分子生物学4复习知识重点

分子生物学4复习知识重点1、生物大分子：是指生物体内由分子量较低的基本结构单位首尾相连形成的多聚化合物。包括核酸、蛋白质和多糖。2、基因：DNA分子中含有特定遗传信息的核苷酸序列，是遗传物质的功能单位；是合成有功能的蛋白质多肽链或RNA分子所必需的全部核酸序列。3、结构基因：可被转录形成mRNA，并进而翻译成多肽链，构成各种结构蛋白质、催化各种生化反应的酶和激素等。4、断裂基因：编码序列不连续的间断基因，即编码序列在DNA分子中是不连续的，被非编码序列隔开，呈镶嵌排列的断裂形式。5、外显子：断裂基因中含有蛋白质编码信息的部分．每个外显子均编码一个完整蛋白质的特定部分．6、内含子：断裂基因中外显子的间插序列，可参与前体RNA的转录，但其转录的RNA序列于转录后的加工中被切除，不包括于成熟的RNA分子中．7、假基因：具有与功能基因相似的序列，但不能翻译为功能蛋白质的基因片段．分为重复的假基因和被加工过的假基因8、重叠基因：指两个或以上的基因共有一段DNA序列9、移动基因：是基因组中可移动的一段ＤＮＡ序列，可将其本身从基因组内的一个位置转移至另一位置．10、基因突变：是指一个基因内部可以遗传的结构改变，是基因分子内部在某种条件作用下所发生的一个或几个核苷酸的改变，导致结构蛋白或酶的改变，从而影响有机体的大小、品质、颜色、结构和生长率等性状的改变11、基因组：基因组就是一个物种中所有基因的整体组成，或者是一种生物所有染色体上的遗传物质．12、C值(Cvalue):通常是指一种生物单倍体基因组DNA的总量.13、单核苷酸多态性(SNP)：在基因组水平由单个核苷酸差异所引起的DNA序列多态性。14、C值悖理：生物的复杂性与基因组的大小并不完全成比例增加.15、基因载体：能将外源目的DNA导入受体细胞，并能自我复制和增殖的工具。其中为表达出蛋白质设计的载体又称表达载体。16、质粒：是位于细胞质中的一类独立于染色体的可自主复制的遗传成分，可赋予宿主细胞一定的生物性状。17、插入失活效应：因DNA片段的插入而导致编码基因失活的现象18、黏粒：一类由人工构建的含有λDNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。19、酵母人工染色体(YAC)：酵母人工染色体是将酵母染色体复制与分离所需的序列与大片段目的DNA连接而构成的，可克隆外源片段的长度可大于1Mb。YAC主要用于构建大片段DNA，特别是用于构建高等真核生物的基因组文库20、细菌人工染色体（BAC载体）：在大肠杆菌Ｆ因子的基础上发展起来的。BAC能容纳长达100～350kb的插入序列21、基因文库：是来自某生物的不同DNA序列的总集，这些DNA序列都被克隆进了载体，以便于纯化、贮存与分析。22基因组文库：存在于转化细菌内，由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合。 简称G-文库。23、cDNA文库：用细胞总mRNA 制备全套双链cDNA后， 建立的基因文库。简称c-文库。24、粘性末端：含有几个核苷酸单链的末端。25、同裂酶：识别相同序列的限制性内切酶，但它们的切割位点可能不同。26、同尾酶：识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。27、基因工程：在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA)，转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物。28、逆转录酶：依赖RNA的DNA聚合酶（RNA指导的DNA聚合酶）。29、亚克隆：是克隆实验中最简单的一种，即将已克隆的DNA片段从一载体向另一载体的转移，这一过程被称为亚克隆。30、核酸分子杂交：用标记的已知DNA或RNA片段（探针）来检测样品中未知核酸序列，通过核苷酸间碱基互补的原则发生异源性结合，再经显影或显色的方法，将结合核酸序列的位置或大小显示出来。31、增色效应：DNA变性后对260nm紫外光收增加的现象。32、减色效应：当DNA分子加热变性后，其260nm的紫外吸收会急剧增加的现象称为增色效应。变性DNA复性后，在260nm处的吸收值减少的现象33、解链温度或熔解温度（meltingtemperature,Tm)：A260值达到最大值1/2时的温度34、核酸探针：一段带有检测标记的与目的基因或目的DNA特异互补的已知核苷酸序列。35、克隆载体(cloningvector)：为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。36、表达载体(expressionvector)：为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。37星星活性(staractivity)：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。38.单位酶:在建议使用的缓冲液及温度下，在20ml反应液中反应1小时，使139.位点偏爱：即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率。40.基因工程：在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA)，转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物。41.DNA克隆：通过将生物体基因组DNA片段作为自主复制载体的一部分进行独立复制的方式，使对该片段的分离及操作简单化。42.复性：在适当条件下，变性DNA的两条互补单链重新结合，形成双链的过程称为复性。43.退火.在热变性后，当温度缓慢冷却至比Tm值低20-30℃时，变性的单链DNA即可恢复双链螺旋结构，这样的复性又称为退火。44.变性：在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双链螺旋或发夹结构被拆开，有规则的空间结构被破坏，形成单链分子，称为核酸的变性。45.基因扩增：指生物体内或体外人工方式使基因拷贝数大规模增加。环境诱发扩增、基因的程序性扩增、基因组进化扩增、基因工程扩增、PCR扩增46.药物基因组学:是研究基因序列的多态性与药物效应多样性之间关系，即基因本身及其突变体与药物效应相互关系的一门科学。47.报告基因：是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因1、原核生物在分子生物学的应用1.良好的研究模型进化原始，遗传物质比较简单，基因组较小，便于操作2.方便的研究材料繁殖迅速，便于培养其中的核酸/蛋白质及酶类容易分离纯化2、细胞器的分离质膜的处理：渗透压冲击；机械性剪切；非离子去污剂细胞器的分离：差速离心法.速率区带离心法.等密度离心法差速离心法：大小和密度不同的细胞器，可以根据它们的沉降系数值不同由差速离心法互相分离并与其他细胞器分开。移去含有各种细胞器的上层悬液，并在更高的速度下进行离心以沉降线粒体，依次可分离其他细胞器．速率区带离心法：在速率区带离心中，混合物被加入离心管中预先铺好的适当介质的浓度(形成密度)梯度层。通过离心，不同成分将根据他们的沉降系数以不同的速度下沉并形成相互分离的带或区带．等密度离心法：也称沉降平衡法，离心时颗粒依其密度的不同而分别沉降或向上漂浮，直至移至与其自身的密度相同的溶剂梯度为止，其结果是依样品物质密度的不同在梯度溶剂中形成一个个区带3、外显子的一般特点1.外显子在DNA中的次序与其mRNA一致2.不同物种的相关基因的外显子序列通常是保守的．利用这种保守性可以分离基因．3.外显子通常短小，典型的外显子编码不到100aa.只有外显子的突变才会影响蛋白质的序列．基因的分类按产物的类别分：蛋白质基因；RNA基因按其功能分：结构基因：Structuralgene调节基因：Regulatorygene4、内含子的一般特点1.不同断裂基因所含的内含子数目大不相同2.不同来源的内含子的分子大小相差悬殊3.内含子的位置通常是保守的4.其长度变化可以很大，高等生物的基因大小主要取决于内含子的大小．5、假基因的形成1.基因突变改变了功能基因的转录起始信号2.基因突变阻止了内含子外显子连接处的剪接3.基因突变使翻译提前终止6、基因重叠的方式1大基因内包含小基因：2前后两基因首尾重叠：3三个基因之间重叠7、移动基因的特征不利用独立形式的元件（如质粒ＤＮＡ），在基因组的一个位置中直接移动到另一位置不依赖于供体与受体位点序列间的任何联系其移动局限于将其自身（有时连带一些其他序列）转移至同一基因组内的新位置相当于基因组内的载体类似物8、移动基因分类插入序列（insertionsequence,IS)，IS因子，IS原件转座子（Tn，transposon)；又称转位子或易位子Mu噬菌体（mutatorphage）9、插入序列（IS）结构共同特征：1.IS末端都有一段反向重复序列（IR序列）2.IS插入靶位点后，在其两端的外侧产生一段短小的同向重复序列3.IS一般只编码参与转位作用的转位酶，它可识别反向重复序列10、基因移动的效应插入位置上出现新基因插入突变；序列的缺失或倒位基因的移动和重排，造成同源序列整合产生染色体畸变增加新的变异，有利于进化最简单的突变是点突变，即一个单一碱基的改变。点突变可以是转换（嘌呤与嘌呤之间，嘧啶与嘧啶之间互换）或颠换（嘌呤与嘧啶之间发生互换）。11、基因突变的特征突变的重演性和可逆性突变的多方向性与复等位基因突变的有害性和有利性突变的稀有性和随机性在真核生物中，C值一般随着生物的进化而增加，高等生物C值一般大于低等生物。12、病毒基因组的特点1.每种病毒中只有一种核酸，DNA或RNA2.病毒核酸大小差别很大。一般DNA病毒较大，RNA病毒较小。3.大部分病毒核酸是单倍体。4.噬菌体基因组中无内含子，但感染真核细胞的病毒基因组中具有内含子。5.有基因重叠现象。6.大部分DNA用于编码蛋白质，只有一小部分是不翻译的。7.调控序列可以被宿主细胞所识别。8.多数RNA病毒的基因组是有连续的几条RNA链组成，但也有些病毒的基因组RNA由不连续的几条RNA链组成。13、细菌的基因组及特点1.基因组相对较小（106bp），只有一个复制启始位点。2.具有操纵子结构：3.基因是连续的：4.大部分DNA是用于编码蛋白质的，只有一小部分是不翻译的。5.基因组中仅有少数基因存在基因重叠现象。6.结构基因是单拷贝，rRNA基因是多拷贝14、真核生物基因组的特点1.基因组含有更大的DNA分子，以染色体形式储存于细胞核内，除配子细胞外，体细胞内的基因的基因组是双份的。“注意C值悖理”2.基因组结构复杂，有多个复制启始位点，但每个复制子的长度较小。3.基因是不连续的。4.转录单位一般是单顺反子的。5.存在重复序列6.存在多基因家族和超基因家族7.基因类型多样15、基因载体分类来源分类：质粒载体、噬菌体载体、病毒载体用途分类：克隆载体、表达载体16、质粒的生物学特性1、质粒是细菌染色体外能自主复制的环形双链DNA分子。2、编码一种或数种抗菌素抗性基因的质粒叫R质粒3、质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定地条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体地复制而复制。4、接合型质粒：自我转移的质粒非接合型质粒：不能自我转移的质粒与控制细菌配对和质粒接合转移的基因有关质粒DNA的迁移作用：由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程。5、根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，严紧型复制质粒（拷贝数少，为1-3个）松弛型复制质粒（拷贝数多，可达10-200个拷贝）分型与寄主状况有关载体的致死效应：利用质粒进行基因克隆时，有时大量的克隆化基因和克隆化基因产物可能不利于宿主细菌的生长繁殖。6、质粒的不亲和性：两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。这样的两种质粒称不亲和质粒。17、质粒载体的选择标准1.具有复制起点：能自主复制2.具有抗菌素抗性基因：两个或两个以上3.若干个限制性内切酶单一识别位点（多克隆位点）4.较小的分子量和较高的拷贝数作为载体的质粒必定包括复制基因、选择性标记和克隆位点三部分λ噬菌体基因组中心区域的大部分对侵染裂解都是非必须的，可以被替换。18、λ噬菌体载体的优点分子遗传学背景十分清楚载体容量较大，~23kb有较高的感染效率，100%19、柯斯质粒载体的优势具有λ噬菌体的特性具有质粒载体的特性具有高容量的克隆能力具有与同源序列的质粒进行重组的能力20限制性内切酶的功能1.限制与修饰Restrictionandmodification50年代初，寄主控制的专一性（hostcontrolledspecificity）l噬菌体具有代表性和普遍性，其在不同宿主中的转染频率，l在感染某一宿主后，再去感染其它宿主时受到限制的现象。EcoliKEcoliBEcoliClK110-41lB10-411lC10-410-41说明K和B菌株中存在一种限制系统，可排除外来的DNA10-4的存活率是由宿主修饰系统作用的结果21限制性内切酶的类型及相互区别目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。I型限制性内切酶II类限制性内切酶III类限制性内切酶1.I型限制性内切酶（1）识别位点序列：未甲基化修饰的特异序列。（2）切割位点：在距离特异性识别位点约1000—1500bp处随机切开一条单链。（3）作用机理：需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。2.II类限制性内切酶（1）识别位点序列：未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列）。与DNA的来源无关。（2）切割位点：识别位点处。（3）粘性末端（stickyends，cohensiveends）：含有几个核苷酸单链的末端。分两种类型：①5’端凸出（如EcoRI切点）②3’端凸出（如PstI切点）（4）粘性末端的意义①连接便利i）不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。这比连接两个平齐末端容易的多。ii）同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。②5’末端标记凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。③补平成平齐末端粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。3.Ⅲ型限制性内切酶：在完全肯定的位点切割DNA，但反应需要ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。ⅡⅠⅢ酶分子内切酶与甲基化酶分子不在一起三亚基双功能酶二亚基双功能酶识别位点4-6BP，大多数为回文对称结构二分非对称5-7bp非对称切割位点在识别位点中或靠近识别位点无特异性，至少在识别位点外1000bp在识别位点下游24-26bp限制反应与甲基化反应分开的反应互斥同时竞争限制反应是否需要ATPNoYESYES22影响限制性内切酶活性的因素1.DNA的纯度2.DNA的甲基化程度3.温度4.缓冲液(Buffer)23T4DNA连接酶功能1.可以修复双链DNA骨架的断裂2.催化限制酶酶解反应的逆反应3.使退火的互补黏性末端共价连接在一起，形成新的DNA分子。主要是催化双链DNA一端的3’-OH与另一双链DNA5’端的磷酸根形成3’,5’-磷酸二酯键，使具有相同粘末端或平端的DNA末端连接起来。24末端转移酶（terminaltransferase）功能（1）5’®3’DNA聚合酶活性：在二价阳离子存在下，末端转移酶催化dNTP加于DNA分子的3’⑵同聚物加尾：给外源DNA片断和载体分子分别加上互补的同聚物尾巴，以使它们有效地连接。25碱性磷酸酶的作用用碱性磷酸酶处理线性载体分子，以除去5’—磷酸基团，使载体在没有目的片段插入的情况下不能连成环状，从而降低反应物中载体自身环化的比例。该酶可从DNA分子的5’端去除磷酸基。催化脱掉DNA（或RNA）5’端的磷酸根。碱性磷酸酶有两种：由大肠杆菌分离出来的细菌碱性磷酸酶（bacterialalkalinephosphatase,BAP）和由牛肠道分离出来的小牛肠碱性磷酸酶（calfintestinalalkalinephosphatase，ClAP），它们都催化切除DNA、RNA和dNTP上的5’磷酸基团。碱性磷酸酶用于从DNA片段上除去5’磷酸，以防止自身连接。26常用的DNA聚合酶的特点1.共同特点把dNTPs连续地加到引物的3’—2.主要区别1.持续合成能力和外切酶活性不同。2.T7DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。3.其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。27基因工程的主要操作内容1.目的基因的获取从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。2.重组体的制备将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。3.重组体的转化将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。4.克隆鉴定挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。5.目的基因表达使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。28碱抽提法提取质粒DNA的步骤第一步：溶菌使用“溶液Ⅰ”溶解细菌细胞壁。第二步：破膜，蛋白质和DNA变性溶液II破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。第三步：中和溶液III使DNA复性、并促使蛋白质-SDS复合物和染色体DNA、RNA沉淀。第四步：离心除去沉淀上清液中含有闭合质粒DNA。第五步：纯化DNA上清液过柱或酚-氯仿抽提。第六步：沉淀DNA0.6倍体积的异丙醇或2倍体积的乙醇。29形状相似的分子的迁移速度主要与分子量相关:分子量越大，移动越慢。相同分子量的DNA：环状卷曲超螺旋迁移最快，线性分子次之，伸展开环状最慢。30琼脂糖凝胶的分辨力1.空隙大小决定其分辨分子大小的能力。2.空隙小，分辨率高：小分子较易通过，而大分子难通过；3.空隙大，分辨率低：大小分子几乎以同等速率通过。31探针的分类：（1）寡核苷酸探针：（2）基因组DNA探针：（3）cDNA探针：（4）RNA探针：32Northern印迹杂交的应用及其对象与Southern杂交类似。检测目的RNA的存在与否及含量。1．基本原理和基本过程与Southernblot基本相同2．鉴别RNA3．探针可用DNA或RNA片段4．待测样品为总RNA或mRNA33蛋白质的免疫印迹（western)操作过程蛋白的制备-----→SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离不同的蛋白质杂交（一抗与特定蛋白结合）↓漂洗去除多余的一抗↓二抗与一抗结合↓漂洗去多余的二抗↓结果检测34PCR基本原理在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。变性(denaturation)：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA 退火(annealing)：当温度突然降低时，反应体系中引物和其互补的DNA模板在局部形成杂交链。延伸(extension)：在DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）及Mg2+存在条件下，5’→3’的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。35PCR的过程（1）第一步：变性（denature）94-95oC下5分钟，模板DNA双链完全变性成单链。（2）第二步：复性（anneal）50-60oC下1分钟，引物优先与模板复性。①引物的浓度高，②引物的链短。（3）第三步：延伸（extend）72oC下1-2分钟，TaqDNA聚合酶在引物的3‘端上加上核苷酸。（4）第四步：变性（denature）94oC下1分钟，新合成的DNA双链又变性成单链模板。（5）第五步：重复（repeat）36引物（primer)设计原则①序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。②引物长度以15-40bp为宜。③碱基尽可能随机分布,G+C占50-60%。④引物内部避免形成二级结构。⑤两引物间避免有互补序列。⑥引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。37PCR技术在医学中应用（1）.获得目的基因（2）PCR在病原体基因检测的应用PCR技术可用于诊断禽流感、口蹄疫、爱滋病、肝炎病毒、结核杆菌等（3）PCR技术在法医学上的应用：个人识别与亲子鉴定。①HLA-DQα分型的应用HLA-DQα：人类白细胞抗原-DQα②在性别鉴定中的应用（4）遗传相关基因的检测38原核表达体系优势：1.一种成熟的基因克隆表达的受体细胞2.繁殖迅速，培养代谢易于控制3.易于进行遗传操作和高效表达不足之处：1）缺乏适当的转录后和翻译后加工机制。2）缺乏表达蛋白质复性系统，表达蛋白无特异性空间结构。3）表达产物不稳定，易被细菌蛋白酶降解。4）表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusionbody)5）很难表达大量可溶性蛋白39真核表达体系酵母、昆虫、乳类动物细胞优点：1.可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA2.可适当修饰表达的蛋白质3.表达产物分区域积累缺点：操作技术难、费时、经济40.1.细菌基因组DNA的制备一般过程及原理（1）细胞裂解（2）DNA纯化（3）沉淀DNA0.6倍体积的异丙醇。2.哺乳动物细胞基因组DNA的抽提一般过程及原理：（1）组织粉碎（2）细胞裂解（3）纯化DNA用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染。