月第4周基因工程

基因工程基因工程的概念基因工程的别名基因拼接技术或DNA重组技术操作环境操作对象操作水平基本过程结果

基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。DNA重组技术或基因拼接技术生物体外基因DNA分子水平剪切→拼接→导入→表达符合人类需要的基因产物基因工程培育抗虫棉简要过程：普通棉花(无抗虫特性)苏云金芽孢杆菌提取抗虫基因与运载体DNA拼接棉花细胞(含抗虫基因)棉花植株(有抗虫特性)上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？导入重组DNA关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来关键步骤二：抗虫基因与运载体DNA连接关键步骤三：抗虫基因导入受体(棉花)细胞

分子手术刀：核酸限制性内切酶（限制酶）

分子缝合针：DNA连接酶

分子运输车：载体识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。1、主要来源：

2、种类和命名：

3、作用：

4、结果：一、“分子手术刀”

—限制性核酸内切酶形成两种末端粘性末端平末端原核生物特点：专一性一种限制酶只能识别一种特定核苷酸序列，并在特定的位点切割

EcoRⅠ黏性末端黏性末端Goback识别序列的特点：中轴线两侧的碱基反向对称重复排列切割的位点：G、A之间断裂的化学键是：磷酸二酯键SmaⅠ平末端平末端1、种类：2、作用部位：E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶

磷酸二酯键DNA连接酶连接黏性（平）末端，可形成重组的DNA分子二、“分子缝合针”

—DNA连接酶

可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，E·coliDNA连接酶或T4DNA连接酶即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键

T4DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低T4DNA连接酶要想使两个不同的DNA分子重组，必须用同一种限制性核酸内切酶切割类型E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源功能大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)相同点差别（二）“分子缝合针”——DNA连接酶3、两种连接酶的区别：DNA连接酶与DNA聚合酶比较DNA聚合酶DNA连接酶相同不同作用对象模板形成磷酸二酯键单个脱氧核苷酸DNA片断需要不需要三、基因的载体——“分子运输车”载体必须具备的条件：

1、能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；

2、具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接；

3、具有某些标记基因，便于进行筛选。（如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等）

4、对受体细胞无害载体的作用：

1、将外源基因转移到受体细胞中去。

2、利用运载体在受体细胞内，对外源基因进行大量复制。常用的载体有：

质粒，λ噬菌体的衍生物，动植物病毒等常用的载体：质粒能复制并带着插入的目的基因一起复制有切割位点有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的

为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？

通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。

目的基因主要是指_____________________，

也可以是一些具有调控作用的因子。编码蛋白质的结构基因供体生物细胞取出DNA用限制酶剪去多余部分目的基因目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金芽孢杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌)、人胰岛素基因等。步骤一:目的基因的获取原核细胞的基因结构原核细胞基因编码区（编码序列）：能指导有关蛋白质的合成，即能够编码蛋白质非编码区（调控序列）：位于编码区上游和编码区下游的DNA序列，虽不能指导有关蛋白质的合成，但有调控遗传信息表达的核苷酸序列，如启动子、终止子等真核细胞的基因结构真核细胞基因编码区（间隔、不连续）外显子：能编码蛋白质的DNA序列内含子：不能编码蛋白质的DNA序列非编码区：与原核生物具有相似功能的启动子、终止子1）从基因文库中获取目的基因2）利用PCR技术扩增目的基因3）人工合成（DNA合成仪）

种类：基因组文库：部分基因文库（如cDNA文库）：含有一种生物的全部基因含有一种生物的部分基因根据基因的有关信息，如基因的转录产物mRNA等可以从基因文库中得到所需的目的基因。获得目的基因的方法适合基因比较小，且核苷酸序列已知原理、过程、条件、扩增形式1）从基因文库中获取目的基因1）从基因文库中获取目的基因基因组DNA文库基因组DNA文库cDNA文库鸟枪法人工合成以原核生物为主真核生物cDNA文库和基因组文库对比目的性强比较盲目工作量相对小大PCR技术—多聚酶链式反应

原理：前提：原料：PCR扩增仪DNA双链复制已知目的基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸引物热稳定DNA聚合酶(Taq酶）DNA的两条链为模板变性（90--95℃）复性延伸1.变性：目的基因DNA受热变性，解链为单链；2.复性：引物与单链互补结合；3.延伸：合成链在DNA聚合酶作用下进行延伸。55

55（55--60℃）（70--75℃）指数形式扩增1.用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。2.用_____________切断目的基因，使其产生_________________。——

核心3.将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组

DNA分子（重组质粒）。限制酶黏性末端同种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同步骤二:基因表达载体的构建●目的基因●启动子在基因的首端，它是RNA聚合酶的识别和结合的部位●终止子在基因的尾端●标记基因便于筛选检验基因表达载体的组成：目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。常用的受体细胞：动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。将目的基因导入受体细胞的原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。使目的基因进入受体细胞，并在其中维持稳定和表达的过程，称为转化。步骤三:将目的基因导入受体细胞导入方法植物细胞动物细胞微生物细胞农杆菌转化法(最常用)基因枪法花粉管通道法—显微注射法—感受态细胞吸收DNA分子农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物。

Ti质粒的T-DNA可转移并整合到受体细胞的染色体DNA上1.微生物作受体细胞原因：将目的基因导入微生物细胞3.转化方法：大肠杆菌繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少

处理细胞→

细胞→表达载体与感受态细胞混合→_________细胞吸收DNA分子。Ca2+感