尿素的细菌;纤维素微生物的分离选编课件

尿素的细菌;纤维素微生物的分离选编课件第一页，共74页。一、微生物概念及分类1、概念：是指自然界中那些形态微小、结构简单，通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看清楚的生物。第1节微生物的实验培养第二页，共74页。生物分类动物界：植物界：真菌界：原生生物：原核生物：病毒大型真菌、霉菌酵母菌细菌、放线菌、支原体、蓝藻、衣原体变形虫、草履虫DNA型病毒、RNA型病毒真核生物原核生物非细胞生物细胞生物第三页，共74页。二、微生物培养：1）概念：按照微生物对营养物质的不同需要，配制出供其生长繁殖的营养基质。1、培养基：2）营养成分：第四页，共74页。概念分类作用为微生物的生长和繁殖提供所需碳元素的营养物质无机碳源：二氧化碳、碳酸氢钠；有机碳源：葡萄糖、脂肪酸、石油等葡萄糖是最主要的碳源合成微生物的细胞物质和代谢产物，有些碳源是异养微生物主要能源碳源：第五页，共74页。概念分类作用为微生物的生长和繁殖提供所需氮元素的营养物质无机氮源：N2、NH3铵盐、硝酸盐；有机氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨等铵盐、硝酸盐是最主要的氮源。合成蛋白质、核酸和含氮代谢产物氮源：温度、PH、渗透压、O2及特殊营养物质等。第六页，共74页。1、科学家们用脉胞霉（一种真菌）为材料，进行科学研究，用基本培养基来培养脉胞霉。基本培养基中所含的营养要素一般包括：

_______________________________2、酵母菌可用于食品工业的废水处理，废水中的淀粉或废糖可与为酵母菌的生长提供________类营养物质。3、用乳酸菌制酸奶，加入的蔗糖是作为______类营养物质加入到牛奶中的。4、硝化细菌的碳源、氮源、能源依次为__________________________________。碳源、氮源、水、无机盐碳源碳源CO2、NH3、NH3氧化释放的化学能第七页，共74页。选择培养基1）不加碳源的培养基

分离自养型微生物2）不加氮源的培养基

分离固氮菌3）加入青霉素的培养基

分离酵母菌、霉菌等真菌4）加入高浓度食盐的培养基

分离金黄色葡萄球菌第八页，共74页。思考：自然界中微生物是混杂的生活在一起的，如何分离出某种微生物（如纯化大肠杆菌）？2、实验操作——大肠杆菌的纯化培养1）制备培养基：计算称量溶化调PH值灭菌倒平板？原则：目的明确、营养协调、PH值适宜第九页，共74页。无菌技术1、获取纯化培养物的关键是防止外来杂菌的入侵。2、无菌措施：1)对实验操作空间、操作者衣着和手进行清洁和消毒；对将培养用的器皿、接种工具和培养基进行灭菌2)实验操作时已灭菌材料等应避免与周围物品接触；实验操作应在酒精灯火焰附近进行；接种工具等应在酒精等火焰上灼烧后使用第十页，共74页。概念对象常用方法消毒灭菌用温和物理和化学方法杀死物体表面或内部部分有害微生物（不包括芽孢和孢子）用强烈物理和化学方法杀死物体表面或内部全部有害微生物（包括芽孢和孢子）空间、操作者衣物、手等器皿、培养基、接种工具等煮沸、酒精、氯气、紫外线等灼烧灭菌法、干热灭菌法、高压蒸汽灭菌法第十一页，共74页。消毒：常用消毒方法：

煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min；巴氏消毒法:70-75℃下煮30min或80℃下煮15min；化学药剂消毒法:用75%酒精等进行皮肤消毒;氯气消毒水源；紫外线消毒等第十二页，共74页。灼烧灭菌干热灭菌：160-170℃下加热1-2h。高压蒸汽灭菌：100kPa、121℃下维持15-30min.2)灭菌方法：第十三页，共74页。

倒平板：待培养基冷却到50OC左右时倒平板。平板倒置原因：防止培养基冷却产生水滴滴落培养基上，造成污染。第十四页，共74页。2）纯化大肠杆菌：微生物接种方法平板划线法稀释涂布平板法第十五页，共74页。平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面，在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的细胞群体，即得到单一菌落。第十六页，共74页。平板划线法第十七页，共74页。第十八页，共74页。稀释涂布平板法：

将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释梯度菌液分别涂布在固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，进而形成单个菌落。第十九页，共74页。步骤1：梯度稀释操作123456(1)将分别盛有9mL水的试管灭菌并编号。(2)用移液管吸取1mL培养的菌液，注入第二支试管中，轻压橡皮头，吹吸三次使之充分混匀。(3)从101倍稀释的试管中吸取1mL稀释液，注入第三支试管中，重复步骤2，直至到第六支试管。第二十页，共74页。步骤2：涂布到培养基上第二十一页，共74页。10-110-410-510-6第二十二页，共74页。平板划线法稀释涂布平板法相同点：分散出单细菌形成单菌落来分离菌种不同点：分别通过划线和稀释分散出单细菌，稀释涂布平板法除分离菌种外还可以对微生物计数第二十三页，共74页。专题1微生物专题微生物概念及分类微生物培养微生物分离和计数微生物应用第二十四页，共74页。思考1：如何寻找某种微生物？思考2：如何分离某种微生物？取土样制土壤悬液样品稀释涂布于固体培养基挑菌落保存选择培养第二十五页，共74页。筛选并增大菌种浓度稀释菌种第二十六页，共74页。1、活菌计数法（通过统计菌落估算活菌数）原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。常用方法：稀释涂布平板法。每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。微生物计数方法：第二十七页，共74页。注意事项①统计的菌落往往比活菌的实际数目低。原因是___________________________________________________________________________。②为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。(细菌：稀释度104-106；放线菌：稀释度103-105；霉菌：稀释度102-104)③为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。当两个或多个细胞连着一起时，平板上观察到的菌落只有一个。第二十八页，共74页。2、显微镜直接计数法：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察缺点第二十九页，共74页。第2节土壤中分解尿素的细菌的分离和计数第三十页，共74页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数课题背景1）尿素的利用尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。2）细菌利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶CO(NH2)脲酶+H2O+CO2NH3第三十一页，共74页。3）常见的分解尿素的微生物芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。4）课题目的①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌第三十二页，共74页。如何从土壤中分离能够分解尿素的细菌（目的菌）并对其进行计数？试通过小组讨论写出实验设计的基本思路。讨论：思考：如何寻找目的菌？第三十三页，共74页。思考：如何寻找和分离某种微生物？实例1：启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。如果让你寻找这种耐高温的酶，你会去哪找？第三十四页，共74页。启示：分离菌种要人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长，即用选择培养基来分离菌种。原因：因为热泉温度70～800C，淘汰了绝大多数微生物，只有耐热菌被筛选出来。思考：为什么耐热菌能从热泉中被筛选出来？分离微生物原理：选择培养基分离第三十五页，共74页。培养基的唯一氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。4)培养基选择分解尿素的微生物的原理第三十六页，共74页。15.0g琼脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO4土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：①从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？第三十七页，共74页。实验的具体操作

㈠.土壤取样

从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。㈡.制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。第三十八页，共74页。◆应在火焰旁称取土壤10g。◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行◆分离不同的微生物采用不同的稀释度原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板[三]样品的稀释第三十九页，共74页。㈣.取样涂布◆如果得到了2个或2个以上菌落数目在30——300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。第四十页，共74页。实例1：教材22页第四十一页，共74页。实例2：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。原因：⑴土样不同⑵培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质)第四十二页，共74页。小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验方案二：将A同学配制的培养基在不加土样(或加等量无菌水)的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。第四十三页，共74页。设置对照：设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。第四十四页，共74页。

纤维素分解菌的筛选（教材P28）选择___________的环境，采集土样制成样品。将样品接种在以_________为唯一碳源的选择培养基上培养，目的是增加纤维素分解菌的浓度。采用___________________法,将样品接种到含有刚果红的固体的培养基上，挑选产生_______的菌落来筛选纤维素分解菌。纤维素丰富纤维素稀释涂布平板透明圈2、分解纤维素微生物的分离：第四十五页，共74页。实验操作土壤取样梯度稀释将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上（含刚果红）挑选产生透明圈的菌落选择培养(液体培养基)第四十六页，共74页。第四十七页，共74页。㈤.微生物的培养与观察在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：30～37℃培养1～2d放线菌：25～28℃培养5～7d霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。第四十八页，共74页。微生物的培养与观察第四十九页，共74页。三.结果分析与评价1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。2.提示：选择每个平板上长有30—300个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。第五十页，共74页。2、微生物分离原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。（用选择培养基）第五十一页，共74页。（二）纯化大肠杆菌1、将准备培养的菌种放到培养基中的过程叫做__________。2、微生物接种的最常用方法是____________和_________________3、能够获得单一菌落的接种方法有____________和_________________4、能够测定样品中活菌数的接种方法是_______________平板划线法稀释涂布平板法接种平板划线法稀释涂布平板法稀释涂布平板法第五十二页，共74页。5、选择培养基（笔记）选择培养基筛选、分离的细胞加入青霉素酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐金黄色葡萄球菌无氮培养基固氮菌无碳培养基自养型细菌依标记基因，加入某种等抗生素导入了重组DNA的受体细胞加入次黄嘌呤、氨基嘌呤等杂交瘤细胞第五十三页，共74页。培养基成分含量NH4Cl4.6gK2HPO42.0gMgSO41.6g琼脂15g蒸馏水1000ml乳糖5.0g第五十四页，共74页。培养基成分含量K2HPO42.0gMgSO41.6g琼脂15g蒸馏水1000ml乳糖5.0gNH4Cl4.6g蛋白胨10.0g第五十五页，共74页。培养基成分含量K2HPO42.0gMgSO41.6g琼脂15g蒸馏水1000ml乳糖5.0gNH4Cl4.6g第五十六页，共74页。培养基成分含量K2HPO42.0gMgSO41.6g琼脂15g蒸馏水1000ml乳糖5.0gNH4Cl4.6g蛋白胨10.0g第五十七页，共74页。培养基成分含量K2HPO42.0gMgSO41.6g琼脂15g蒸馏水1000ml乳糖5.0gNH4Cl4.6g第五十八页，共74页。微生物的分离：科赫的平板划线法自然界中的微生物都是混杂生活在一起的，给研究和应用带来了很大困难。19世纪后期，德国细菌学家科赫发明了固体培养基，尤其是用琼脂做凝固剂的固体培养基，成功解决这一问题，科赫将微生物样品稀释后，用针尖沾取少量稀释菌液在固体培养基上连续划线，由于微生物在固体培养基上生长部位固定，不久就会在培养基表面长出多种菌落，科赫推断相同的菌落来自同一个种，于是挑选某一种菌落的微生物，经过几次相同的培养过程后，就得到了纯种。应用固体培养基，科赫分离出了炭疽芽孢杆菌、霍乱弧菌、结核杆菌等。1905年科赫因结核杆菌的研究成果而获诺贝尔生理学奖。第五十九页，共74页。第六十页，共74页。单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见、具有一定形态结构子细胞群体，叫做菌落。菌落是鉴定菌种的重要依据。第六十一页，共74页。1）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基物质牛肉膏蛋白胨NaCl琼脂水重量5g10g5g20g定溶至100mL

称量

按比例称取各种物质，注意事项：牛肉膏要放在称量纸上称量，牛肉膏、蛋白胨都易吸潮，称取时动作要迅速，称后及时盖上瓶盖。计算第六十二页，共74页。溶化：先将牛肉膏连同称量纸一起放入烧杯，加少量水，加热至牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻璃棒取出称量纸。加入蛋白胨和氯化钠，用玻璃棒搅拌使之溶解，再加入琼脂，搅拌，待溶解后，加自来水定溶至100mL。灭菌：将配制好的培养基放到锥形瓶中（瓶口加棉塞，包上牛皮纸），连同培养皿（3～5套，用几层报纸包好）一起放到高压锅内灭菌。第六十三页，共74页。2、制备培养基的操作排序①溶化（使各种原料、琼脂等加热溶化）②灭菌③调PH值④计算（各成分用量）⑤称量⑥倒平板(培养基冷却至50℃,倒入培养皿)

正确的操作顺序：___________________④⑤①③②⑥第六十四页，共74页。为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？原因：土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。结论：为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。第六十五页，共74页。第六十六页，共74页。接种环接种针结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。第六十七页，共74页。思考：1、所有的培养基都必须含碳源、氮源、水、无机盐吗？2、培养基中的营养要素，除了水以外的无机物只能是无机盐？3、CO2既自养型生物的碳源也是能源物质？4、利用动物细胞培养液培养病毒，行吗？否；可以无碳源，也可无氮源否；碳源和氮源也可能是无机物否；光能或化学能病毒无细胞结构，只能寄生在活细胞中生存。所以，要利用活细胞培养病毒。第六十八页，