蜂巢形棉布载体固定化米根霉产果胶酶的半连续化发酵研究毕业论文

蜂巢形棉布载体固定化米根霉产果胶酶的半连续化发酵研究摘要天然纤维素（如橘皮、烟梗）是一种可再生生物质资源，但由于纤维素、半纤维、木质素和果胶等交织在一起形成紧密复杂的结构，造成微生物利用天然纤维素生产乳酸、乙醇等的困难。米根霉在一定培养条件下能产生降解果胶质的酶系。果胶酶被广泛用于食品、纺织、生物技术等领域，其市场需求量日益增长。本文采用一种研究较少但有产果胶酶能力且富有商业价值的安全菌种—米根霉，结合棉布载体固定化细胞的技术进行发酵产果胶酶。采用DNS法测定果胶酶（PEC）酶活力和用粘度法测定聚半乳糖醛酸内切酶（Endo-PG）酶活力。首先从纯果胶发酵产果胶酶出发，考察了固定化发酵与游离发酵差别，优化了纯果胶培养基，优化了培养条件并进行半连续发酵试验，研究了发酵液部分果胶酶酶学性质；然后优化烟梗浸液培养基，优化了培养条件并进行半连续试验，还研究了发酵液中纤维素酶活力变化情况。首先，对纯果胶发酵产果胶酶进行研究。在优化前培养基和培养条件下，固定化和游离发酵相比，固定化发酵48h就达到最大产酶量，缩短发酵时间24h，提高产酶量115%。采用单因素和正交试验法优化培养基，结果表明影响产果胶酶的因素依次为：果胶Tween80Zn2+硫酸铵。发酵培养基为：果胶2.5%，硫酸铵1.5%，ZnSO40.6mmol/L，Tween800.15%，K2HPO40.4%，KH2PO40.4%；在此基础上采用单因素法优化培养条件，结果为：果胶2.5%，硫酸铵1.5%，ZnSO40.6mmol/L，Tween800.15%，K2HPO40.4%，KH2PO40.4%，转速190r/min、装液量50ml/250ml、发酵温度30ºC、发酵初始pH5.0、初始孢子浓度0.75106个/mL，培24h，PEC酶活力和Endo-PG酶活力分别为973.47U/mL和165.08U/mL。通过对粗酶液作用pH和温度的研究，得到PEC和Endo-PG为酸性果胶酶，最适pH为4.5，PEC和Endo-PG最适温度分别为45ºC和55ºC。半连续发酵试验结果表明，在第5批次出现最高PEC酶活力和Endo-PG酶活力，分别为1253.95U/mL和181.94U/mL，分别比首次提高29.8%和18.3%。。然后，对烟梗浸液发酵产果胶酶进行研究。采用单因素和正交试验法优化培养基，结果表明影响产果胶酶的因素依次为：烟梗硫酸铵Zn2+Tween80。发酵培养基为：烟梗10%，硫酸铵1.5%，ZnSO40.6mmol/L，Tween800.05%，K2HPO40.2%，KH2PO40.2%。在此基础上采用单因素法优化培养条件，结果为：烟梗10%，硫酸铵1.5%，ZnSO40.6mmol/L，Tween800.05%，K2HPO40.2%，KH2PO40.2%，发酵初始pH5.0，初始孢子浓度0.5106，，30ºC，装液量50mL，转速170r/min，培养48h，PEC酶活力和Endo-PG酶活力最高分别为361.27U/mL和49.22U/mL。烟梗浸液发酵96h，出现纤维素酶活力高峰，滤纸酶活力和羧甲基纤维素钠酶活力分别为33.25U/mL和83.13U/mL。半连续发酵试验结果表明，在第2批次出现最高PEC酶活力和Endo-PG酶活力，分别为430.83U/mL和51.73U/mL，PEC酶活力比首批次提高约22.8%。关键词：米根霉，果胶酶，聚半乳糖醛酸内切酶，固定化，半连续化发酵ABSTRCTNaturalcelluloseisoneoftherenewableresources,suchasorangepeelandtobaccostem,whicharemadeofcellulose,halffiber,ligninandpectin.Theintertwinedcombinationamongthemleadstoformatightandcomplexstructure,whichishardformicroorganismstodigest.Hence,theproductionoflacticacidorethanolthroughusingnaturalcellulosebymicroorganismsisfacedwithproblems.Rhizopusoryzaehastheabilitytoproducepectinolyticenzymestodegradepectin.Theremoveofpectincanmakeseparationoffiber,fiberandlignineasier.Thereisagrowingmarketdemandofpectinolyticenzymesforthefactthatpectinolyticenzymesarewidelyusedinthefiledoffood,textile,pharmaceutical,papermaking,biologicaltechnologyandsoon.Rhizopusoryzae,whichownstheabilitytodegradepectinandisrichincomercialvalue,isusedtoproducepectinolyticenzymesinthisresearch.TheimmobilizedRhizopusoryzaewithmatrixcomposedofasterisk-configurationfibrousmatricesinahoneycomb-shaped,theproductionofpectinolyticenzymeswerecarriedoutfromcitruspectinandtobaccostempectin.Pectinolyticenzymes(PEC)activitywasdeterminedbyDNSassayandendopolygalacturonase(Endo-PG)activitywasmeasuredbyviscositymethod.Fistly,thepurepectinwasselectedasthesbustrateforfermentation.Then,thecoparisonofenzymesproductionbetweenimmobilizedcellsandfreecellswasmade.Afterthat,optimizationofculturemediumandgrowthconditionswasinvestigatedthroughsinglefactorvariableanalysisandsoon.Also,somepropertiesoftheenzymewereunderreasearch.Finally,optimizationofculturemediummadefromtobaccostemwasinvestigatedthroughsinglefactorvariableanalysisandorthogonalexperiment.Optimizationofgrowthconditionswasinvestigatedthroughsinglefactorvariableanalysis.Sixbatchesofsemi-continuousfermentationwerecarriedoutinshakeflasks.Firstofall,thestudyofpurepectinwascarriedout.ImmobilizedcellshadahigherproductionofPECoverfreecells.Immobilizedcellshadamaxproductionin48hours,whichsaved24hourscomparedwithfreecellsandimprovedproductionby115%.Resultsofsinglefactorandorthogonalexperimentalwithimmobilizedshowedtheorderoffactorsinfluencingtheproductionofpectinasewas:pectinTween80ZnSO4(NH4)2SO4.Thesuitableculturemediawascomposedofpectin2.5%,(NH4)2SO41.5%,ZnSO40.6mmol/L,Tween800.15%,K2HPO40.4%，KH2PO40.4%，rotationspeed190r/min,liquidvolume50ml/250ml,temperature30ºC,initialpH5.0,initialsporeconcentration0.75106/mL.After24hours,thePECactivityandEndo-PGactivitywere973.47U/mLand165.08U/mLseparately.EffectsofpHandtemperatureoncrudeenzymesfluidwerecarriedout.PECandEndo-PGmightbeacidicpectinolyticenzymes.TheoptimumpHwas4.5forPECandEndo-PG,optimumtemperaturewas45°Cand55°Crespectively.ThehighestPECactivityandEndo-PGactivitywere1253.95U/mLand181.94U/mLinthe5thbatch,about29.8%and18.3%higherthanthe1stbatch.Secondly,optimizationofculturemediummadefromtobaccostemwasinvestigatedthroughsinglefactorvariableanalysisandorthogonalexperiment.Resultsshowedtheorderoffactorsinfluencingtheproductionofpectinasewas:tobaccostem(NH4)2SO4ZnSO4Tween80.Thesuitableculturemediawascomposedoftobaccostem10%,(NH4)2SO41.5%,ZnSO40.6mmol/L,Tween800.05%,K2HPO40.2%，KH2PO40.2%，rotationspeed170r/min,liquidvolume50ml/250ml,temperature30ºC,initialpH5.0,initialsporeconcentration0.50106/mL.After48hours,thePECactivityandEndo-PGactivitywere361.27U/mLand49.22U/mLseparately.After96hours,celluloseenzymeactivityreachedapeakwithfilterpaperactivityof33.25U/mLandsodiumcarboxymethylcelluloseactivityof83.13U/mL.ThehighestPECactivityandEndo-PGactivitywere430.83U/mLand51.73U/mLinthe2ndbatch.PECactivitywasabout22.8%higherthanthe1stbatch.Keywords:Rhizopusoryzae,pectinolyticenzymes,endopolygalacturonase,immobilization,semi-continuousfermentation目录摘要 IABSTRCT II1绪论 11.1问题的提出及研究意义 11.1.1问题的提出 11.1.2研究意义 21.2国内外研究现状 21.2.1果胶分布、化学结构和分类 21.2.2果胶酶分类和作用方式 31.2.3果胶酶生产菌种 41.2.4真菌果胶酶的表达调控 61.2.5微生物果胶酶条件优化研究现状 71.2.6米根霉产果胶酶研究进展 71.2.7固定化细胞产果胶酶的进展 81.2.8果胶酶生产过程中的影响因素 91.2.9果胶酶的应用 111.2.10果胶质原料的研究 121.3本课题研究的目的及主要内容 121.3.1研究目的 121.3.2本课题研究的主要内容 121.3.3创新点 132.棉布载体固定化发酵产果胶酶的研究 142.1前言 142.2材料和方法 142.2.1菌种 142.2.2主要仪器和试剂 142.2.3培养基 152.2.4载体的制备 152.2.5发酵培养方法 152.2.6分析方法 162.3结果分析 182.3.1酶液稀释倍数的确定 182.3.2游离发酵与固定化发酵的比较 192.4讨论 192.4.1酶液稀释倍数对酶活力测定准确性的影响 192.4.2游离发酵与固定化发酵 192.5小结 193固定化发酵果胶酶纯果胶培养基的优化 203.1前言 203.2材料和方法 203.2.1菌种 203.2.2主要仪器和试剂 203.2.3培养基 213.2.4发酵培养方法 213.2.5分析方法 213.3结果分析 223.3.1碳源种类的选择 223.3.2果胶浓度选择 233.3.3氮源种类选择 233.3.4硫酸铵浓度选择 243.3.5Tween80对产酶的影响 253.3.6金属离子的对产酶的影响 253.3.7发酵培养基的正交实验 263.4讨论 273.4.1碳源种类及果胶浓度对产酶的影响 273.4.2氮源种类及硫酸铵对产酶的影响 283.4.3Tween80对产酶的影响 283.4.4金属离子对产酶的影响 283.4.5正交实验结果分析 293.5小结 294．纯果胶培养基半连续发酵果胶酶 304.1前言 304.2材料和方法 304.2.1菌种、主要仪器和试剂 304.2.2培养基 304.2.4发酵培养方法 314.2.5分析方法 314.3结果分析 314.3.1转速的选择 314.3.2装液量选择 324.3.3温度选择 324.3.4初始pH的选择 334.3.5初始孢子浓度的选择 334.3.6生长和产酶的时间曲线 344.3.7半连续发酵试验 354.3.8粗酶液部分酶学性质 364.4讨论 374.4.1转速和装液量对产酶的影响 374.4.2pH对产酶的影响 374.4.3初始孢子浓度对产酶的影响 384.4.4产酶与pH变化的关系 384.4.5半连续发酵的稳定性 384.4.6粗酶液部分酶学性质 384.5小结 395.固定化发酵果胶酶烟梗浸液培养基的优化 405.1前言 405.2材料和方法 405.2.1试剂和设备 405.2.2烟梗浸液的制备 415.2.3培养基及发酵培养方法 415.2.4分析方法 415.3结果分析 415.3.1两种制备烟梗浸液方法的比较 415.3.2烟梗浓度的选择 425.3.3硫酸铵浓度的选择 425.3.4Zn2+离子浓度的选择 435.3.5Tween80浓度的选择 435.3.6发酵培养基的正交试验 445.4讨论 455.4.1制备烟梗浸液方法 455.4.2培养基的优化 455.5小结 456.烟梗浸液培养基半连续发酵果胶酶 476.1前言 476.2材料和方法 476.2.1试剂和设备 476.2.2烟梗浸液的制备 476.2.3培养基及发酵培养方法 476.2.4分析方法 486.3结果分析 496.3.1初始pH的选择 496.3.2初始孢子浓度的选择 496.3.3生长和产酶的时间曲线 506.3.4半连续发酵试验 516.3.5最优发酵条件下纤维素酶活力 516.4讨论 526.4.1发酵条件的优化 526.4.2生长和产酶的时间曲线 526.4.3半连续发酵的稳定性 536.4.4发酵过程中纤维素酶活力的变化 536.5小结 537.结论与展望 547.1结论 547.2对后续工作的展望 55致谢 56参考文献 57附录 62蜂巢形棉布载体固定化米根霉产果胶酶的半连续化发酵研究1绪论1.1问题的提出及研究意义1.1.1问题的提出天然纤维素原料如橘皮、烟梗、稻草、玉米秸秆等是被废弃的资源，同时由于其内部纤维素与果胶之间紧密作用造成利用生物技术转化天然纤维素原料时的困难。天然纤维素原料在进行微生物转化过程中，一般需要先进行半纤维素和木质素等预处理过程，然后进行纤维素酶解和微生物发酵产乙醇、丙醇、丁醇、柠檬酸和乳酸等。预处理过程的好坏很大程度上决定了酶解的难易程度，如酶结合性和催化水解率[1]。果胶质的存在对半纤维、木质素去除的有一定程度的影响，主要表现在增加处理过程中溶液的粘度和溶剂的使用量。米根霉在微生物转化纤维素的众多研究中有着重要的地位。米根霉作为一种公认的安全菌，能产生广泛的代谢物，如酶类（如果胶酶等），有机酸（如乳酸等）以及生物乙醇等，有着极大商业价值[2]。果胶酶在食品、纺织、医药、造纸、环境、生物技术、饲料等领域都有广泛应用[3]，这就使得果胶酶的需求量逐年递增。果胶酶生产量占全部工业酶制剂的10%左右[4]，其中在食品酶的销售额中约占到了25%[5]。固定化米根霉的形式可视为特殊的生物活性结构单元，它可以将精制原料如淀粉、葡萄糖等或是天然纤维素原料如玉米秸秆、稻草等转换为乳酸、乙醇等，但还未应用于降解果胶质产酶的研究。国内外在米根霉利用果胶质这一领域尚存在诸多空白，为数不多的研究[6-12]，主要着力在固态发酵产果胶酶酶性质上的研究，如聚半乳糖醛酸酶和聚半乳糖醛酸裂解酶等的性质，未涉及固定化米根霉降解果胶的研究，对产酶培养基和培养条件的研究也不足，因此降解果胶产果胶酶的能力不高。细胞固定化与细胞游离培养相比有许多优势，如细胞密度的增加，细胞产率的提高，细胞分离更加方便从而有利于半连续和连续发酵[13-14]。真菌细胞的固定可以通过吸附于聚合物载体或者包埋于天然聚合物(海藻酸盐凝胶和合成凝胶)。凝胶颗粒包埋细胞易阻碍物质传输，影响发酵能力，还需要耗费时力制备大量凝胶颗粒。棉布载体固定化细胞的方式由于将细胞吸附于棉布表面，同时金属网状支撑骨架利于物质传输，因此菌体形态和发酵效果好。此外，棉布载体还具有重复使用性好和工业组装方便等特点，具有工业化生产的潜力[15]。据此，本文设想将棉布载体固定化米根霉这一生物活性单元引入到降解果胶质产酶的研究中，优化生物活性单元产酶的培养基和培养条件，并进行半连续试验，考察载体的重复使用性和稳定性。1.1.2研究意义本文试图将一种研究较少但有产果胶酶能力且富有商业价值的安全菌种-米根霉，结合以棉布载体固定化细胞的技术，用于降解果胶质的研究，有助于天然纤维素生物转换为下游产品如乳酸和乙醇等，同时收获果胶酶粗酶液。1.2国内外研究现状1.2.1果胶分布、化学结构和分类果胶，最早由Bracennot在胡萝卜中提取得到的[16]。果胶广泛存在于高等植物的根、茎、叶和果实中，水果皮如柑橘、柠檬、柚子等含有约30%的果胶，商品天然果胶多用酸从这些果皮或果渣中提取制得。果胶，分子式为(C6H10O6)n，相对分子质量5万-30万。果胶在高等植物初生壁和胞间层中存在，在初生壁中与木质纤维的微纤丝以及某些伸展蛋白相互交联作用下，使得细胞组织结构坚固,维持细胞固有的形态。它是以α-1,4糖苷键键合D-半乳糖醛酸形成的多糖主链，同时与带有鼠李糖、半乳糖和阿拉伯糖等中性糖侧链共价键合的聚合物。果胶骨架基本单位是D-半乳糖醛酸，同时还含有如甲醇、乙酸和阿魏酸等非糖成分，其中D-半乳糖醛酸上的羧基可被甲基不同程度的脂化。一般可将果胶的结构分为光滑区和须状区,主要由三个结构域组成，即HGA、RG-I和RG-II，其中RG-II常为二聚体形式（如图1.1所示）。果胶有多分子、多分散、多结构，高级空间构象的特点[17]。果胶质可分三类，即原果胶（protopectin）、果胶（pectin）和果胶酸（pecticacid）。1944年，果胶术语制定委员会对果胶物质作出明确的定义，具体如表1.1所示[18]。表1.1果胶物质的定义Tab.1.1Thedefinitionofpecticsubstances分类定义溶解性果胶酸(pecticacid,pectate)完全未甲酯化的聚半乳糖醛酸链，由D-半乳糖醛酸脱水缩合，以α-1,4糖苷键连接形成的直链状聚合物微溶于水果胶(pectin,pectinate)羧基不同程度甲酯化和中和的聚半乳糖醛链，分为低酯果胶(LM)和高酯果胶(HM)可溶于水原果胶(protopectin)存在于未成熟果蔬的细胞壁中，与纤维和半纤维结合的甲酯化聚半乳糖醛酸链不溶于水图1.1果胶的结构简图Fig.1.1Schematicrepresentationoftheprimarystructureofpectin1.2.2果胶酶分类和作用方式果胶酶通常分为原果胶酶、酯酶和解聚酶三种类型：原果胶酶将不溶于水的原果胶降解为高度聚合的可溶性果胶；酯酶通过对甲基的去除，促使果胶酯水解；解聚酶打断果胶质中部分D-半乳糖醛酸的α-1,4-糖苷键，有水解酶和裂解酶之分[19-20]。果胶酶因其最适pH差异，又有酸性和碱性果胶酶之分[21]。果胶酯酶（PE）以随机切除甲酯化果胶中的甲基的方式，导致甲醇和游离羧基的产生。这个过程遵循单链机制：即PE沿果胶分子线性切除果胶中的甲基，但去酯化作用不能进行完全，在酯化度约10%时就会停止。PE对果胶的去酯化作用，有助于聚半乳糖醛酸酶（PG）等其它果胶酶对果胶的降解。果胶水解酶，如PG、PMG等均能水解果胶的糖苷键。果胶裂解酶通过β消除反应使糖苷键断裂，它攻击果胶的糖苷键并在邻近羧基或酯化的羧基一边发生β消除，在半乳糖醛酸的非还原末端形成C4和C5不饱和键。解聚酶又分内切酶和外切酶,内切解聚酶在长链内部随机切断糖苷键,而外切解聚酶从链的非还原性末端依次切断糖苷键[5,22]。果胶酶的分类和作用方式[23]，分别如表1.2和图1.2所示。表1.2果胶酶的分类Tab.1.2Theclassificationofpectinolyticenzymes分类组成1.原果胶酶protopectinases,PPase2.果胶酯酶pectinesterases,PE3.果胶解聚酶depolymerizingenzymes3.1水解酶pectinhydrolases聚半乳糖醛酸酶PG内切酶(endo-PG)polygalacturonases(PG)PG外切酶(exo-PG)聚甲基半乳糖醛酸酶PMG内切酶(endo-PMG)polymethylgalacturonases(PMG)PMG外切酶exo-PMG3.2裂解酶Pectinlyases(PL)聚半乳糖醛酸裂解酶PGLPGL内切酶endo-PGLpolygalacturonatelyases(PGL)PGL外切酶exo-PGL聚甲基半乳糖醛酸裂解酶PMGL内切酶endo-PMGLpolymethylgalacturonatelyases(PMGL)PMGL外切酶exo-PMGL图1.2果胶酶的作用方式Fig.1.2.Modeofactionofpectinases注：(a)R=H为PG作用，R=CH3为PMG作用；(b)R=H为PGL，R=CH3为PL。1.2.3果胶酶生产菌种微生物产果胶酶菌种，可分为真菌和细菌果胶酶产生菌，如表1.3所示。当前国内外研究最热的产果胶酶菌种是黑曲霉，多把它当作果胶酶主要来源。果胶酶是一种组合酶系，不同微生物产生的果胶酶种类和性质不同，如表1.4所示[21]。米根霉（Rhizopusoryzae）：为根霉属，是接合菌亚门、接合菌纲、毛霉目、毛霉科真菌。它的菌落或疏松或稠密，开始为白色，后变为灰褐色或黑褐色。菌丝体匍匐爬行，有无色、无分隔、多核和分支状的特点。它的假根十分发达，分枝呈指根或根状，呈褐色，它的最适生长温度为37°C，因此可在基体表面大量存在，产生不定形菌落。米根霉广泛存在于酒曲、腐烂的植物、动物粪便和土壤等。米根霉利用农业废物，如大麦、木薯、玉米、土豆浆、燕麦和水稻等时，代谢产物为：有机酸、乙醇、水解酶（如聚半乳糖醛酸酶、纤维素酶等）等，有重要工业应用价值。米根霉在一定条件下可分泌果胶酶代谢果胶质产生聚半乳糖醛酸等小分子物质。因在合适的培养基和培养条件下，米根霉利用果胶物质发酵生成的酶类大部分是果胶酶，所以米根霉是一种潜在的生产果胶酶的菌种。表1.3产果胶酶微生物分类Tab.1.3Theclassificationofmicrobialpectinolyticenzymes分类成员组成真菌主要包括：曲霉属(Aspergillus)：黑曲霉(Aspergilutsniger)米曲霉(Aspergillusoryzae)黄曲霉(Aspergillusflavus)日本曲霉(Aspergillusjaponica)、酱油曲霉(Aspergillussojae)青霉属(Penicilum)、镰孢属(Fusarium)、克鲁维氏酵母(Kluyvermyoes)其它：灰霉菌(Botrytiscinerea)、镰孢菌(Fusariumspp)青霉菌(Penicilliumaxalicum)、啤酒酵母(Saccharomycesceroisiae)细菌假单孢菌属(Pseudomonas)、黄单孢菌属(Xanthomonas)、欧文氏菌属(Erwinia)芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)表1.4源自微生物的果胶酶的性质Table.1.4Characterizationofmicrobialpectinolyticenzymes成员种类最适pH最适T(°C)来源产酸性果胶酶：AspergillusnigerCH4Endo-pectinase,Exo-pectinase4.5-6.03.5-5.0＜50Acuna-Arguellesetal.,1995PenicilliumfrequentansEndo-PG4.5-7.550Borinetal.,1996SclerotiumrolfsiiEndo-PG3.555ChanneandShewal,1995RhizoctoniasolaniEndo-PG4.850Marcusetal.,1986MucorpusilusPG5.040Al-Obaidietal.,1987CloctridiumthermosaccharolyticumPG5.5-7.030-40Rijsseletal.,1993产碱性果胶酶：Bacillussp.RK9PGL10.0—FogartyandKelly,1983Bacillussp.NT-33PG10.575Caoetal.,1992BacilluspolymyxaPG8.4-9.445NagelandVaughn,1961BacilluspumilisPATE8.0-8.560DaveandVaughn,1971Amucolasp.PAL10.2570Bruhlmannetal.,1994XanthomonascompestrisPATE9.525-30NasumoandStarr,1967BacillusNo.P-4-NPG10-10.565Horikoshi,1990BacillusstearothermophillusPATE9.070KarbassiandVaughn,1980PenicilliumitalicumCECT22941PL8.050Alanaetal.,1990Bacillussp.DT7PL8.060Kashyapetal.,2000BacillussubtilisPAL8.560-65ChessonandCodner,1978Pseudomonassyringaepv.GlycineaPAL8.030-40Magroetal.,19941.2.4真菌果胶酶的表达调控大多数真菌PG是分泌型胞外酶且需要底物诱导，同时菌株要在诱导物存在条件下才能分泌PG，诱导物包括：果胶、聚半乳糖醛酸、低浓度半乳糖醛酸及其寡聚体，而速耗碳源（如葡萄糖等）、较高浓度果胶降解产物（如半乳糖醛酸等）、抗体以及植物PG抑制蛋白会抑制真菌表达PG[24]。Li等[25]在核盘病菌(S1sclerotiorum)的研究中发现：以1%橘皮果胶作为碳源的培养基中，随着S1sclerotiorum菌体量的增加，培养液中PG活力逐步升高；在含有1%半乳糖醛酸的培养基中培养一段时间，虽然能检测到PG酶活力，但比在橘皮果胶的培养基中低，而在以葡萄糖为碳源的培养基中培养，没有检测到明显PG酶活力。Maldonado等[26]发现Aspergilutsniger产生PG的过程可被葡萄糖完全抑制，但以前的研究已表明葡萄糖并不抑制PG活性，也就说明培养基中葡萄糖的存在对PG合成不利。在培养基中的葡萄糖消耗完时，菌株又可在底物的诱导作用下合成PG，这说明葡萄糖对PG产生的抑制是可逆的，进一步研究表明葡萄糖的抑制作用是发生在翻译水平上。Piccol等[27]发现蔗糖的存在对P.expansum产生PG有抑制，该抑制作用发生在转录水平上且可逆。Aguilar等[28]则在曲霉研究中发现，葡萄糖对PG合成的影响与葡萄糖浓度以及加入培养基的时间有很大关系。为解释不同碳源对合成果胶酶的影响，Ros等[29]探究了碳源的不同类型对Rhizopusnigricans产果胶酶的影响，Nair等[30]则研究了不同碳源对6种曲霉产果胶酶的影响。Stratilova等[31]对Aspergilutsniger的研究表明,培养基pH和碳源种类可明显影响PG的合成。Geoecze等[32]对P.expansum的研究表明，培养基中酵母提取物的存在对PG的产生有着不利的影响，PG酶活力与培养基的pH有一定的关系，产酶的高峰出现在培养基显酸性时。在PL的研究中，也发现受到类似调控的情况。真菌PL的产生受到低浓度的半乳糖醛酸诱导。在稳定期，高浓度果胶（5%）产酶较低，表明高浓度的半乳糖醛酸或某一代谢物会产生自我降解物阻遏。在葡萄糖存在的情况下，产酶会降低到基础水平[33-35]。综上，可认为作为真菌成员之一的米根霉，产果胶酶的过程如下：在果胶、聚半乳糖醛酸、低浓度的半乳糖醛酸及其寡聚体的诱导下，米根霉能较多的分泌胞外果胶酶；在快速消耗碳源如葡萄糖、蔗糖等存在的情况下，可能会抑制米根霉果胶酶的表达，该抑制作用发生在转录水平且可逆，同时添加快速消耗碳源的时间点不同，对果胶酶产生有着不同影响，若在先有果胶底物存在的情况下后加入快速消耗碳源，会使产酶出现停滞和降低，反之，可能受到的影响较小；较高浓度半乳糖醛酸或果胶其它的代谢产物会产生自我降解物阻遏，从而影响产酶；此外抗体、植物PG抑制蛋白等可以抑制米根霉表达PG。1.2.5微生物果胶酶条件优化研究现状从上个世纪60年代起，我国开始从事产果胶酶的微生物筛选、酶学性质、生产工艺及工业应用等方面进行研究，研究主要集中在曲霉属，其中又以黑曲霉为主。在选育菌株工作的同时，进行培养基成分和培养条件优化，以期提高果胶酶酶活力。一些国内外在培养基成分和培养条件的优化方面的研究，如表1.5中所示。表1.5微生物产果胶酶条件优化Table.1.5Optimizationofpectinolyticenzymesproduction菌种优化方法结果来源嗜碱菌AL-103碳源果胶为碳源时酶活达最高张鸿雁[36]霉菌As2接种量接种量为30%时酶活较高全桂静等[37]曲霉培养基Tween-800.15%酶活提高邬敏辰等[38]HDDMG05培养基最大产酶量8100U/mL蔡柏岩等[39]Peacilomyces.clavisporus2A.UMIDA.1温度液体培养产酶温度为30°CSouzaJVB等[40]吉氏芽孢杆菌S-2无机盐离子Ca2+对该酶有明显的激活作用，Mn2+、Cu2+、Zn2+对该酶有强烈的抑制作用张保国等[41]MHZP-01、MHZP-02pH最适pH值均为5.0葛菁萍等[42]Alkalibacteriumsp.F26培养基培养条件酶活达1015U/mL李建洲等[43]黑曲霉培养基培养条件比优化前提高8.7倍陈勇强[44]黑曲霉P-6021细胞固定化产酶上升，酶活达664U/mL钟卫鸿等[45]草酸青霉L5培养基培养条件是初始酶活的3倍蓝丽精等[46]黑曲霉(MTCC:281).培养基培养条件酶活达6.1U/mLPalaniyappanM等[47]1.2.6米根霉产果胶酶研究进展米根霉的果胶酶基因组的研究表明，富含GH28，13个基因编码Endo-PG和3个基因编码Exo-PG，6个基因编码PME。因此，米根霉降解果胶分泌的最主要酶是PG。Endo-PG作用于果胶光滑区，即同型半乳糖醛酸（HG）长链上，随机水解α-1,4-D-半乳糖醛酸；Exo-PG从HG链非还原末端开始水解HG链。丰富的主链降解酶和少量的辅酶存在，导致倾向于降解无支链果胶。PME的数量较多可以表明PG对没有酯化的果胶的亲和力高[48]。Saito等[7]在米根霉利用土豆浆发酵产乳酸和乙醇的研究中，发现米根霉NBRC4707的PG活力比NRRL395高1倍，导致NBRC4707产乳酸和乙醇更加高效，得到在发酵过程中添加果胶酶能提高乳酸和乙醇的产量的结论。经过纯化和分析，测得PG相对分子质量为31kDa，最适pH为4.5，最适温度为45°C。Hamdy[8-9]在米根霉利用橘皮进行固态发酵的研究中，在浸离液中发现高纤维素酶活力和高果胶酶活力，经过纯化和分析，认定该果胶酶为PL：Km为3.87mg/mL，Vmax为297U/mL，Kcat为5.94mgU/min，相对分子质量为37kDa。Kareem等[10]在米根霉利用橘皮（35%w/v）固态发酵产果胶酶的研究中，得到粗酶液酶活力为1360U/mL，并把其应用于橘子果汁的澄清。Hart等[11]在米根霉利用橘汁加工过程中的副产物橘子浆固态发酵产果胶酶的研究中，发现其主要产物为PG，极少有PE和PL产生，因此在柑橘工业中显示出潜力。Yoshida等[12]在米根霉利用果胶液培养基发酵的同时浸渍桑树根，发现只有PG、PGL和PL这三种果胶酶，其中PG在浸渍中发挥主要作用。综上所述，米根霉的果胶酶基因组的研究表明，米根霉有大量产果胶酶的潜力；米根霉发酵分泌果胶酶的研究表明，研究多集中在酶性质上，缺少对培养基和培养的优化，因此酶活力不高。1.2.7固定化细胞产果胶酶的进展固定化细胞（Immobilizedcells）是指固定于非水溶性载体上的细胞，固定后的细胞只能在有限的空间范围进行生命活动。这项技术源自20世纪70年代，它是一种获得酶和代谢产物的方法，是在固定化酶技术的基础之上发展起来的。固定化的细胞能仍能正常的进行生命活动，所以又被称为固定化增殖细胞。微生物（如真菌等）固定化细胞方式依据对细胞作用原理不同，主要有包埋法和吸附法。包埋法是通过多空载体将细胞包埋在其内部的方法，可分为凝胶包埋法和半透膜包埋法，前者的应用较广泛。吸附法是依据细胞（带负电）与吸附剂之间的多种作用如静电、表面张力和粘附力等，从而将其固定在吸附剂表面或内部最终形成生物膜的方法，吸附剂有硅藻土、多孔材料（如陶瓷、玻璃和塑料等）、金属细网、微小载体以及中空纤维等。用于固定化细胞产果胶酶的研究已经设计了众多的载体和方式。表1.6总结可具有代表性的一些研究发现。聚氨酯泡沫(PUF）由于具有化学的稳定性和机械可塑性，故在生物处理过程中的应用较多[49]。海藻酸盐凝胶珠由于具有化学稳定性好、无毒性、制备过程简单、包埋细胞效率高和原料价格便宜等特点，所以常用它固定化细胞。纤维类材料具有许多适于固定化细胞的物理化学性质，来源广泛且价格便宜。钟卫鸿等[45]用PFU（0.7g/50ml培养基）固定化AspergillusnigerP-6021发酵产果胶酶，重复5批次，发酵液酶活达到664U/mL，比游离提高约2.3倍。Kuhad等[50]在用PUF固定化Streptomycessp.RCK-SC的研究中，将1gPUF微粒（1cm2/个，密度32kg/m3，粒径100-500μm）放入装有50mL优化后培养基的250mL锥形瓶中，并接入种子培养基，每间隔24h换入新鲜的培养基，连续培养10天，在第5批次酶活达到最大101U/mL，比游离发酵产果胶酶酶活力提高33%。Kapoor等[51]的研究表明，利用PFU作为基质固定化Bacillussp.MG-cp-2生产聚半乳糖醛酸酶，重复发酵30天，比游离发酵提高1.5倍（147U/mL）。Edwil等[52]用海藻酸钙凝胶珠（直径3.5-4.5mm）固定化Aspergillussp.CC1发酵产PG，经6批次半连续发酵，PG酶活力有所提高，在第4批次达到10.8U/mL，比游离的提高约1.2倍。Nighojkar等[53]在对海藻酸钠凝胶珠、戊二醛处理的海藻酸盐凝胶珠和聚乙烯醇-海藻酸盐凝胶珠包埋Aspergillusniger产PG的研究中，发现海藻酸钠凝胶珠（接入比1:4）效果较好，首批次PG活力为953±15U/L，半连续发酵使用6个周期内PG下降不大。林绍辉等[54]以卡拉胶为载体的固定化Aspergillusniger9.203产果胶酶，进行5批次的重复产酶，稳定性良好，酶活最高为86.70U/mL。Catarina等[55]在循环流动的填充床反应器中，用经过碱处理的谷物纤维素为载体固定KluyveromycesmarxianusCCT3172细胞进行连续不间断产果胶酶，产率可达0.98UmL-1h-1。Marília等[56]在用橘皮固定化AspergillusnigerURM5162产PG的研究中，得到此橘皮固定床反应器产endo-PG酶活力和exo-PG酶活力分别为1.18U/mL和4.11U/mL。Darah等[57]的研究表明，在100mL优化过的培养基中，加入6个经预处理过的百洁布(scouringpad)方块（1cm3）固定化AspergillusnigerHFD5A-1，在第6天果胶酶活为11.05U/mL，比游离提高335.0%。表1.6固定化微生物发酵生产果胶酶的研究现状Table.1.6Progressinpectinolyticenzymesproductionbyimmobilizedmicroorganisms菌种固定化载体操作方式和周期果胶酶活力参考文献AspergillusnigerP-6021聚氨酯泡沫180h重复5批次664U/mL钟卫鸿等2001Streptomycessp.RCK-SC聚氨酯泡沫10天10批次重复发酵101U/mLKuhad等2004Bacillussp.MG-cp-2聚氨酯泡沫30天30批次147U/mLKapoor等2000Aspergillussp.CC1海藻酸钙凝胶珠6批次重复发酵10.8U/mLEdwil等2009Aspergillusniger海藻酸钠凝胶珠6周期发酵953±15U/LNighojka等2006Aspergillusniger9.203卡拉胶20天5批次重复产酶86.70U/mL林绍辉等1997KluyveromycesmarxianusCCT3172谷物纤维素循环流动填充床生物反应器连续发酵0.98UmL-1h-1Catarina等2003AspergillusnigerURM5162柑橘皮橘皮固定床反应器，7周期7批次重复发酵1.18U/mL(Endo-PG)4.11U/mL(Exo-PG)Marília等2013AspergillusnigerHFD5A-1百洁布10天5批重复发酵11.05U/mLDarah等20141.2.8果胶酶生产过程中的影响因素碳源碳源是菌体合成自身骨架所必须的主要物质，约占到细胞干重的50%。不同微生物对碳源的利用能力不同，米根霉可利用的碳源广泛，如葡萄糖、淀粉、蔗糖、果胶等，甚至可以利用工业农业的废弃物资源，如烟梗，秸秆等。碳源对微生物生长和合成代谢产物有着十分重要的影响。不同微生物合成果胶酶所需的碳源种类和浓度有所不同，合适的碳源种类能使微生物大量产果胶酶，反之若存在对产酶不利的碳源，会抑制果胶酶的产生。可溶性糖，如葡糖糖、蔗糖等会影响微生物产果胶酶。Aguilar等[28]在曲霉的研究中发现，葡萄糖对PG活力的影响与葡萄糖浓度以及加入培养基的时间有极大关系。Ciza等[58]研究葡萄糖对P.oxalicum合成果胶酶的刺激和抑制作用，发现高果胶酶（PG、PME、PL）酶活力出现在葡萄糖浓度范围在0.5%-1.0%且果胶（DM=71%）浓度2%时。此外，任意两者的变化要遵从一定比例，果胶与葡萄糖的比例应在2-4，高浓度（1%）的葡萄糖会相当的抑制PME和PG酶活力。然而，Rehman等[59]在没有加入葡萄糖的情况下，发现BacilluslicheniformisKIBGE-IB21产果胶酶活力。Piccol等[27]发现蔗糖对P.expansum产生PG有抑制，该抑制作用发生在转录水平且可逆。Esawy等[60]在利用柠檬皮作为唯一碳源和固定化AspergillusnigerNRC1ami工业化产果胶酶，然而某些菌株需要诱导物去刺激其生产果胶酶，有时蔗糖可以替代葡萄糖的作用。进一步，Juwon等[61]在研究中发现Trichodermaviride-1001BITRS液态发酵产PG时，碳源浓度0.2%，同时控制pH维持在6，考察四种碳源（果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖）产PG酶活力，在24h后果糖产PG酶活力（3033U/mL）高于蔗糖PG酶活力（2816.7U/mL）。研究也表明在10天的培养中，第3天PG酶活力已经达到最大，从第4天到第10天PG酶活力很低。氮源氮源被菌体用于自身细胞物质构成和含氮的代谢物的合成。氮源可分为无机类（如硫酸铵，氯化铵，硝酸钠等）和有机类（如酵母提取物，蛋白胨等）。微生物对氮源有选择性的利用特点。不同微生物产果胶酶高低受到氮源以及其组合形式的影响。在微生物产果胶酶的培养基中，无机氮源往往比有机氮源更容易被吸收，尤其是以铵盐形式存在的氮源，如硫酸铵等。Guiraud[62]指出，以铵盐形式存在氮最易被微生物吸收，Ciza等[58]的研究表明两种氮源的复合，仅仅提高PG酶活力，而PME和PL酶活力会受到削弱。与此相反，酵母提取物为唯一氮源可以提高PG和PL酶活力。Rehman等[59]以酵母提取物和硝酸钾的复合氮源的研究表明，仅在48h就得到较好的产酶。无机盐无机盐影响微生物细胞的生理功能，它是酶活性中心的组成部分，使大分子和细胞的结构变得稳定，使细胞渗透压处于平衡状态，还对细胞氧化还原电位进行调控，还作为微生物的能源物质等。微生物发酵产果胶酶常用的无机盐有K2HPO4，KH2PO4，MgSO4，ZnSO4，FeSO4等。菌体形态菌体的不同形态如缠绕丝状和紧凑球状，均会影响培养基的粘度和微生物代谢作用。游离菌体会引起发酵液粘度增加，降低气-液传递效率（如氧气的溶解，二氧化碳的释放等）和代谢产物同质性。球菌与游离菌相比可以解决这个问题，但是球菌过大会阻碍菌体内部物质的传递，造成所需产物的得率的降低。初始孢子浓度，底物，pH，温度，供氧和搅拌速度等是影响真菌形态的主要因素[63-66]。通过载体固定化细胞产果胶酶的方法，对菌体形态有一定的控制效果，传质效率得到了加强，果胶酶的生产因此得到提高。pHpH的改变，会使微生物细胞原生质膜的电荷的改变，从而对微生物生长发育产生重要影响。最适pH的选择的关键是需要在有利于菌体生长增殖的前提下，最大限度的获得所需产物。微生物在发酵过程中发酵液的pH处于变化状态，这与培养基的组成有关，还与微生物自身有关。不同微生物合成酶（如果胶酶等）的最适pH不同，即使同种菌体合成酶的类型与酶系组成，也会因pH的变化有不同程度的调整和变化。pH在发酵过程中的变化往往有规律可寻，所以pH是反应发酵状态是否正常的重要指标。溶解氧好氧微生物（如米根霉）发酵时，主要利用培养基中的溶解氧。增加培养基的溶解氧，可以增加氧推动力，使更多的氧进入细胞，以满足微生物新陈代谢。溶解氧的增加可以通过搅拌装置（旋转床式反应器）和通气装置（气升反应器）等实现，在进行摇瓶发酵试验中，可以通过转速和装液量等调节培养基溶解氧含量。温度温度对微生物生长和代谢产物合成的影响是众多因素综合作用的体现。培养温度升高伴随着酶反应速率增加，使得微生物生长代谢加快，因此产物得以提前产生，但温度的升高也加快了酶的失活，菌体也容易衰老，对合成产物造成影响。温度对发酵液中溶解氧含量有直接的影响。温度还对产物合成方向，酶系组成及酶学性质等有不同程度的影响。1.2.9果胶酶的应用在食品加工中的应用=1\*GB3①果汁生产和