基因工程制药技术

第二章基因工程制药技术获得目的基因组建重组质粒构建基因工程菌（或细胞）培养工程菌产物分离纯化除菌过滤半成品检定成品检定包装制备基因工程药物的一般程序上游阶段下游阶段

基因工程菌构建流程一表达载体构建表达载体设计目标基因的定位克隆酶切反应连接反应转化筛选与鉴定1.表达载体的设计表达载体概念：expressionvector在质粒载体的基础上，在多克隆位点处插入外源基因表达盒所构成。外源基因表达盒(操纵子模型)：2、目标基因PCR定位克隆PCR循环PCR扩增的反应体系组成模板DNA：目标序列,100－10000bp,pg引物：两条寡核苷酸，21～27bp。脱氧核苷酸：4种dNTP,即dATP,dCTP,dGTP,dTTPDNA聚合酶:Taq聚合酶，耐高温缓冲溶液：50mMKCl、10mMTris-HCl,1.5mMMgCl23.酶切反应和连接反应限制性核酸内切酶连接酶4.转化、筛选与鉴定非转化子：没有导入外源DNA的非转化宿主细胞转化子：导入外源DNA的转化细胞非重组子：仅含有空载体分子的转化子重组子：含有重组DNA分子的转化子目标重组子：含有连接正确的重组分子（目的）非目标重组子：不含目的基因重组子转化后的细胞类型筛选方法将外源基因导入宿主细胞以后，首要任务是筛选含有目的基因的阳性克隆并加以扩增。所用的方法主要有遗传学方法、免疫学方法、核酸杂交法、PCR等。（1）遗传学方法A.抗生素筛选法a.单抗生素筛选大多数克隆载体带有抗生素抗性基因，如氨苄青霉素（ampicillin,Amp）、四环素(tetracycline,Tet)、卡那霉素(kanamycin,Kan)抗性基因。带有完整抗生素基因的载体转化宿主菌后，其宿主菌能在含有相应抗生素的琼脂平板上生长。b.双抗生素筛选双抗生素筛选结果示意图B.蓝-白筛选（α互补）许多载体（如M13系列、pUC系列、pGEM系列）都含有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和氨基端145个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点。这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主细胞。宿主和载体编码的片段各自均无酶活性，但它们可以互补形成具有酶学活性的蛋白质。这种现象称为α互补。

因此，当载体的多克隆位点没有插入外源DNA片段时，α互补能正常进行，产生有活性的β-半乳糖苷酶。能使人工底物X-gal变成蓝色,产生蓝色菌斑或菌落。如果载体的多克隆位点插入了外源DNA片段，导致产生无α互补能力的氨基端片段,带重组体的细菌形成白色菌斑或菌落。（2）免疫学方法

如果克隆基因的产物是已知的，并且在菌落或噬菌斑中表达，因而可用相应的抗血清或单克隆抗体，通过放射免疫、化学发光或显色反应进行筛选。（3）核酸杂交法

对菌斑或菌落进行原位分子杂交是从基因组文库、cDNA文库或重组质粒中筛选目的基因的最有效的方法之一，而且这种筛选不取决于目的基因是否表达。菌落原位杂交的原理鉴定方法菌落PCR：是否含有目标基因载体大小：电泳检测酶切鉴定：插入片段大小及插入方向测序确证：目标基因的序列准确无误，阅读框架通读二基因铲工程菌的债构建基因工程蹲菌：微生物为挑操作对象且，通过基蛛因工程技压术获得的纺表达外源悼基因或过皂量或抑制演表达自身疏基因的工巧程生物体沈。基因工朋程菌种类：细菌和酵店母是重要需的表达重大组药物的养制药生物凭。1.大孙肠杆菌包表达系嫂统细胞：抓G－，郑单细胞认，杆状泛。鞭毛姿，无芽拌孢，一意般无荚背膜。裂香殖。菌落:蛇白色至帆黄白色亦，光滑亲，直径撑2－3励mm。大肠杆浪菌表达魔系统是发展最撒早、应然用最广拔泛的经允典的表霞达系统优点：遗传背慰景清楚套、目标讨基因表机达水平姥高（高龙达70倍％），践培养周染期短，衔抗污染验能力强缺点：以包涵稼体形式常表达的为重组蛋透白丧失奋了原有沸的生物租活性不能用于连加工修饰希化（糖基缠化、酰胺逝化）蛋白轮表达细胞死亡组后，细胞维壁脂多糖再游离出来倦，形成内聪毒素，具猪有抗原性残，产生热原基因工程侮大肠杆菌寄的应用多肽类鸭2种（锋甲状旁追腺激素呜(1-睛34)网、利尿饱钠肽）激素：胰部岛素及2概种突变体蚁、8种生盟长素(1留种PEG溪化)细胞因子米类：5种敬干扰素α切（1种P甚EG化）怠、干扰素岗β和γ，贺2种G-引CSF(拆1种PE锅G化)，录白介素-帽2、白介倍素-11灯、白介素沫-1拮抗租剂溶栓酶类轧：rPA白喉毒素司-IL龙2融合蛋排白、Os那pA脂蛋萍白（疫苗示）等PEG聚乙二醇恼（PEG浑）是中性舰、无毒且捕具有独特无理化性质晃和良好的度生物相容叙性的高分筝子聚合物霸，也是经宏FDA批桃准的极少橡数能作为袜体内注射嘴药用的合禽成聚合物怜之一。具有高度虹的亲水性乎，在水溶派液中有较际大的水动木力学体积卧，并且没宅有免疫原姐性。当藕移联到药物增分子或药充物表面时劳，能防止肾小伏球滤过减少免疫嘱原性阻止蛋怀白酶降仁解2.酵母表达向系统细胞：单钓细胞真核印生物，球归形、椭圆霞形、卵形号。繁殖：芽剑殖、裂殖撑。在特定仓条件下才削产生子囊亲孢子。菌落：畅乳白色射，有光铲泽，边副沿整齐才。优点：安全、森无毒。营养缺购陷选择没外来质旦粒。培养条惯件简单胃、大规荡模培养北技术成蹲熟。亚细胞器霜分化，进索行蛋白质户的翻译后外正确修饰仰和加工，样并具有良赌好的蛋白肆质分泌能等力。缺点：酿酒酵侨母发酵买产生乙辅醇，制迎约了高挪密度发崖酵。修饰的蛋笔白质糖基尸化侧链过喇长，会引购起副作用制。基因工覆程酵母折的应用198絮1年H便itz乎man掩等：酵字母表达最人干扰怨素激素类瞎：6种搞人胰岛治素及1丝式种突变嫁体，尿隆酸水解门酶和水准蛭素；细胞因惧子：G卸M-C犹SF和度血小板朝衍生生析长因子多肽类絮：高血栏糖素2种乙肝衣疫苗等。水蛭素水蛭素舍：从水蛭唾猴液中提取的天然讯特效凝资血酶抑险制剂天然水蛭咳素是由6科5个氨基打酸组成的哈多肽化合悲物，在低孙于70摄进氏度的环于境温度下搁都能保持演活性。它扒溶于水，烈能够阻止牵血液中纤巩维蛋白的可凝固，抑牢制凝血酶仔与血小板稀的结合，酷有极强的卖溶解血栓喝作用。重组水蛭像素是用基酬因工程通唐过大肠杆海菌、噬菌钥体或酵母借菌表达产阶生，其氨妻基酸序列层和结构与渡天然水蛭榴素唯一不茶同的是其犁63位酪氧氨酸残基既未硫酸化疲，该特点艘使其对凝返血酶的抑俊制作用明饮显降低，文仅为天然稀水蛭素的阻1/10茫。但这种济方法能获蜻得相当量火的重组水雪蛭素，所吸以极大地胖推动了水携蛭素的药恢理、临床匀等方面研暗究工作的畜深人开展泼。三基因工程出菌的培养与发寨酵（1）培养基洁组成与震控制碳源氮源无机盐选择剂诱导物碳源大肠杆菌酒：蛋白胨营等蛋白质葵的降解物宗作为碳源酵母：利滋用葡萄糖灶、半乳糖朱等单糖类遗物质。添加低浓晋度的单糖喉和双糖及皮其他有机模物如甘油朴等对菌体巾生长具有雹一定的促晋进作用。浓度稍百高后就增表现出剩底物抑屯制作用另。葡萄糖美优先利迅用会造甜成培养糟基的酸啄化。氮源直接很况好地吸垄收利用朋铵盐等征，一般雹不能利寇用硝态瓶氮。几嚷乎都能脱利用有挥机氮源早。不同工挪程菌对的氮源利妄用能力赞差异很蛾大，具阵有很高霜的选择宪性。大肠杆菌前：利用大坛分子有机峡氮源，酵拌母粉等。酵母：封利用氨巧基酸为晴氮源无机盐磷、硫、鸟钾、钙、兵镁、钠等戴大量元素摄和铁、铜惑、锌、锰政、钼等微压量元素的军盐离子形悔态基因工程涨菌生长提的供必需的花矿物质。选择剂趟sel膊ect酬ive创ag滋ent维持工茂程菌的妻纯正性超和质粒罚的稳定狡性的化轿合物。发酵培养临过程中质邪粒容易丢弦失，使之啦成为宿主鸽菌为了保众证质粒的爬稳定性，忽不丢失，根据质比粒上的怕营养缺遭陷或选证择性标给记基因训，添加杠或缺陷妄选择剂蝇。诱导物诱导表尽达型工障程菌：屯在细胞访生长到送一定阶蛙段，必拐需添加勒诱导物屯，以解但除目标愤基因的唇抑制状沉态，活种化基因蓬，进行轿转录和薄翻译，定生成产闻物。诱导物协成为产逮物表达奴必不可思少的。Lac袜启动子秩表达系翻统：I哭PTG梨诱导。甲基营秋养型酵丈母：加般入甲醇沉进行诱躬导2.培养充工艺与控朽制温度溶解氧pH大肠杆吼菌和酿碰酒酵母薪生长最机低温度家为10瞧℃大肠杆菌辫生长最适晓温度为3完7℃，最筝高温度为俯45℃。酿酒酵属母生长额最适温瓶度为3播0℃，扫最高温垂度为4吹0℃。温度对工门程菌发酵系的影响两段变气温发酵蠢培养：前期：较徐高温度发门酵，获得据足够高的博菌体密度煎；后期：忠较低温披培养发盒酵，对慰菌体合区成目标驴产物的牛抑制不饮明显，惧但可有书效抑制滤目标产崖物的降枯解和包多涵体形唯成，总敢体提高签工程菌丹的生产乒能力。温度诱秧导型大钳肠杆菌夏表达系阀统：生咐长期维输持37堪℃，生树产期提印高温度轰42℃鼻。温度控制pH值说对发酵把的影响细菌喜激欢偏碱舒性：大自肠杆菌窜适宜p筒H为6评.5～放7.5透，真菌喜欢微微酸性：献酵母适宜僚pH为5倘.0～6象.0。影响产茄物稳定街性，最输适生长极和最适马生产p圾H不同打。干扰素权是在酸雨性条件慢下稳定染，而在胀碱性条号件下容正易降解掌。酸性睁环境有烤利于发尚挥菌株挨生产能票力。乙酸的产生使密菌体生长老速率下降乒，也抑制桂基因表达脆。pH值围控制了解发酵豪过程中各贿个阶段的志适宜pH纸以后，需弱要进一步诵设法控制打pH在合船适的范围慨内。分阶段控珠制pH：根据试火验结果来确定努生长最搬适pH维和产物珠最适p六H，以丹达到最毙佳生产胶。溶解氧控剂制工程菌是单好氧微生键物，生长角过程需要汪大量氧。从供应淋量和需撞要量（鹅菌体生同长、质砖粒稳定啄性、产留物积累械）二个诊方面考敏虑，使膜之需氧淋不超过惑设备的维供氧能日力考虑溶氧轻对质粒稳欣定性的影捎响：调节流搅拌转速乳和通气量四重组人干胳扰素生产舒工艺概念：枝（in亭ter膝fer手on，碗IFN伏）机体受到例病毒感染胜时，免疫漠细胞产生针的一组结睛构类似、雾功能接近双的细胞因醋子功能：干狡扰病毒在断细胞内的锦繁殖天然干扰紧素分类：I干谎扰素：I规FNα、弄IFNβ服、IFN醉τ、IF锄Nε、I砌FNωII迅干扰素：恶IFNγ上市重放组干扰犹素:醋α2a污、α2弦b、α锄1b、定β1b随，γ研发中而的重组册干扰素液：IF你Nω枯，临床滋阶段广谱抗病阵毒活性（岔rhuI倡FNα）慢性乙熟型、丙扁型、丁堡型肝炎麻；疱疹滩、病毒乳性角膜惯炎。直接抗肿萝瘤活性（拳rhuI错FNα）毛液细胞和车慢性髓葛样白血少病、K熄apo丧si肉纤瘤、非嘱霍奇金郑淋巴瘤恭。免疫调节坟活性——治疗慢性目肉芽肿瘤斜（rhu朋IFNγ背）多发性绘硬化症欢rhu监IFN炕β重组干能扰素的讽临床应怕用体外诱赶生干扰漂素制备宋工艺：泊Sen晋dai绝病毒诱度导人白止细胞干扰素生堪产工艺路市线（1）198兼9年：斤IFN众α-n科3/A皱lfe侍ron怕，批准弟上市产量低：科1gI罚FNα，海需要3亿昨ml人血颗白细胞来源困虚难，工骑艺复杂溜，收率财低，价琴格昂贵潜在的纹血源性镜病毒污炼染的可浇能性人源转化吧细胞系培迟养生产工未艺：干扰素生嫩产工艺路鸦线（2）199予9年：己IFN导α-症n1/宝Wel久lfe糊ron质,批吃准用于输临床。优点：首改次实现大虎规模商业捧化生产。缺点：暖活性低技，退出弟临床应议用。基因工律程大肠吩杆菌发劳酵生产高工艺：干扰素生全产工艺路蒸线（3）上市产品防：重组人徒干扰素r趣huIF揪N1众986残，rh字uIF逮Nα-计2a，银rhu幅IFN惨α-2丛b；19芳90，r膝huIF撞Nγ-1洋b；19客93，r将huIF朗Nβ-1却b；20堪01－2妻002：惹PEG化辽IFN，言PEG-伴Intr协on,绸Pega东sys表达产物华：无糖基浆化，N-召met，圣无活性包剖涵体工艺特梢点：发尊酵过程甚，随后长变性、肃复性过健程。干扰素生絮产工艺路匀线（4）动物无限制细胞系培乖养生产工阁艺：上市产品馒：rhu爷IFNβ间-1a19络96，A栽vone搁x(Bi启ogen湖)；20米02，R志ebif思(Ser诸ono)表达产财物：1黑66码aa糖掏基化蛋荡白，2够2.5决ku工艺特份点：分漂泌表达避，产量光低，成霞本高,旷过程严井格宿主：修腐生型删假单胞膜杆菌（悟Pse匀udo童mon木as距put豪ida族）上市产品在：IFN匆α-2插b/安福常隆表达产物谷：无糖基睡化可溶性牺蛋白质，肯具有天然疏分子结构堵和生物活域性工艺特点粱：发赖酵周期崭短：几猾个小时无漫需变性盖、复性表过程，寨获得有剪活性产剃品纯化科过程：淘村汰抗体亲灿和层析干扰素恩生产工芝艺路线状（5）五转犬基因动堂物技术主要步岩骤：获取外窄源目的玻基因外源目的罢基因导入棒生殖细胞伸或胚胎干勒细胞选择携么带目的龟基因的盲细胞，捉选择体暂外培养彻系统和额宿主动沿物转基因耕胚胎的沿发育及幕鉴定筛选所谅得的转跌基因动灯物经典的技哪术路线目的基因显微注射已交配的取出移植受体动给物妊娠供体动瓜物积受熟精卵资输卵管馆转基壳因动物缺点：注聪入目的基批因的命中眼率低，目扣的基因的面整合率低嫌，受精卵牵移植的受遇孕率低。转基因动晴物的技术静路线整合胚胎轰移植的技罪术路线转基因兵动物完受体皮动物子示宫挑目的漠基因非手术胚胎移植体外受肤精体外培养多细胞鞠胚胎检测整合外源蓬基因

卵乳子趣受汪精卵竹或囊胚雷的胚胎稳精子优点：妄受精卵隶的成活跨率高达厘90％链以上，享外源基躬因整合域率高，酷提高受草孕率。转基因飞动物的否技术路逃线（续盲）转基因动袭物的技术导路线（续禾）核移植签（克隆战）的技脆术路线目的基巧因晌转基因互动物导入动物胎男儿成纤犬维细胞妊娠取核动物去核重组的体外培养囊胚期胚胎移聋植卵细胞同受精绕卵千胚胎女受舱体动物酒子宫特点：体确细胞核移纳植；核移文植前导入塑目的基因史。转基因动液物的技术渐路线（续洪）整合卵受包精的技术寨路线：目的基灾因革转基因湾动物导入逆转录牙病毒妊娠精子感染体外受渡精胚胎移植卵母细狭胞似成大熟卵细最胞哄囊胚必受驰体动物肿子宫特点：滚卵母细攀胞导入兆目的基拉因后再痰与精子午受精。目的基因往的制备和迫转基因的贿方法目的基突因的制咳备·目的信基因的养获得借逆转络录合成疫法触化学合貌成法杂PC药R扩增贵法·目的基悔因的扩增通过载驰体在宿网主中克抬隆通过PC奴R扩增目皂的基因转基因愁动物的态方法·显摘微注射柄法葱·生姨殖细胞植载体法·胚纵胎干细雾胞法掉·病经毒载体窝法显微注射妥法显微注章射法是欢在显微璃注射仪搂上，一备侧用吸话管固定酬受精卵纹，另一兄侧将注泻射针插尼入受精僚卵原核巡寿（一般婆是雄原粉核）。仰拔出显炒微注射太针解除度固定管壶的负压挤，操作洪完成。拴显偶微注射豆法是最裕早使用斗、至今纲仍在使短用的较歌成熟的荒基因导傅入方法巩。其缺弹点是：说整合效祝率低（借小于1腿%）；忠不能定轨点整合疯，影响其基因表储达和遗题传稳定勒性；方隔法复杂强、设备央昂贵。生殖细胞避载体法有体外和济体内转染糕生殖细胞技的两种方竖法，前者预又包括精导子载体法尖、卵子载尖体法、受君精卵载体挽法、胞浆忍内精子注肆射法等。摸精型子载体法短是将成熟食的精子与案外源DN杰A的载体紫共同孵育睬，使精子汤携带外源载DNA，军受精后外嚷源DNA敢整合至染粉色体中。把此骆法理论上沾是可行的忍、也有成劫功的先例军，但成功买率不高、壮效果不稳做定，有待趁继续探索疤、完善。胚胎干奴细胞介斩导法胚胎干高细胞（熄emb孕ryo飞nic吗st写em脚cel唯l，ES细胞）所是从胚问泡内细蒙胞团分拘离得到疾的多潜域能细胞坝。誉将外源包基因导脾入体外批培养的皮ES细起胞，经剂筛选后财获得整流合稳定末和表现引良好的厚细胞，快将这些健细胞注滴射到小警鼠胚泡它腔中，帽部分E奇S细胞露可与内昼细胞团抹融合并嚼参与其私分化，漠形成嵌召合体。月在弃嵌合过饺程中，桌带有外详源基因屠的ES伸细胞可班能进入迫生殖系炭，在经钩杂交育秃种可得宏到纯合耗体，即盛为所需垮的转基厨因小鼠兽。病毒载体三法细菌质嘱粒和噬挑菌体载呆体只能樱将目的排基因运耍载至细撒菌中扩艺增和表易达。动免物病毒限载体是宽较理想柳的真核江基因工符程载体域。冒病蠢毒DN确A序列叛中有很贵强的启扯动子，怖可使其隶后方的亏外源基侨因高产浅量和高飞频率地吩表达。迅常用的窄有杆状庭病毒载脱体、S忆V40神载体、残痘苗病衬毒载体叉、逆转板录病毒蛋载体等雪。转基因擦动物的宝应用研夜究改良动物主经济性状酒的尝试试图通过旗转移单个辈基因改良楚动物经济半性状的研何究，至今语仍未见成辱功的报道般，尚需对壤性状表现双的生化代垃谢途径，音有关基因贿的相互作浓用以及基用因定位整催合，基因谈定量表达但、组织特肯异性表达干等进行深弯入的研究妻。乳腺生告物反应扒器的研可究198锯7年，梅Gor渡don子首次报种道小鼠头乳腺中议表达t洁PA蛋问白。至肉今国际负上转基慕因羊、糟转基因害牛等的液成功报某道实例饮已有1尤0多种业，生产折出抗胰乌蛋白酶凤、乳铁中蛋白、微人凝血猾蛋白因绘子Ⅷ、型蛋