有的。也有也许流动向组分随着时间而变化的。你假如不是使用现在带有在线混合能力的仪器的话，将会发现流动相的组分在慢慢的挥发。特别是在用氦气脱气的时候更加明显，所以应当将氦气的流速控制到最小。一个经常被低估的因素是键和相的水解。生产厂家通常规定一个pH范围，超过这个范围键和相救不稳定了。这个范围通常是2-8或9。尽管如此，还是要小心对待这些极限条件的，分界线不是非常明显的。水解通常还取决于其他条件的，比如温度和有机溶剂，在这个pH范围之类也有缓慢的水解的。键和相在中档pH条件下是最稳定的，pH3-5，低温。等度色谱条件优于梯度。当然水解的确也在等度中发生，键和相通常会自身吸附，处在一个自身平衡的状态。但是在梯度或清洗柱子的时候，使用到高浓度的有机溶剂时，自身平衡被打破，水解的键和相就被冲出了柱子。问：我会记住这些的。温度的改变会导致保存时间漂移吗？答：是的，温度也通常被考虑到的。假如你让仪器自动进样过夜或过周末，就会发现保存时间随着实验室温度的改变而产生漂移。在许多地方，为了节能在晚上或周末室温会设立到不同的温度。按常理来说，室温每改变1℃，保存时间改变1%-2%。联系柱压的增长导致保存时间漂移的现象。柱压增长也许是因柱子污染物导致的，但是即使是过滤头堵塞都也许导致保存时间的改变。压力会推动流动相通过过滤头，该过程中的摩擦会加热流动相。这种温度的增长就会导致保存时间的变化。此外尚有一些导致保存时间漂移的因素，但是都非常少见。使用高覆盖率的键和C18末端完全封口的色谱柱在少于一定比例有机溶剂的流动相中因不能完全润湿会导致平衡很慢。这将会使流动相和固定相失去接触而导致“疏水坍塌”，即固定相表面一些区域因键和相的自我吸取而导致与样品的交互作用减少。及时跑几个柱体积的有机溶剂就可以再生柱子了，最佳是使用流动相中的有机修饰剂（？）。这种现象在不是末端键和的色谱柱中很少或几乎没有碰到。4不同色谱柱和不同批次之间的重现性问：我要开始开发一个新的HPLC方法。验证之后，该方法将转道QC实验室并将使用许数年。我紧张该方法的长期的反复性，特别是柱子的长期反复性。如何才干保证好的反复性呢？答：一方面，我要表扬你在开始做这个方法的时候就能考虑到这个方面。假如可以预料到该方法将要使用好几年，在选择柱子方面就要做些功课。要想使柱子在该方法的可预见的合用期内可资使用，就要选择一些大的生产厂家。此外，要选择一种标准的表面化学物质-比如C18或C8-而不是那些新奇的或很少使用的。换句话说，柱子的选择要保守点。下一个标准才是柱子的反复性，假如你或你的同事以前用一根柱子有很好的反复性，这是一个很好的起点。同时也要考虑生产商提供的信息。近来有的厂家开始印刷他们的说明和不同批次的反复性实验的结果。你可以从厂家得到这些信息然后细心对照。问:我该从这些信息中寻找什么呢？答：让我往后回一点，解释一下不同柱子和批次之间反复性的不同方面。下面，就说一下反相填料，由于他们更加普遍。假如你用同一批填料的不同柱子，将会得到不同的踏板数（峰宽），不同的柱压，不同的保存时间。保存时间与填料密度和柱体积呈比例改变，而柱体积则取决于柱子的内径。这个改变对你的方法应当是没什么影响的，由于所有峰的保存时间都呈比列的改变，而分离度还是没变。这个因素导致的保存时间变化的RSD通常在3%左右，但是假如生产商对柱子的硬件有很好的控制，RSD也可以低到1%。柱子踏板数的变化会影响方法，特别是做双峰的时候，它们很少能达成基线分离的。尽管2-3%的踏板数的标准偏差已经可以达成，但通常还是在+/-10%，记住踏板数是个平方数，分离度仅仅取决于踏板数的根。所以踏板数2%的偏差相称于峰宽1%的偏差。你要确认一下柱子的厂家是有踏板数的上下限，还是只有一个下限，上下限都有比较让人满意。同一装填程序的柱子其柱压的反复性是相称好的，同一批次变化应不超过+/-5%。问：那么批次之间的反复性怎么样呢？答：假如你注意一下批次间的色谱参数，你会发现同参数会不同，更重要的是批次间分离的选择性也会改变。就是说峰的相对保存会改变，比如他们在色谱图中的相对位置，这对你方法的拟定性是不利的这种改变是你要尽量避免的，所以你要从厂家那里得到一些消息，他们是怎么保证批次之间反复性的，这涉及一些物理，化学，色谱方面的测试。在物理测试中，最重要的一项是装填的表面积，该项参数的变化会直接导致保存时间的变化。所以你要知道厂家认可的批次间表面积改变的幅度是多少。通常情况下幅度是+/-10%，但是+/-5%也是可以达成的。化学方面的参数最重要的是键合相的表面覆盖率。通常用多少umol/m2表达。许多厂家并没有直接给出这个参数，而只说明了C的百分含量。我们希望看到的这个代替性的说明以及一个紧凑的幅度，通常是+/-10%，低于+/-4%的也可以达成。最后你要知道厂家的色谱反复性测试。通常色谱柱会附带一张色谱图，检测的是一些简朴的中性化合物的混合物，例如甲苯，萘和蒽等。但是这不是一个好的批次间反复性测试。由于这些中性疏水化合物的相对保存反复性相称好，对装填中表面覆盖率的改变是相称不敏感的。好的批次间反复性测试还应在混合物中添加强碱化合物。在精心设计的测试中，精选的碱性化合物重要与残余硅羟基作用，而中性化合物则重要与键合相作用。只有具有2种化合物的反复性测试才是让人信服的。假如一个厂家是这样测试的并且有好的反复性，那么他的柱子会更加让人放心。问：我不知道厂家的测试与我的化合物的检测有什么联系，我应当如何在我的检测中保证一个好的批次间反复性呢？答：你说的很对：上面的消息只能让你有一个比较大的机会保证反复性。但最后必须用你自己的检测来做反复性测试。有些厂家提供一整套的设备涉及不同装填批次的柱子来做这个测试，此外有的厂家则按规定提供不同批次的柱子，你要了解你所得到的东西。同一装填批次的色谱柱是没有用的，你需要的是用不同键和反映装填的柱子。假如同一批次是不同天内装填，然后色谱柱编号又不同的时候的时候，厂家也许自己也会迷糊的。所以你最佳询问2次，保证厂家给你的是你要的。你也许需要3根不同批次的色谱柱来为你的方法做反复性测试。假如批次间的改变不影响你的检测，那么接下来的时间你的方法应当有一个好的反复性。5样品配制问题问：我在样品配制过程中碰到一些问题。我是用反向吸附剂（reversd-phasesorbent）进行固相萃取的。通常回收率都有80%或更多，但是有时候只有50%或更低。问题出在哪呢？答：你的问题比较普遍。我发现回收率低通常是由解决方法导致的。80%的回收率对分析来说也许足够，但是对方法耐用性来说则不够。看来有一个因素导致样品不完全回收，损失20%-50%。我们要找到损失的20%-50%到哪里去了。问：ok，我们怎么找？答：有四个方案：1分析物在固相萃取前丢失2分析物在吸附过程中没有完全吸附3一部分分析物在清洗过程中被洗掉4部分分析物在洗脱过程中仍然留在固相萃取管中要确认分析物是不是在吸附过程中穿过了SPE柱，我们只要在第一个SPE柱后面再接一个SPE柱就好了。假如在第二个SPE柱的洗脱液中具有相称数量的分析物，那么就知道吸附是不完全的。有几个因素也许导致不完全吸附。1样品的浓度太高，假如这样要用水稀释样品（可电离的样品用缓冲液稀释）。2确认SPE柱是否活化了。反相固相萃取管的活化先走有机相（甲醇，乙腈等）再用水或缓冲液平衡。然后样品才干吸附上去。很多人想省掉这些额外的麻烦环节，但是为了保证方法的准确性这是必须的。问：我已经按照厂家的建议活化管子了，所以应当不是这个问题。我喜欢你的加一个管子来核算吸附过程的完整性的建议。我应当怎么检查方法的其他环节呢？答：检查清洗过程，你要收集所有的清洗液，然后用HPLC分析。但是假如清洗过程中有干扰分析物的物质也被洗脱下来，那么就不好对清洗液中的分析物进行定量分析。这时我们可以通过下面的技术手段来解决这个问题。把清洗液蒸干，用样品的配制溶液溶解，再用同样的方法萃取一遍，假如在这个洗脱液中能检测到另一比例的分析物，那就知道了在清洗环节中有一部分的分析物被洗脱了。另一个方法是把标准品按样品解决方法走一遍。但该方法不够严谨，由于基质会影响分析物的行为。问：这些建议挺好的。我怎么分析残留在萃取管中的分析物呢？答：在开始的洗脱环节后你要用大量的洗脱液冲洗萃取管，这样也许洗脱更多的分析物。经常要用到洗脱能力更强的洗脱液。考虑一下这部分分析物为什么会有强残留。是与残留硅羟基作用吗？--改变洗脱液的pH或缓冲能力。是因疏水作用吗？--增长有机相的比例或改用洗脱能力更强的有机相（如用乙腈取代甲醇）。是通过氢键与残留硅羟基作用吗？--在乙腈或四氢呋喃中添加甲醇或许有所帮助。问：OK，假如我在所有的环节中都没有发现丢失的比例，那么是否可以排除固相萃取过程的问题呢？答：是的。我们就要探索是否在其他配置过程丢失的。也许是强烈吸附在样品瓶上。强疏水的分析物也许会吸附道聚乙烯瓶的壁上。强酸物质也许与玻璃瓶表面的硅羟基结合。分析物也也许吸附在基质的固定相上，或者与基质的其他组分结合（如蛋白质）。这些情况下更难分离。综上，要使回收率尽量接近100%，建立方法的时候要有很好耐用性。尽管环境的影响也许导致回收率反复性不好，但是其几率要低于耐用性不好的方法。假如你能在开始的时候就能达成好的回收率，那么洗脱液组分或装填物质的较小变化都不会影响你的方法。唯一也许改变回收率的是SPE柱基床的质量。假如基床上有个空隙，流速将不均匀。分析物也许较早的就冲出管子。你可以粗略的观测下你的设备避免这个问题。空隙对方法的影响是非常明显的。6峰形拖尾因素Q：如何才干避免拖尾?A：一方面要找到拖尾产生的因素，拖尾通常是由于柱外接口体积扩大，柱床污染以及被分析物与键合活性位点互相作用而产生的．显然要解决问题必须对症下药．Q：如何检查拖尾的因素？A：一方面要仔细观测色谱图，在不知道样品的性质和色谱条件的情况下，色谱图可以提供很多线索，再借助其余的条件可以验证基于色谱图的猜想．第一检测峰高。假如你使用了紫外检测器并且峰高在1AUFS（Absorbanceunits,fullscale？），可以猜测是柱子过载了．一般情况下,化合物的extinctioncoefficients是1000．为了确认是否真的过量,我们需要知道进样量是多少.通常孔径为100埃的全多孔填料的限度为100ug.以上都是一般的经验方法，可以再进１／１０浓度的样品看看峰形是否有改善．Q：好的，但是假如在低浓度情况下仍然有拖尾怎么办？A：同样要仔细观测色谱图．假如图谱中有很多峰，看各个峰形是保持一定的拖尾限度还是随着时间推移峰形有一致的变化趋势．假如图谱中前面的峰比后面的峰拖尾的更厉害，可以考虑柱外效应的影响．柱外效应对峰的影响与峰宽成反比，所以对前面的峰影响比后面的峰影响大。2种柱外效应值得考虑1柱外峰展宽2detectortime-constant在连接管路，进样器和检测器的峰展宽可导致色谱图中前面峰的拖尾。你有没有使用与柱子不配套的管路连接到仪器上？最近有没有更换系统的管路。假如换了你要查看下管路的类型。（进样器到检测器应使用内径为9/1000’’的管路，1ˊ=0.3048m1〞=25.4mm）此外要检查所有连接管路是否都合适。通常柱外效应产生的因素是不同厂家使用了不同长度的管路来连接箍头和柱子。在5um色谱柱中，15ul的柱外峰展宽的差别会导致峰形产生3ml的明显改变。大的constant-time也能导致前面的峰比后面的峰更加拖尾。默认的时间是1s，假如用的是5um的色谱柱，也许有2-3min的失真。时间越长影响越大。假如色谱图中所有峰的拖尾限度大约一致，那么有2个也许：1柱床损坏2图谱中所有样品组分化学结构类似，拖尾是因化学效应产生的第一种情况，要检查柱子是否损坏，按标准条件最佳是按厂家推荐的方法做。通常柱子也许是吸附了一些污染物或颗粒，用适当的溶剂可以洗脱掉（如反相柱用THF），但是假如是柱床改变了就不也许修复了。第二种情况，化学作用也许是拖尾的因素。假如色谱图中只有一些峰是拖尾的而此外的峰形是好的，那么很有也许是化学效应导致的拖尾。问：这些化学效应是什么东西？请帮我说明一下!答：化学效应有好几种，最常见的就是分析物与不均一的活性表面的互相作用。典型的就是强碱在反相柱中的拖尾。这种类型的化合物能与填料表面的残留硅羟基和键合相发生强烈的作用。假如硅羟基基团在填料表面形成一个不均一的簇落，拖尾就发生了。问：我怎么样才干排除由化学效应导致的拖尾呢？答：一方面，要考虑一根不会产生这种现象的柱子。一些新设计的反相填料可以尽量的减少碱基的拖尾。第二，调节流动相的pH或者在流动相中添加有机基团与分析物竞争结合活性位点都能改善拖尾。这是由于硅羟基亲和作用重要是离子互换反映。在酸性pH下，很少的硅羟基带负电，所以带正电的分析物就不怎么拖尾。三乙胺经常用作竞争基团。但是在所有的竞争基团中，疏水性越强作用越好，例如正辛烷和四丁基铵盐。假如硅羟基亲和作用不是离子互换而是氢键结合，可以通过改变溶液的氢键结合性能来改善峰形。例如作为流动相的有机改善剂来说甲醇比乙腈的作用更好。同样的情况也可以在正相色谱中碰到。可以采用同样的措施来克制拖尾。在流动相中添加乙醇或乙腈作为极性改善剂能对拖尾产生明显的改变。此外尚有一些拖尾的因素，但碰到的比较少。样品污染物吸附在柱头筛板或进样器中也有碰到的。也有也许分析物在色谱分析过程中发生化学变化，如分析物降解或不同分子形式之间缓慢平衡等。7正相色谱问：我总是用反相色谱而尽量避免正相色谱。由于我的同事和我说正相比反相难。是真的吗？答：很不幸，这种说法的确有一定的对的性。但是只要掌握了对的的知识就可以解决一些困难了。最常见的问题是保存时间的改变。这种改变通常是由于流动相中的一些强极性的物质导致的，特别是水分。也有也许是甲醇和乙腈，它们通常被加入到流动相中以控制保存和选择性。水分总是或多或少的存在与所有的有机溶剂中，含量通常是ppm级。表1是正相使用的非极性溶剂中水的溶解性。所以假如没有通过特别的前解决的话，流动相中的水分含量就会差异很大。但是使用无水溶剂也不可取，由于要花费很长时间（报道说要数天）来使柱子达成平衡。具有饱和水的溶剂也不行，水分会聚集在填料孔中，色谱柱就变得不均一了。所以我们要的是一个水分含量适中并且可控的溶剂。一个在用的可反复的办法是制成水半饱和的溶剂。方法很简朴。把溶剂两等分，一份制成水饱和的。大约是加1-2mL的水到500mL的流动相中，然后搅拌半小时，除去多余的水，两份再混合。这就把本来的无水溶剂变成水半饱和的溶剂了。表1溶剂中水的溶解性溶剂百分含量（%W/W）温度（℃）正己烷（Hexane）0.011120庚烷（Heptane）0.009125异辛烷（Isooctane）0.005520甲苯（Toluene）0.033425二氯甲烷（Dichloromethane）0.198025氯仿/三氯甲烷（Chloroform）0.072023四氯化碳（Carbontetrachloride）0.010024邻二氯苯（o-Dichlorobenzene）0.309025乙酸乙酯（Ethylacetate）2.940025乙酸丁酯（Butylacetate）1.860020二乙醚（Diethylether）1.468025甲基叔丁基醚（Methyl-t-butylether）1.5000用半饱和流动相柱子能比无水流动相更快的平衡，但是仍然需要数小时。所以最佳是一根柱子专用一种流动相，这样几分钟就可以平衡了。显然流动相中极性改善剂也要好好控制。例如，假如用甲醇，那么只需要用很少的量（＜0.5%），并且稍微改变一点都会引起保存的很大变化。这种情况使用极性小点溶剂如异丙醇或乙醇会比较好，或者也可以不使用乙醇而采用低极性的醚类或酯类。这些都可以显著的影响分离的选择性。问：我注意到你在正相色谱中更多的关注流动相的组分。能说说固定相吗？固定相之间有优劣之分吗？答：的确是有分别的。纯硅胶和氧化铝是亲水性很强的，所以对流动相中的水分非常敏感。而接有极性键合相的，如CN-，二羟基-和氨基-等则不那么敏感。基于保存时间的反复性，开发方法的时候更多的是采用后者。这些键和相的有些特性必须了解。例如，在通常的正相条件下，氨基柱表面的初级氨基基团（α位？）很容易和醛基或酮基形成希弗碱/亚胺（Schiff-base/imine），所以氨基柱不能用来分析具有醛基或酮基的样品。氰基柱在非极性溶液中非常耐用，但是一旦接触中性的溶剂如纯乙腈，THF或甲醇等就会发生柱床坍塌。这种情况也许在冲洗样品碎片堆积在柱子中产生的污染时碰到。按我们的经验，在冲洗的过程中最佳保持恒定的高流速。低流速或用这些溶剂保存柱子更也许导致柱床坍塌。氨基柱假如接触水溶液会有很大变化。填料空隙中高密度的氨基基团会相成一个强碱性环境，从而导致键合相水解。所以再用回正相流动相后，千万不要奇怪色谱柱性能的明显改变。这些极性键和柱和纯硅胶柱，氧化铝柱同样都是非常通用的，所以不能说谁比谁好。这些柱子都有特异的选择性，彼此都不同。纯硅胶柱对碱性物质有强保存，氨基柱对酸性物质有强保存，氰基柱和二羟基柱则适合中性物质。二羟基极性比氰基更强，所以通常保存更好。同反相柱同样，不同品牌的同一键合相的柱子也有着明显的差异。除了硅胶不同，键和技术以及末端封尾技术都不同样。单官能基，双官能基或三官能基的硅烷都有采用的。假如采用了多官能团的硅烷，那么就要用不同的覆膜技术从而导致单层覆膜或多聚覆膜。氰基柱不一定是末端封尾的，氨基柱和二羟基柱通常没有末端封尾。所以和反相柱同样，品牌A和品牌B的分离表现是不同样的。参考书籍：TechniquesofChemistry,Vol.II,OrganicSolvents,PhysicalPropertiesandMethodsofPurification,ThirdEdition(1970),JohnA.RiddickandWilliamB.Bunger,Wiley-InterscienceMerckIndex,EleventhEdition(1989),Merck&Co.,Inc.8系统体积，死体积，滞后体积（DwellVolume）问：我经常碰到一些名词如系统峰展宽，系统体积，死体积，滞后体积等等，能不能给我解释一下这些名词？答：非常乐意。当我们说到这些名词的时候，我们要清楚的定义他们。我们将会看到，他们非常的不同并且能影响色谱分离的不同部分。从死体积开始，也叫做柱外体积，这样叫也许清楚一点。他是色谱系统中进样点到检测点的体积，但是要除去色谱柱填料的体积。他涉及进样体积，进样针体积（injectionvolume和thevolumeofinjector的区别？），柱前和柱后连接管路的体积，柱头体积（涉及滤片）和检测器的体积。精确点说，涉及一半的进样体积和一半的检测器体积。我们关注柱外体积是由于它会导致柱外峰展宽。峰展宽即峰在流过柱外体积的后变的更宽了。这也许会破坏柱子的分离。我们尽量减少柱外峰展宽。问：我们怎么测量柱外体积和柱外峰展宽？答：要完整的测量柱外体积和柱外峰展宽需要用到特殊的设备。这是由于它包含了柱头和滤片的体积，对用户来说这难以测量。我们只能信任柱子厂家做了充足的工作使柱外体积降到最小。我们容易测量的是色谱系统中的柱外体积。我们只要用一个0死体积的接头代替柱子，然后进小量样品记录图谱，就可以知道了。图1是一个例子。在这张图中我们可以测定柱外体积和柱外峰展宽。柱外体积等于进样点到峰中线的距离，我们只要计算峰的起点就可以测定柱外体积了。但是我们的结果不是非常的精确，并且不能简朴的把进样点到峰最高点的距离当作是系统的死时间。图1我们可以用峰的相对偏差来衡量系统峰展宽。峰的相对偏差可以通过峰尾（？secondmomentofthepeak）时间计算出来。一个容易的方法是测量峰宽。由于峰是高度对称的，所以测量越靠近基线的峰宽结果越真实。例如4.4%峰高处的峰宽相称于5个相对偏差。问：OK，我应当用什么样品和流动相来检测呢？答：流动相用你平常分析的就可以，样品要用标准品。但是一般标准品浓度比较大，所以要稀释以获得小的柱外峰展宽。这样做你就能得到一个实际色谱条件下的柱外峰展宽。此外你也可以用一个通常的方法来标准化这个测量过程。这有个缺陷就是你也许会错过一些你在实际分析过程中碰到的问题。我几年前碰到过一个例子，样品与进样器强烈的作用。尽管我们找遍了所有能导致峰展宽的因素，但是在标准化的测试中还是没有解决。后来用不同的样品和流动相才找到因素。问：这些是关于柱外体积和柱外峰展宽的，那系统体积和滞后体积呢？答：我不太喜欢“系统体积”这种说法，比较模糊。你也许会碰到系统死体积或系统滞后体积。我们要抛弃系统体积这种说法，代之以柱外体积和梯度滞后体积。后者也被叫做梯度延迟体积。它是指梯度混合点到柱头的体积（它也存在于等度色谱中，但在那里不重要）。梯度滞后体积涉及梯度混合器体积，接泵的管路体积，泵头（？pumphead）和单向阀的体积，泵与进样器之间管路体积，进样器体积，进样器到柱子管路的体积。看，在这些组件中体积挺多的。当你开始运营一个梯度时，需要花费一些时间把这些体积排掉再让梯度进入柱子。在这个时间内，色谱峰是在先前的流动相中做等度迁移。假如不同仪器之间的梯度滞后时间差别足够大，这个等度迁移将足以影响色谱图，特别是前部分。另一个恼人的影响是你的实际分离也许会被明显推迟。假如系统有2mL的延迟体积，梯度流速为200uL/min，梯度将需要10min才干到达柱子。你的分析也因而推迟了10min。问：我应当怎么测量滞后体积？答：同样，卸掉柱子，接二通。用甲醇和10mg/L的对羟基苯甲酸丙酯甲醇溶液跑台阶梯度，接紫外检测器。你会得到一个S形的图。然后测量从梯度开始到台阶一半高的时间之差。把这个时间乘上流速就是梯度延迟或滞后体积。问：有没有什么文献有这些定义的？答：许多教科书都有一些章节定义这些色谱名词的。权威的是国际理论和应用化学联合会分析化学协会分析命名委员会。我确信在他们最新的正规命名出版在理论与应用化学中，Vol.65,No.4,pp.819-872,1993.不幸的是不是所有的名词都有解释，比如滞后体积就没有收录，而有些定义还是比较模糊。9梯度方法转移问：我开发的一个方法在我的系统上反复性非常好，但是在其他系统上就不同样了，怎么回事？答：有时候换色谱系统时梯度方法会出现一些问题。除非系统完全同样，否则保存时间总有些变化。通常这个时间的变化都在分离度的范围之内，忽略它，方法还是可以用的。此外，假如适当了解潜在的因素，可以调节梯度在不同的色谱系统中得到相同的效果。另一个涉及到这个问题的是梯度滞后体积。它是从梯度混合处到柱头的体积。当你进样开始分析后，梯度并没有到达柱头，还要等滞后体积排空后才到。这就是说样品在开始一段时间是等度迁移的。由于不同系统的滞后体积是不同的，所以保存时间就不同样了，有时候还是影响到分离度。另一个因素是梯度自身，由系统与系统之间的组分差异导致。对于现在大部分的色谱厂家来说这个问题都不是很严重。但通常，在输送等比例的流动相（50%A和50%B）时精确度最高，比例相差大（5%A或95%A）时精确度就会受损。问：怎么知道我是哪种情况呢？答：最简朴的做法是比较一下两个系统的梯度。卸掉柱子，接二通。（在梯度的B溶液后接一个紫外检测器）。假如用的是反向色谱，可以在B溶液中加10mg/L的对羟基苯甲酸丙酯。两个系统都开始运营梯度，记录基线。然后比较一下两张图谱。你要找到梯度开始的位置，测量梯度图谱。假如梯度是线性的，只要测量梯度的斜率就可以了。很也许你会发现两台仪器的梯度开始时间不同样，图谱非常类似，梯度结束时间有一定的改变。这种情况就是说两台仪器的梯度滞后体积不同样。问：假如是这种情况，有没有简朴的方法抵消滞后体积的差异呢？答：有一个办法大部分时候可以采用。假如新系统的梯度滞后体积小于转移前系统的体积，可以在梯度开始加一段等度。假如新系统滞后体积大，这种情况就比较困难。原则上你可以先开梯度，延后一段时间进样，这段时间要与两台仪器的滞后时间差一致。但在自动系统中就不能这么做，自动系统中是进样触发梯度开始的，这时候也许需要手动基线归零或重新开发方法。问：在我花费时间开发方法后碰到这种情况可真不乐见啊。我以后该怎么做来避免呢？答：你可以在最终使用的仪器上开发方法。这也许需要一些预见与计划，但通常还是可行的。你需要做的是了解新系统的性能，要知道系统的两个基本情况：梯度滞后体积和比例精确性。你可以在同一个实验里得到这两个数据：如前所述，在B溶液后加紫外检测器，设立一个多阶层的梯度，B溶液以5%的幅度从0%变到100%，流速与平常同样，应当是1mL/min吧。每段梯度大约保持5min。然后接二通运营梯度，记录图谱。每段梯度设立的时间与实际发生的梯度时间之差就是梯度延迟时间。阶层的高度可以用来测量流动相比例。这些阶层也许有点模糊，那是由系统中混合体积导致的。检测完系统，就可以按照它的性能来设计方法了。正如我前面提到的，最大的问题是梯度滞后体积。假如你知道新仪器的滞后体积比开发方法的仪器大，就要自觉的在方法前加一段等度来抵消这一差别。假如目的系统滞后体积小，你就要在转移方法的时候在方法开始加一段梯度延迟时间。假如比例差别是在梯度运营中间出现的，相信你也可以通过调节梯度图谱来抵消这种差别，但是我历来没有碰到过需要这么做的情况。这个讨论是假设柱子已经用初始流动相充足平衡了。有时我会碰到这样一些情况，在平常分析中，梯度变化不久，而柱子没有用初始流动相平衡好。这样第一针时总是与后面的不同样。这也许是加快方法的缺陷，但是假如转移到有不同样滞后体积的系统时，也许就会产生一些问题。10系统堵塞问：我的系统压力比它应当的压力高很多，是什么因素？答：一方面，让我们检查一下你的前提，你怎么知道压力应当是多少？问：之前同样的柱子，同样的流动相，同样温度压力只有2023PSI。现在是两部了。我把泵压的上限设为4000PSI，泵停了。答：很好你有以前的参考数据，我们可以从这里开始排查故障。压力变大，因素很多。一方面，流动相的粘度也许不对。另一方面，系统某个地方也许堵了。后者比较常见，但是在我们拆系统前，先检查下其他的也许。你拟定你的流动相是对的？假如用的是自动混合，你溶液有没有放错？例如把甲醇和乙腈弄混了（由于两者与水混合液的粘度差异很容易导致压力不同）。假如使用了柱温箱加热，确认一下它有没有工作。温度每变10℃粘度变化25%。所以假如你本来要开60℃，但是柱温箱没有工作，这样压力就会翻倍了。问：OK，这个很容易检查，其它尚有哪些要检查的？答：我经常问这个问题，压力变大是在长期分析中慢慢出现还是忽然出现的。假如是忽然出现的，也许是有些错误发生了。让我们来检查一些东西，从简朴的开始：柱子填料的颗粒大小对不对？柱子压力与颗粒大小的平方成比例变化。假如你用5um的柱子代替10um的柱子，就可以解释压力的增长了。不是这种情况，那么就有地方堵住了。一方面卸掉柱子接二通，保护柱和柱前过滤器不要下下来。我们要检查的一个也许是流动相不相容，假如接分析柱在后面的操作中也许对其有损。不连柱子，检查压力，假如尚有1500多psi，那么是其他地方堵了，柱子是好的。我们可以在流路上一个一个断开看哪里压力最大。通常换一个部件比清洗更有效，但我们不是随时都有备用的，所以可以考虑清洗。假如我们知道要除掉的是什么东西，那么就很容易知道怎么洗。假设是滤头堵了，也许是上一次的流动相没有排完，与新的流动相不相溶导致的。也许是缓冲盐析出了。这种情况只要用能溶解析出盐的溶液冲洗堵塞部位一段时间就可以了。假如是分析柱或保护柱忽然堵塞，就要检查柱子的保存溶剂。保存溶剂也许与流动相不相溶而导致缓冲盐析出。或者柱子用含盐的流动相保存，而柱塞松动，导致流动相部分蒸发，有盐析出。这时要用能溶解该盐的流动相低流速冲洗柱子来恢复活性。问：我的情况是在运营序列中间忽然出现的，这是怎么回事呢？答：这种情况也许是系统的某部分被积累的小颗粒堵塞了。小颗粒也许来源于密封圈或样品，也许是样品不溶于流动相或者样品强烈的吸附在保护柱或分析柱（没用保护柱）上。这通常是样品中大分子量的组分，而你没有去除或者只是部分去除掉了，如血清样品中的蛋白质，制剂中的辅料或食品中的高分量组分。假如你用了柱前过滤器和保护柱，让我们依次下下来，测量系统压力。这样，我们应当可以不久找到堵塞的部位。假如是保护柱和柱前过滤器堵了，最佳更换掉。它们就是用来保护分析柱的。想要清洗它们接着使用是划不来的，由于下次它们也许就不能挡住那些污染物了，而柱子就要弄坏了。假如是分析柱堵了，最佳是清理一下。但是最佳的挽救是防止，考虑加个柱前过滤器，最佳加个保护柱。假如问题来自样品，就要把样品过滤，或者用固相萃取除掉污染物。假如有备用的柱子滤片，换掉柱头进口的滤片。没有就把它拿下来，超声清洗。这只对硅胶柱有用，假如是聚合柱（polymericcolumn），它的填料是有内压的，你一拿开滤片填料就会泄漏出来。这时假如手头有备用的滤片，就要快速的更换并重新封好柱子，假如没有就不要开聚合柱。假如更换或清洗后压力没有减少，那么也许是有东西吸附在填料表面或者渗透到了柱子中间了。这时就要用能溶解或解吸取潜在污染物的溶液低流速冲洗柱子。柱子厂家都有介绍用一系列强度递增的溶液来完毕这个工作的。对反相柱来说，可以采用如下程序：水，甲醇，THF，二氯甲烷，甲醇再回到水。对正相柱程序的极性相反：二氯甲烷，THF，水，甲醇，二氯甲烷。假如还是没用，可以考虑反向冲洗柱子。但是到了这个时候最佳拿起电话去订购一根新柱子。11色谱柱塔板数问：我运营我的方法检测柱子的塔板数是8000，但是厂家的报告书上说有13000，怎么解释这个差别？A：色谱柱的塔板数不是不变的。一根柱子的塔板数和流速，流动相的粘度以及分析物的分子量有关。仪器也许也会影响检测，但是我们现在不考虑它。柱子厂家设立了一个检测柱子性能的标准方法。反相色谱通常是检测一些简朴的疏水化合物，如甲苯，萘或苊，流动相用高比例的有机相，这样，流动相的粘度就低。但是大多数的液相工作者更常碰到极性分析物，这需要高水相的流动相，粘度就变大了。在通常的色谱条件和流速下，粘度增长，塔板数减少，所以实际检测的塔板数比厂家测试的低。问：假如通常条件下检测的塔板数比厂家报道的低，是不是厂家在故意误导消费者呢？答：不是这个意思，这个不是报告的目的。厂家设计的程序是用来检测柱子性能的，它能表现色谱柱的最高塔板数或接近它。这就是为什么色谱柱填料技术影响最大。所以假如我要检查填料技术，就是通过这个来检查的。问：请再解释一下为什么塔板数随流速，填料变化？怎么变化的？答：所有关于塔板数的参数的变化最后都可以归因于理论踏板的高度变化，而理论踏板高度取决于理论速率。我会适当展开说明的，但是为了深刻的理解还是让我们先看看色谱教科书是怎么说的。柱子的塔板数等于柱长L除以理论踏板高度和颗粒直径大小dp（方程1）柱长和颗粒大小都是拟定的（已知）。理论踏板高度取决于理论速率，定义如下（方程2）等式中u是线速度，Dm是样品在流动相中的扩散系数，dp是颗粒直径大小。大多数液相的理论速率是3-20之间。理论上有好几个描述理论踏板高度与理论速率的方程式，在我们讨论的流速范围内，它们的结果都是一致的。所以我们选一个最简朴的看看，它是基于van-Deemter等式。（方程3）扩散系数是反相条件下从大量数据推导出的一个经验数据。这个曲线描述了在这个关系下当理论速率等于2.5时有个最小值。初始扩散系数是检测填料一致性的，因此它涉及到装填过程。塔板数与理论速率的关系如下：（方程4）由于由理论速率决定的等板高度(HETP,Heightequivalentoftheoreticalplate)有一个最小值，所以有理论速率决定的塔板数有一个最大值。一些计算表白最大塔板数大约是L/2.3dp。所以我们可以说一根15cm长，5um颗粒半径的柱子最大塔板数能有13000就是一根好柱子。差的填料对方程3的第一个系数影响很大，而对其他的几乎没有影响，结果基本同样。这就是为什么测试柱子时测的是接近最大塔板数。现在开始问题的第二个部分，流速对塔板数的影响。我想用理论速率来代替流速，他们差别不大，由于理论速率同线速度成比例，而线速度同流速成比例，所以塔板数与流速成比例。在流速非常小和非常大时塔板数都很低，那么最大塔板数肯定在中间某个流速。但是在哪呢？正如我们在理论速率的定义方程式2中所见，理论速率涉及分析物在流动相中的扩散系数。在上面的结果我们看到，最大塔板数发生在理论速率是2-3之间。对于柱子测试经常用到的疏水分析物，流动相通常是70/30v/v乙腈/水，5um的色谱柱线速度是1-1.5mm/sec。该线速度下直径3.9mm的柱子流速是0.5-0.7mL/min，4.6mm的柱子流速是0.7-1mL/min。鉴于该曲线的最小处取决于扩散系数，我们要知道流动相对扩散系数的影响。理论上有些方程有助于我们估算分析物在特定溶液中的扩散系数（如Wilke-Chang方程），但是对现在讨论来说我们只要知道扩散系数同流动相的粘度成反比就可以了：（方程5）这表达最大塔板数时的理论速率（或流速）随着粘度的增长而减少。70/30v/v乙腈/水的粘度是0.7cP，50/50v/v甲醇/水的粘度是1.8cP。当我们用甲醇/水流动相时，最抱负的流速就要降到0.2-0.3mL/min（3.9mm，5um柱）或0.3-0.4mL/min（4.6mm，5um柱）。开发方法的时候要注意这点。扩散系数取决于溶液粘度可以得到一个有趣的侧面推论。我们可以用下面这个常识来估算柱效：当流动相组分改变了，假如在不同的流动相中压力同样，那么柱子的塔板数也同样。一个值得记住的规则！12柱压问：我用的柱子是4.6mm*150mm5umC18柱。流动相是50/50的甲醇/pH7的磷酸缓冲液。1.5mL/min的流速时压力是3000psi，正常吗？答：稍微有点高，不是很严重。我估计柱子自身应当有2400psi的压力，加上连接管路200psi应当是2600psi的压力。我想，你的柱子也许稍微有点堵塞了。问：很有也许。我也怀疑堵了，所以问你。你怎么估算2400psi是“估计”的压力？答：我是通过Kozeny-Carman方程计算出来的。它与所有刚性填料（incompressiblepackings）（如硅胶填料）的液相色谱柱都吻合的很好。Kozeny-Carman方程中压力与流速F，粘度η，柱长L，柱半径r和颗粒直径dp有关：（方程1）压力与流速，粘度，柱长成正比，与柱半径的平方，颗粒直径的平方成反比。比例因子f取决于空间比例（颗粒间的空间）和填料密度。刚性填料装好后密度几乎不变，空间比例就是40%。这根柱子的f因子就是1000左右。问：OK。我算算我上面柱子的压力。我知道流速，柱长，柱半径和颗粒直径。粘度是多少呢？答：纯溶剂的粘度可以在一些手册上找到。对于非缔和溶液（non-associatingsolvents），可以假设它们与体积比例成线性变化，从而大约推算出来。对于水性溶液就不能这样推算。大多数有机溶剂和水的混合液有一个最大粘度。常用的混合液粘度如图1所示。（图1）图1：不同比例的水与有机溶剂混合液的粘度。其中：MeOH=甲醇，MeCN=乙腈，EtOH=乙醇，THF=四氢呋喃。室温下，50/50的甲醇/水混合液的粘度是1.8cP（=0.018P）。水和低浓度缓冲液的粘度与此相差不大，所以可以用图中水/甲醇的粘度来代替。那么压力计算如下：最后一项10*-6是大气压转换系数。不要忘了把流速除以60，单位就是mL/s了。这样单位就同样了。把大气压转换道psi，乘以14.7。得到结果是2388psi，相称于2400psi了。问：受益匪浅。现在让我们回到柱子。看起来仿佛有地方堵了，我该怎么做呢？答：最简朴的是更换入口滤片。这很有希望减少柱压。事实上你也可以把旧的滤片超声清洗。假如更换滤片不能减少柱压，就也许是填料堵了。不管是什么堵在填料里，你都可以通过几个冲洗程序来除掉它，但是工作量比较大。鉴于压力只是增长了一点点，也可以接着用直到压力到了系统的压力上限再解决。也可以试着找到压力增长的因素，尽量避免再次发生。通常在进样器和分析柱之间接个保护柱也可以解决这个问题，至少可以延缓压力的增长。问：OK，我会更换滤片的。假如不行我想清洗柱子，应当怎么清洗呢？答：一方面要用5-10倍柱体积的水把柱子中的缓冲液置换掉，你这根柱子大约要10-20mL水。然后换到100%甲醇清洗大约15min。以上程序都可以用高流速，由于你的柱子没有完全堵塞。我会用1.5mL/min。让我们检查一下在甲醇中的压力，甲醇的粘度是0.6cP，所以1.5mL/min的甲醇压力应当是800psi左右。假如压力还是很高，用四氢呋喃（粘度0.5cP）或二氯甲烷（粘度0.4cP）冲洗，或者一起冲洗。每一种溶剂大约20mL左右，假如这个体积内不能除掉，那么这个溶剂都不太容易除掉。最后回到开始的流动相。你要保证接下来的流动相与前一中溶剂是互溶的，所以你需要从二氯甲烷到甲醇到水（或50/50甲醇/水）再到甲醇/缓冲液，然后再平衡柱子。你的实验中流动相比较简朴，不久就可以达成再平衡。假如用到离子对试剂就要花费长一点时间来平衡柱子了。13峰面积变化问：同一个样品反复进样时，为什么峰面积会变化呢？答：很不幸，因素很多，太多要考虑的。几乎液相的所有部位都能引起峰面积变化，让我们依次来看。一方面是进样器，进样器出不同的故障，你就会碰到不同的问题。但是所有的故障中，有气泡是最重要的一种。假如是手动进样，保证注射器里面没有气泡。有定量环的保证气泡没有虹吸到进样环。自动进样器中假如进样体积比较大，而瓶盖垫子能很好的包裹住针的话，就会产生一段真空，气泡就会生成了。气泡的产生会导致进样之间体积的不规律变化。假如样品之间的浓度相差很大，而进样2-3针后同一个峰的峰面积保持不变，那么也许是样品残留。手动的话每次进样后都要把注射器好好清洗一下，自动进样器先看看洗针液，保证它能很好的清洗分析物。峰面积的减少也有也许是温度引起的，但是这个影响很小，小于2%。假如你把样品从冰箱里拿出来放到进样器里，它会慢慢的升温，体积就会变大。这样前后的进样体积就有差别了。流速的随机变化也会导致峰面积变化。这通常是由阀门的故障检查或泵头的空气，空穴导致的。通常还随着着保存时间的改变。你可以通过观测压力来确认是不是这个问题。多大的改变可以接受取决于峰宽。假设两个泵的流速差别有10%，峰宽有20个泵冲程，那么因泵的脉动而产生的峰面积变化只有1%，但是假如峰宽只有1个泵冲程，那么峰面积变化就有10%了。流速改变的另一个潜在因素是系统高压部位漏液了，这个应当很容易发现。积分错误更加难以解决。软件对峰积分的一些大的变化稍微检查一下就可以看到，但是更多的细微的变化则很难发现。信噪比100以下的拖尾峰经常会有明显的积分错误。通常，基线噪音限制着积分的精确性但是当碰到前沿峰或拖尾峰时，问题变得更糟。你可以试着更改积分参数，重新解决数据，看看能否弱化这个问题。复杂样品中假如有肩峰（与目的峰局部分离），软件就很难判断基线在哪里。这时采用手动积分或者用强制基线自动积分将会改善积分的重现性。样品自身也会导致峰面积变化。在反相色谱中发现有些蛋白质在开始的梯度中不能完全洗脱，残留的会出现在接下来的空白梯度中。这些鬼峰只在特定的蛋白质和洗脱程序中出现。假如是这样，就要在分析样品后添加空白。此外，蛋白质会不可逆的黏附在有些柱子内，随着进样的增长，样品的峰面积会慢慢变大。据推测，有些蛋白质是结合在填料的活性部位，一旦这些部位饱和了，峰面积就能反复了。你不一定用你分析的蛋白质来饱和这些部位，有报道此外一些蛋白质也有饱和的作用。检测器会间接的影响峰面积，峰积分的好坏取决于信噪比，当峰的信噪比最大时峰面积的反复性最佳。流动相很少影响峰面积，当流动相的组分改变时它更多的是影响保存时间而不是峰面积。鬼峰或者倒峰倒有也许是因流动相影响积分而导致的，这和其他的干扰同样。用流动相溶解样品就能避免。问：我该盼望一个如何的峰面积反复性呢？答：除非受限于信噪比，否则反复进样峰面积的相对标准偏差一定会低于1%，0.2-0.5%都可以达成。当用到内标时，计算分析物和内标的峰面积比，反复性会更好，但是即使你用这个方法也不能把RSD降到比0.1%还低很多。14鬼峰问：我进空白的时候出现了一个峰，它从哪里来的？答：鬼峰也许在几个不同的情况下出现，下面我们来讨论导致鬼峰的不同因素。一方面，等度和梯度的现象不同样，所以下面的讨论要分两个部分。1等度色谱所限让我们定义一下你所说的空白。假如你进的是流动相，那么就不应当有峰，但是假如是其他的，例如你通常溶解样品的溶液，那么有峰出现是正常的。除流动相外的任何溶液都会干扰流动相和固定相之间的平衡，从而导致峰出现。回收流动相假如流动相中的组分有轻微保存，就会表现为保存峰，这些峰也许是正峰或倒峰。假如你回收了流动相并且使用了一段时间，你就会发现在你平常进样时样品峰的位置会有一个倒峰。前面进的样品聚集在回收溶剂里，固定相表面也部分覆盖着分析物。当你进新鲜配置的流动相或者其他的溶剂时，样品组分就会浓度局限性（相对于含样品的溶液来说），这个浓度局限性沿柱子流动，速度与其相应的峰同样，这样与通常色谱相反的图谱就出现了。这个现象叫做空穴色谱，这些峰叫做空穴峰。这是不回收流动相的其中一个因素。过载和沉淀假如进的样是和流动相同样，就要跳出柱子和流动相之外看看。例如也许是上一次过载引起的。看看自动进样器的洗针能否工作，手动的话确认注射器是否彻底清洗干净，针筒外面也要洗。会不会是前面的样品组分沉淀或吸附在进样器上？假如是这样，那么每次进样后这个峰就会减小。保证样品所有组分都能溶于流动相，最佳的解决办法是用流动相溶解样品。流路产生每一次进样都随着着一次压力脉动。假如在流路中有死角，例如压力仪的T型接头等，压力脉动会把死角的溶液带到流路中来，呈现为一个峰。通常这种峰比色谱图中的峰要宽。检查一下流路，尽量不留死角。2梯度色谱上面的因素合用与等度色谱，假如你是运营梯度，会有一些其他因素导致空白溶液中出峰。溶液杂质流动相中的微小成分和杂质会在柱子的初始比例平衡过程中富集在柱子上，当梯度中流动相洗脱能力变大时，这些东西会象样品同样从柱子上脱离。假如你的流动相有很多杂质，出来的图谱就会有很多的峰。问题的重要来源是水。水有很多途径带来杂质，涉及净化系统自身，存储容器和细菌生长等等。水净化系统要经常用反相梯度的空白基线来监视。此外，推荐购买HPLC级的水。即使使用高质量的溶液和溶剂，还是也许会检测到由溶剂自身导致的峰。这取决于你用的检测器，假如你用的是紫外检测器，就取决于检测波长以及检测器对流动相折射率改变的敏感性。使用高质量的溶剂，梯度背景更象一个圆包而不是一堆峰。含蛋白质的样品假如用反相色谱分析含蛋白质的样品，也有也许在空白中发现峰，它是由之前的进样带来的。峰面积会在接下来的空白梯度中迅速减小。除非没有进样，否则这种现象表白样品在进样器中过载了。进样器甚至也许会被弄掉线。这是由于有些蛋白质在开始的梯度中不完全溶解导致的。例如在特定条件下只有2/3的卵蛋白素溶解在开始的梯度中，在接下来的每一次梯度中都有大约相同数量的卵蛋白素溶解到流动相中，通过几次运营之后卵蛋白素的含量就变的微乎其微了，这种现象就是很典型的由蛋白质导致的。在我的印象中，还没有发现过小分子化合物有这种现象。总结知道上面这些鬼峰的因素之后就可以采用适当的防止措施来避免这些问题。15pH对保存时间的影响问：我在做一个样品分离的时候发现对pH的变化非常敏感。这是一个简朴的反相方法，没有用离子对试剂，但是日间的保存时间经常改变，我发现是由pH的细小变化导致的，怎么会这样呢？答：从你的描述可以推断这是一个离子型分析物，它的pKa与流动相的pH很接近，所以你面对的是分析物的两种形式，它们的保存时间明显不同，也许是比如酸的质子式和非质子式。带电型的保存比非带电型的保存低很多。两者处在平衡状态，这个平衡由pH决定。pH的微小变化导致分析物两种构型的比例变化，从而导致保存时间变化。因此很有必要严格控制pH。既然你已经做了一些实验，应当得到了足够的数据，知道了pH与保存时间之间的量化关系。假如没有，做一些对比实验来得到这个结果。此外你也可以查查方法的开发记录，这个信息在方法耐用性测试时应当会出现。一旦得到了这个量化关系，你要拟定什么限度的保存时间的变化是你能接受的，然后由此计算pH的调节精度。即使在很严格的情况下，+/-0.02个pH单位的精度应当足够了。问：很难把pH调的那么精确，我只加一点点酸，pH就变化很大答：很不走运，这表达你没有用缓冲液。缓冲液的定义是加入少量的酸或碱时能缓冲pH，就是说添加酸或碱时pH的变化很小。这个保持pH的能力就叫做缓冲能力，它是由缓冲液的浓度和缓冲盐的pKa决定的，缓冲盐在pKa附近的缓冲能力最大。表1列出的是液相中一些常用的缓冲盐的pKa。注意这是在水中测的，没有加有机溶剂。当加入有机溶剂时，pKa会有所变化，但是通常所有化合物的pKa，涉及你的分析物的pKa都会有同样的变化。对于液相常用浓度来说，缓冲液应维持在缓冲盐的pKa的1.5个pH单位左右，当浓度特别稀的时候，如低于5mM，就要把范围缩小，大约+/-1个pH单位。很不幸，我经常碰到一些方法完全忽视了缓冲能力。一个例子是pH4.5的KH2PO4溶液，这不是缓冲液，这是盐溶液。看看这个表，磷酸盐的pKa是2和7左右，4.5正好在中间，磷酸盐在这个pH怎么也不也许有缓冲能力的，你需要用另一种缓冲液，例如醋酸。同样，pH7的醋酸铵也是一个盐溶液而非缓冲液。由于醋酸铵易挥发，能用于质谱检测器，醋酸铵的使用多起来了。但是在pH7的时候它不是缓冲液，所以你还不如不用它，除非你有其他理由需要盐。表1：常用缓冲盐的pKa值（25℃）缓冲盐pKa醋酸盐4.75铵盐9.24硼酸盐19.24硼酸盐212.74硼酸盐313.80柠檬酸盐13.13柠檬酸盐24.76柠檬酸盐36.402-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）6.15草酸盐11.27草酸盐24.27磷酸盐12.15磷酸盐27.20磷酸盐312.38三氯乙酸0.52三乙醇胺7.76三乙胺10.72三氟乙酸0.50三羟甲基氨基甲烷（Tris）8.08问：如何才干改善这个方法？答：假如pH拟定了，是用错了缓冲盐，那么从表中选一个合适的就可以了。通常替代的盐不会影响分离，有影响的话就要此外调节一下。有时，替代的缓冲盐不合用于检测器，就像我们前面提到的质谱要用可挥发的盐。羧酸盐因背景吸取高，噪音大而不合用于低紫外检测。假如你不能找到此外一个适合你的检测器的缓冲盐，那你麻烦大了。你要么看着保存时间变化，要么在你用的缓冲盐的pKa附近重新开发方法。这个变化很大，所以你还得把这个方法优化一下。这听起来不太好，但是以后就不会有麻烦了。我通常建议在开发方法的时候一方面要选择缓冲盐和pH范围，然后用溶液的选择性微调分离。这个策略快速而高效，并且可以让你避免陷入缓冲液pH的泥潭。你开发下一个方法的时候应当考虑一下方法。16柱平衡问：我应当花多长时间来平衡柱子？答：一旦知道了基本原则，平衡柱子就很简朴了。平衡柱子所需的时间取决于柱子平衡前的状态，流动相组分的浓度以及这些组分的保存系数。你要知道达成动态平衡是不久的，事实上柱子不久就可以达成本底平衡。因此，平衡重要是受限于流动相组分进入或洗出柱子的速度。让我们先讨论柱子在新的流动相组分中的平衡。在平衡过程中，吸附在柱表面的流动相组分大约介于1-20umol/m2。一个典型的填料大约有300m2/g的表面积，典型的液相柱每mL柱体积有0.5g填料，这样每个柱体积的表面积就有150m2/mL，吸附的流动相组分的浓度是150-3000umol/mL。溶液的表面积浓度通常都比较高，以分子量为32的甲醇为例。固定相浓度以3mmol/mL计，每mL柱体积大约要100mg甲醇才干使表面积完全饱和。假设柱子内部没有一点甲醇，流动相甲醇比例是10%或更高，1mL流动相就可以将足够数量的甲醇带入柱子，为了充足平衡，可以加大2到3倍等等，然后柱子就平衡了。这表白高浓度的流动相组分可以更快平衡，这也是梯度色谱表现的象梯度的因素之一。相反，假如流动相浓度低，就需要长时间才干平衡。例如，假如柱内没有甲醇，流动相是1%的甲醇，就需要10倍柱体积的流动相才干将足够数量的甲醇带入柱子，这种情况下，不同流动相的平衡就变得很复杂。假如柱子之前是用乙腈平衡，现在要用1%的甲醇平衡。甲醇要替换掉吸附在填料表面的乙腈，这个平衡就没那么顺利，需要更常的平衡时间。但是我们可以先用高比例的甲醇冲洗柱子再换回1%比例来加速平衡。流动相组分的浓度越低，所需的平衡体积就越大。离子对试剂就是一个例子。它们通常的使用浓度是5mmol/L（5umol/mL），很巧的是它们的表面积吸附浓度也很低，介于1-3umol/m2。同前面同样计算得到每mL柱体积需要150-450umol的离子对试剂。离子对浓度是5mmol/L时需要30-150个柱体积才干将必需的离子对试剂带入柱子，充足平衡需要更多的流动相。因此，在我们讨论的第一种情况中，限制平衡时间的因素是流动相组分的浓度和它最终在填料表面的浓度。假如我们要加快平衡，增长关键的流动相组分的浓度应当有用。问：让我总结一下你说的。假如要用一个新的流动相组分平衡柱子，要考虑平衡柱子需要多少，有多少溶在流动相里，然后我们可以估算需要多长时间能将必需数量的组分带入柱子。但是相反的情况呢，我们要把柱子中的组分除掉时怎么解决？答：总结的很对的。在第二种情况中，决定平衡的因素是新流动相中吸附在填料表面的化合物的保存系数。常用的有机溶剂在通常的流动相中保存系数都很低，但是在正相色谱中的极性溶剂情况不同样。例如，当用甲醇和正己烷做流动相时，甲醇在硅胶柱上的保存系数是很大的。要将正相填料表面的甲醇除去，最佳是先用一个中档洗脱能力的溶剂冲洗，最佳的选择是正己烷，它通常用来调节溶液洗脱能力。假如是正己烷—乙酸乙酯流动相，应当先用乙酸乙酯冲洗柱子以除去甲醇，然后再用正己烷—乙酸乙酯流动相。假如知道了如何快速平衡柱子，我们就可以设计一个高效的平衡程序，因此了解柱子的历史状况也很重要。另一个强吸附的例子是离子对试剂。建议用过离子对试剂的柱子以后都用于含离子对试剂的实验，由于填料表面的这些试剂很难除去。两个因素导致它们强烈的保存在反相填料中：一个是疏水互相作用，另一个是极性互相作用。假如只用对付疏水互相作用，我们可以用强有机溶剂如THF来冲洗柱子，但是离子对试剂还能与表面硅羟基强烈作用。阳离子对试剂如四丁基铵盐特别难以去除。所以任何清洗程序都要考虑这些复杂的互相作用。没有特别的清洗程序，不也许把离子对试剂完全清除。一个最难的平衡问题是含水正相色谱的平衡。水分通常含量很少，但是它可以强烈的保存在正相填料中，特别是硅胶和氧化铝。就是由于水分的保存，那些无水烷烃流动相也许要好几天才干平衡。要除去硅胶中的水分，要用一系列的弱溶剂按程序清洗。一个也许的顺序是甲醇，乙酸乙酯，二氯甲烷，正己烷。这比用正己烷冲洗“湿”柱子更快。问：那么，假如低浓度的流动相不具有强保存成分时，应当不久就可以平衡了。但是保存时间仍然慢慢的漂移，是什么因素呢？答：这种情况应当不是平衡自身的因素，也许是其他的问题。是不是流动相比例因挥发而改变了？是不是实验室温度在慢慢变化？有也许是样品成分累积在柱子里，也有也许是柱子老化，比如固定相水解。后两种情况通常是归于柱子改性而不是平衡的范畴。我们将在一个独立的章节讨论柱子改性问题。17柱改性问：什么是柱子改性？答：上一章我们讨论了柱子平衡的问题。平衡导致的现象都是可逆的，但是柱子改性的却是不可逆的。柱子改性改变了柱子的性能，而这完全是你的责任。我一般建议不要把柱子改性，但是有时候是无法避免的。问：请给我举一些柱子改性的例子！答：第一个例子是一个常用的过程，但是我要指出的是我不推荐这样做的。假如你使用强酸性流动相，pH2或更低，末端封尾的C18柱，那么不久末端封尾基团就会水解，因而这个柱子有了比之前大的多的硅羟基活性。这也许会影响分离的选择性。有人用强酸性流动相开发方法，等到方法开发好了，柱子也变了。等用新柱子做同样的测试时，分离的选择性就也许不同样了。但是使用酸性流动相两三天后，分离也许又变回来了。这根柱子发生了永久的变化而厂家的说明书上是没有的。我建议不要用这个程序，但是有的实验室用新柱子这样做来获得柱子改性过程的细节。我建议改用非末端封尾的柱子来开发方法，避免以后柱子改性。另一个改性的例子是发生在氨丙基键合相色谱柱使用水溶液时，它通常在亲水互相作用色谱中用来分离糖类。典型的流动相是60-90%的乙腈/水混合液。当氨丙基柱第一次用于水溶液时，填料空隙处的高浓度氨基基团显碱性，导致硅胶和键合相缓慢的水解。随着时间的变化，可脱掉的键合相越来越少，最后就可以得到稳定的保存时间了，但是这根柱子与初始性能相比有了明显的变化，并且也不能再用于正相分离了，不能象以前同样使用水性流动相了。只要你使用氨丙基色谱柱分离糖类，改性的问题就无法避免，有的厂家提供专门的柱子来做这个。他们的柱子是已经改性好了的，由于厂家的改性的程序和说明都是拟定的，所以最佳还是购买已改性的柱子而不要自己改性柱子。另一个让人不快乐但是又无法避免的改性现象发生在分离蛋白质的时候，特别是在蛋白质体积排阻色谱中使用二醇基柱时。观测发现有些蛋白质开始进样的峰小于后面的峰，这是由于蛋白质非特异吸附到填料上导致的。为了避免这个，有人建议先进大量的蛋白质，如牛血清蛋白，来改性柱子，使活性位点饱和。通常我不推荐这个改性程序，你应当