大豆皂苷的提取纯化和测定

大豆皂苷的提取测定1、大豆简介1．1大豆的组成成分：大豆主要成分为蛋白质35%、脂肪16%~21%、碳水化合物23%~27%、水分和粗纤维15%左右、皂苷和异黄酮等糖苷占2%左右,其中,皂苷约占0.5%。2大豆皂苷的化学组成：大豆皂苷，又称大豆皂貳(Soyasaponins)属于三萜类齐墩果酸型皂苷,是三萜类同系物的羟基和糖分子环状半缩醛羟基失水缩合而成,它可以水解生成多种糖类和配糖体,目前已确认的大豆皂苷约18种，是由5种皂苷元(SoyasapogenoI、II、 III、W、V)和糖基中的0-D-半乳糖、0-D-木糖、a-L-鼠李糖、a-L-阿拉伯糖、0-D-葡萄糖醛酸等6种单糖以及乙酰基大豆皂苷(Acetyl-soyasaponin)所组成。大豆皂苷根据其苷元不同分为A类、B类、E类和DDMP类，A类皂苷是以soyasapogenolA为配基的双糖皂苷，B类和E类是以soyasapogenolB和soyasa-pogenolE为配基的单糖皂苷，DDMP皂苷是以soyas-apogenoB作配基在C-22位上结合有2，3-dihydro-2，5-dinydroxy-6-methy-l4h-pyran-4-one的单糖链皂[4-5]。因为所有DDMP大豆皂苷对热不稳定，受热易分解生成A类和E类皂苷，所以，有些人认为DDMP皂苷是大豆中存在的真正皂苷。由低聚糖及齐墩果烯三萜缩合形成的一类化合物,具有抗癌、调节免疫功能、防治心血管疾病、抗菌、抗病毒、护肝等多重生理功效。除用作药物外,皂苷还可以作为高级化妆品和食品添加剂,如作为杀菌剂、抗氧化剂、发泡剂等,在化妆品和食品工业中具有广泛的应用。大豆加工制品种类繁多，一般分为传统的大豆制品和新兴大豆制品。传统豆制品分为非发酵制品如豆腐、干豆腐、豆腐皮、豆腐干、豆芽和发酵的豆制品如腐乳、豆豉、豆酱、酱油、天培、纳豆等；新兴的豆制品有大豆油脂、大豆蛋白、大豆磷脂、大豆低聚糖、大豆异黄酮、大豆纤维、大豆皂苷等。豆制品的生产过程中会产生大量的废水，这些废水含有大分子蛋白、小分子寡糖、有机酸、色素类物质和盐类等，极易腐败，BOD（生物需氧量）、COD（化学需氧量）值严重超标。另外还有很多有益的生理活性成分，如大豆异黄酮、皂苷、维生素、胰蛋白酶抑制剂等。在很多生产过程中这些废水往往直接由下水道排放，既污染了环境，又浪费了资源。因此，从豆制品生产的废水中提取功能性物质，无论对于环境保护还是对资源的充分利用都有着极其重要的现实意义。豆腐的生产流程为：加水加水大豆一清选一浸泡f磨浆一煮浆一过滤一豆浆一凝固一压榨一成型一包装黄浆水图1豆腐生产的流程Fig.IFlowoftofuproduction大豆残渣则是用刚榨过豆浆的大豆湿豆渣在65°C条件下干燥至恒重,过36目筛,保存制作而成。从上述生产流程可以看出，豆腐生产的废水主要来自于浸泡大豆的废水（泡豆水）和压榨豆腐产生的黄浆水，另外还有部分冲洗废水。具体成分见表1表1豆腐生产废水Table1Wastewaterintofuproduction废水来源质量COD(mB0D/C0D物质泡豆废水干豆重的1-1.5倍150000.55〜0.65低聚糖、柠檬酸、维生素、矿物质、色素黄浆水重的4.5-5.5倍200000.55-0.65糖类、蛋白质、脂类、氨基酸、可溶性固形物本实验欲从大豆的废水、压榨豆腐产生的黄浆水和大豆残渣中测定大豆皂苷的含量，为从大豆生产废水中提取大豆皂苷做准备。目前三萜皂苷的提取方法主要有冷浸法、回流提取法、树脂吸附法、凝胶吸附法、薄层层析法、超声提取法、酶提取法、微波提取法等.通过对大孔树脂吸附法、有机溶剂提取法、微波提取法以及超声波提取法等四种常见提取方法进行比较,结果如下：A1、四种方法中除大孔树脂吸附法液料比为1：10夕卜，其余三种均为1：20。A2、四种大豆皂苷提取方法提取时所需温度分别为：大孔树脂吸附法70°C、有机溶剂提取法80°C、微波提取法和超声波提取法均为60°C。A3、四种大豆皂苷提取方法提取时所需时间依次为：大孔树脂吸附法最长，为6h;其次是有机溶剂提取法为3h;再次为超声波提取法,需25min;微波提取法最短,仅为90s。A4、四种大豆皂苷提取方法提取所得大豆皂苷吸光度依次为：微波提取法(0.310)＜超声波提取法(0.317)＜大孔树脂吸附法(0.479)＜有机溶剂提取法(0.489)。A5、四种大豆皂苷提取方法中大豆皂苷提取率依次为：微波提取法(59.8%)＜超声波提取法(61.0%)＜大孔树脂吸附法(90.2%)＜有机溶剂提取法(93.4%)。附：皂苷产率和提取率的计算式分别如下:皂昔产率(％)=皂昔实际产量/豆渣总质量X100=提取液体积X提取液浓度/豆渣总质量X100皂苷提取率=皂苷产率/皂苷理论含量通过上述四种提取方法的比较，结合实际生产条件，此次的大豆皂苷提取应采用有机溶剂沉淀法。大豆皂苷提取液中的主要杂质是可溶性糖和大豆异黄酮,可溶性糖占到提取物干重的65%以上,所以除糖是提高大豆皂苷纯度的关键。在大豆皂苷的纯化工艺中,主要依据各组分的极性及其在不同溶剂中溶解度的差异。大豆低聚糖极性相对较大,较易溶于水而不易溶于极性较小的醇中;大豆皂苷则不易溶于乙醚、乙酸乙酯、丙酮等非极性溶剂。大豆异黄酮极性一般略大于大豆皂苷的极性。因此常用以上极性的差异来分离纯化大豆皂苷。目前大豆皂苷纯化方法主要有以下几种，通过对比如下：

表3大豆皂昔不同分离纯化方法比较方法优点缺点正丁醇法操作简便溶剂消耗大、产品纯度及收率均较低有机溶剂沉淀法丁艺简单、产品纯度较高溶剂耗费大酸碱水解-乙酸乙酯萃取法产品纯度高只能得到昔元产品，收率低铅盐沉淀法产品纯度极高收率低、铅离子有毒柱层析法重复性好、成本低、产品纯度高树脂吸附容量较小柱层析-有机溶剂沉淀法产品纯度高丁艺较复杂、潘剂消耗大制备色谱法大豆皇昔单体产品纯度高、可作标准样品成本高、产量低（mg级）综合考虑，最佳分离纯化方法仍是有机溶剂沉淀法，经前人各方面研究得知，丙酮为最合适的沉淀剂。因此，为有效提取具有生理活性和药用价值的大豆皂苷,用乙醇浸提、正丁醇萃取、丙酮沉淀法提取大豆中皂苷,通过紫外光谱法检测大豆皂苷的含量和纯度。实验方案：1.1材料与方法实验材料：普通大豆、齐墩果酸标准样品（市售）实验仪器与设备：平底烧瓶数个、具塞试管数只、恒温水浴锅、不同量程量筒数个、紫外光分光光度计、压榨机、恒温干燥箱实验试剂：70%乙醇、饱和正丁醇、80%甲醇、丙酮、5%香草醛、高氯酸、冰乙酸、乙酸乙酯（所用化学试剂均为分析纯）1.2实验步骤检测样品制备：取市售大豆原料1kg,采用传统工艺生产豆腐,收集浸泡大豆水和黄浆水，将刚榨过豆浆的大豆湿豆渣在65°C条件下干燥至恒重获得大豆残渣。大豆废水中检测样品的制备：大豆废水一超滤一乙酸乙酯萃取一减压蒸馏出去乙酸乙酯一无水乙醇溶解一上大孔树脂层析柱一收集活性峰一减压蒸馏除去醇和水f大豆异黄酮混合物（以上出自豆丁网的《豆腐生产中黄浆水的综合利用》）由于大豆皂甙与大豆异黄酮溶解度和含量基本相似,所以也可以从大豆乳清废水中提取大豆皂甙。利用提取异黄酮的实验方法将二者的混合物提取出后,利用有机溶剂法提取大豆皂苷（同大豆残渣）。大豆残渣中粗皂苷样品的制备：取大豆残渣50g两份分别置于2个500ml的平底烧瓶中；向其中加入70%乙醇溶液350ml摇匀；在80C恒温下浸泡7h；冷却后用布氏漏斗过滤，将滤液浓缩到50ml；用等体积饱和正丁醇萃取,取正丁醇相浓缩至呈褐色粘稠状冷却；加入2.8ml的80%甲醇溶液溶解；再加入40mL丙酮充分振荡,离心沉淀,烘干称重即得粗皂苷。大豆皂苷含量的测定方法采用香草醛－高氯酸比色法对大豆皂苷的含量进行检测，通过分析几种显色反应方法，确立了最佳显色条件：向样品中分别加入0.2ml5%香草醛溶液和0.8ml高氯酸，于70°C水浴反应15min,流水冷却，加入5ml冰乙酸。1.2A标准曲线的制作称取齐墩果酸标准品27.60mg置于100mL容量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度，得浓度为0.276ug/uL的标准溶液，吸取齐墩果酸标准溶液100、200、300、400、500、600uL于具塞试管中,70C水浴上蒸干，于每个试管中加新配制的质量分数5%香草醛-冰醋酸溶液0.2mL,高氯酸0.8mL,置60C水浴上加热15min,流水冷却，加冰醋酸5mL，摇匀，以550nm为设定波长测定吸光值。以吸光值为纵坐标(Y),齐墩果酸相当量为横坐标(X,Ag),