基因工程的基本操作程序（第一课时）课件 【知识精讲精析】 高二下学期生物人教版选择性必修3

复习——DNA的粗提取与鉴定如何分离DNA与蛋白质？如何析出DNA？体积分数为95%的酒精（预冷）加入研磨液（SDS）研磨；加热如何溶解DNA？2mol/L

NaCl如何鉴别DNA？在一定温度下（沸水浴），DNA被二苯胺试剂(现配现用)染成_______蓝色复习——重组DNA技术的基本工具限制酶DNA连接酶载体①对受体细胞无害；②有一个至多个限制酶切割位点；③有特殊的标记基因；④能自我复制或能整合到宿主DNA上。质粒、噬菌体、动植物病毒作为载体的条件种类：磷酸二酯键来源：主要来源于原核生物特点：作用部位：具有专一性结果：形成黏性末端或平末端连接部位：种类：作用：

磷酸二酯键E.coliDNA连接酶、T4DNA连接酶把两条双链DNA片段拼接起来第2节基因工程的基本操作程序讲课人：涂梦婷第三章

基因工程培育转基因抗虫棉的基本步骤普通棉花（无抗虫特征）苏云金芽孢杆菌（有抗虫特征）提取抗虫基因棉花细胞与载体DNA拼接，导入（含抗虫基因）植物组织培养技术转基因抗虫棉目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定目的基因定义

用于__________________或___________________等的基因。改变受体细胞性状获得预期表达产物与生物抗逆性相关的基因与生产药物相关的基因与毒物降解相关的基因与工业用酶相关的基因等类型主要指：编码蛋白质的基因资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。目的基因定义

用于__________________或___________________等的基因。改变受体细胞性状获得预期表达产物主要指：编码蛋白质的基因目的基因的筛选从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。DNA测序仪序列数据库（如GenBank）核苷酸序列比对氨基酸序列比对序列比对工具（如BLAST）目的基因的筛选目的基因的筛选从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。目的基因的筛选苏云金杆菌的杀虫作用于Bt基因有关掌握了Bt基因的序列信息对Bt基因的表达产物-Bt抗虫蛋白有较为深入的了解苏云金杆菌制剂可防治棉花虫害Bt基因是培育转基因抗虫棉的目的基因（1）人工合成在我国首批具有较高抗虫活性的转基因抗虫棉的培育过程中，科学家采用的是人工合成的方法。前提：方法：基因比较小、核苷酸序列已知通过DNA合成仪用化学方法直接合成DNA合成仪转基因抗虫棉目的基因的获取若不明确基因碱基序列呢？（1）人工合成在我国首批具有较高抗虫活性的转基因抗虫棉的培育过程中，科学家采用的是人工合成的方法。前提：方法：基因比较小、核苷酸序列已知通过DNA合成仪用化学方法直接合成DNA合成仪转基因抗虫棉目的基因的获取蛋白质氨基酸序列mRNA序列基因序列若核酸序列未知——反转录法目的基因的获取（2）从生物组织中直接获取“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”①用限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段②将这些片段分别连接到载体上，转入不同的受体细胞并使其表达③若在某细胞中得到了目的产物，就说明该片段是所需的DNA片段③一定的方法把带有目的基因的DNA片段分离出来优点：缺点：操作简便，广泛使用；速度快，成本低工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因目的基因的获取（3）从基因文库中获取将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。基因组文库部分基因文库含有一种生物所有基因的文库只含有一种生物部分基因的文库（如：cDNA文库）基因组文库cDNA文库补充——真核细胞的基因结构编码区：非编码区：不编码蛋白质，含有能调控遗传信息表达的DNA序列

(如启动子、终止子）能转录相应的信使RNA（mRNA），能编码蛋白质RNA聚合酶识别并结合的部位，开始转录补充——原核细胞的基因结构非编码区非编码区启动子：RNA聚合酶的识别和结合位点开始转录编码区原核生物基因终止子：终止转录编码区是连续的！目的基因的获取（4）利用PCR技术获取和扩增目的基因PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。目的基因的获取（4）利用PCR技术获取和扩增目的基因苏云金杆菌Bt基因快速获得大量Bt基因提取PCR技术PCR技术概念PCR全称为___________________，是一项在生物________复制___________________的核酸合成技术聚合酶链式反应体外特定DNA片段①PCR的中文全称：②操作环境：③目的：④原理：⑤优点：聚合酶链式反应体外（PCR扩增仪/PCR仪）对目的基因的核苷酸序列进行大量复制DNA半保留复制可以短时间内大量扩增目的基因资料：PCR反应需要在一定的缓冲溶液中进行。真核生物和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加

。Mg2+1）解旋在能量的驱动下，解旋酶将DNA双螺旋的两条链解开，氢键断裂。解旋酶ATP2）合成引物（补充）在引物酶的作用下，产生一小段RNA作为引物,后期引物会被切除引物酶引物5’3’引物的作用简单理解就是引出DNA聚合酶，因为DNA聚合酶必须识别3’端才能结合上去。引物是一小段能与DNA母链的一小段碱基序列互补配对的

。短单链核酸3）合成子链DNA聚合酶等以解开的每一条母链为模板，以游离的4种脱氧核苷酸为原料，按照碱基互补配对原则，各自合成与母链互补的一条子链。模板模板DNA聚合酶5’3’子链延伸方向子链延伸方向两条子链延伸方向相反，但都是从5’→3’随着模板链解旋过程的进行，新合成的子链也在不断延伸。子链母链母链5’3’5’3’3’3’5’5’子链4）重新螺旋每条新链与其对应的模板链盘绕成双螺旋结构。体内DNA的半保留复制参与的组分在DNA复制中的作用打开DNA双链的氢键提供DNA复制的模板合成DNA子链的原料催化合成DNA子链解旋酶DNA两条母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物使DNA聚合酶能够从引物3′端连接脱氧核苷酸DNA的合成方向总是从子链的5＇端向3＇端延伸。解旋酶5＇端3＇端5＇端3＇端由于DNA双链是反向平行的，所以需要

引物。2种体内DNA的半保留复制PCR技术耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）4种脱氧核苷酸（dNTP-脱氧核苷三磷酸）两种引物待扩增的DNA片段（模板）实际加入的是dATPdGTPdCTPdTTPPPPA脱氧核糖~~PPPA核糖~~ATPdATPPCR技术耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）4种脱氧核苷酸（dNTP-脱氧核苷三磷酸）两种引物待扩增的DNA片段（模板）实际加入的是dATPdGTPdCTPdTTPPPP碱基脱氧核糖~~（A、G、C、T）作用：既可作为合成DNA子链的原料，

又可为DNA的合成提供能量PCR技术耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）4种脱氧核苷酸（dNTP）两种引物待扩增的DNA片段（模板）5’5’变性复性延伸温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。PCR技术变性复性延伸温度：90℃以上温度：50℃左右过程：两种引物通过碱基互补配对与

两条单链DNA结合温度：72℃左右过程：4种脱氧核苷酸在耐高温DNA聚合酶的催化下，根据碱基互补配对原则，添加在引物的_____端，合成新的DNA链。（引物结合在模板链的______端）反复循环过程：目的基因DNA双链受热变性后解聚为单链3’上一轮的产物作为下一轮的模板3’引物的设计设计引物的依据是：目的基因两端的核苷酸序列设计引物的要求使用的一对引物的序列相同吗？不相同，目的基因两端具有不同的核苷酸序列①两种引物内部不能发生局部碱基互补配对（防止引物自身折叠）②两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对（防止引物之间配对，导致引物不能和模板链结合）DNA聚合酶不能从头合成DNA，只能从引物的3′端开始延伸DNA链需要引物的原因是：项目PCR技术体内DNA复制相同点原理原料条件不同点场所解旋方式酶引物特点是否需要ATP温度条件结果碱基互补配对原则四种脱氧核苷酸均需要模板、引物、酶等细胞外（主要在PCR仪内）（主要在细胞核内）细胞内DNA在高温下变性解旋解旋酶催化耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）解旋酶、普通的DNA聚合酶一小段RNA或单链DNA分子片段一小段RNA体外迅速扩增边解旋边复制不需要（dNTP提供）需要需控制温度，在较高温度下进行细胞内温和的条件短时间内可形成大量的DNA片段形成完整的DNA分子PCR技术PCR技术的数量关系复制次数123nDNA分子数含引物的DNA分子数含其中一种引物的DNA分子数同时含两种引物的DNA分子数共消耗引物数共消耗引物对数含等长的DNA分子数PCR技术的数量关系905072℃变性3`5`5`3`PCR技术的数量关系905072℃退火PCR技术的数量关系905072℃延伸PCR技术的数量关系905072℃变性PCR技术的数量关系905072℃退火PCR技术的数量关系905072℃延伸PCR技术的数量关系905072℃变性PCR技术的数量关系905072℃退火PCR技术的数量关系905072℃延伸PCR技术的数量关系复制次数123nDNA分子数含引物的DNA分子数含其中一种引物的DNA分子数同时含两种引物的DNA分子数共消耗引物数共消耗引物对数含等长的DNA分子数22322448811000372614762n2n2n-12n-22n-12n+1-22n-2n思考：

PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中

分离出目的基因？3次PCR技术的数量关系练习1.DNA的复制需要引物，主要原因是(

)A．可加快DNA的复制速度B．引物可与DNA母链通过碱基互补配对结合C．引物的5′端有助于DNA聚合酶的延伸DNA链D．DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链D练习2.下列关于PCR技术的叙述，正确的是（

）A．该技术应用体内DNA半保留原理，也需要模板、原料、能量、酶等条件B．PCR技术建立在对扩增的目的基因序列完全已知的