肺结核的新诊断技术

肺结核的新诊断技术第1页，共35页，2023年，2月20日，星期四NTP中现行实验室技术涂片：萋尼染色显微镜检培养：固体培养基：简单法、离心法药敏：固体培养基：绝对浓度法、比例法菌种鉴定：鉴别培养基＋生化试验传统实验室技术不能适应不断深入的结核病防治工作的需要第2页，共35页，2023年，2月20日，星期四实验室新诊断技术总览细菌学检测方法发光二极管荧光显微镜（LED）液体培养分子生物学检测方法GenexpertHAINGenechip免疫学检测方法ELISOPT&TSPOT和Quantiferon血清学诊断方法第3页，共35页，2023年，2月20日，星期四荧光比色(MIGIT)(MBBactAlert)RutheniumcomplexCO2pH液体培养第4页，共35页，2023年，2月20日，星期四BACTECTB460原理：标本经前处理接种至含有14C-棕榈酸的12B培养基，37C培养。分枝杆菌分解14C-棕榈酸，产生14CO2，BACTECTB460仪自动检测，14CO2含量，并换算成生长指数（GI）。优点：快速：将分离培养的阳性检出时间由常规培养所需的2-8周缩短至3-14天，将药敏试验的报告时间由常规方法的4周缩短至1周。操作简便、灵敏度高，可进一步做药敏试验、菌种初步鉴定。缺点：放射性同位素污染。仪器与试剂价格昂贵。未实现全自动化污染率高第5页，共35页，2023年，2月20日，星期四原理：是BACTECTB460的换代产品。标本经前处理后接种到系统配套的液体培养基，该培养基中包被有对氧浓度敏感的荧光物质，当细菌生长代谢消耗培养基中的氧时，氧浓度降低，荧光被激发，系统可以连续检测荧光水平，自动报告结果。优点：系统进一步优化，操作更简便、自动化更强。解决了BACTECTB460的同位素污染问题。24小时连续检测，有利于早期报告阳性结果。缺点：仪器与试剂价格更昂贵。未能解决高污染率的问题BACTECMGIT960

分枝杆菌生长指示管第6页，共35页，2023年，2月20日，星期四液体培养1CrucianiM,etal.JCM2004;42:2321-23252

Meanof14studiesinMGIT960=10.7%(2.0-30.0)[]=acceptablerange培养方法敏感性(95%CI)结果报告周期污染(%)涂阳涂阴罗氏培养0.76(0.73-0.79)22.333.7[3–5]MGIT9600.88(0.84-0.91)11.716.513.8-16.6210.7(2.0-30.0)[5–10]MGIT+罗氏0.92(0.87-0.95)第7页，共35页，2023年，2月20日，星期四MGIT7mlMGIT7mlMGIT7mlMGIT7mlMGIT7mlMGIT7mlMGIT7ml+SMGIT7ml+IMGIT7ml+RMGIT7ml+EGCSIRE0,8mlBACTECMGITSIRE补充剂每种药物0,1ml转移0,5ml

阳性MGIT培养物0,1ml

阳性MGIT培养物9,9ml

蒸馏水转移

0,5ml插入BACTECMGIT960BACTECMGIT960TB–药敏试验S.I.R.E.第8页，共35页，2023年，2月20日，星期四LED显微镜发光二级管(LED)技术提供价廉、稳定的光源寿命150,000h反复开关不影响寿命不释放有毒气体不需要暗室操作人员工作负荷减轻第9页，共35页，2023年，2月20日，星期四第10页，共35页，2023年，2月20日，星期四快速药敏-商业化线性探针检测（LPAs）

GenoType®MTBDRplus,HAIN检测结核分枝杆菌复合群以及利福平、异烟肼耐药相关的突变检测XDR的试剂盒也已经发布INNO-LipaRifTB检测结核分枝杆菌复合群以及于利福平耐药相关的突变大多数利福平耐药的菌株同时也耐异烟肼WHO鼓励使用的工具可使用涂阳痰标本和培养物进行操作快速、简便易用，仅需基本PCR技术然而，价格比较昂贵，且不能检测造成耐药突变的热点区域外的突变11第11页，共35页，2023年，2月20日，星期四MTBDRplus操作流程DNA提取用NALC/NaOH处理痰标本2)PCR扩增3)

杂交扩增产物和固化在膜上的特异性探针杂交4)

结果判读第12页，共35页，2023年，2月20日，星期四rpoB

野生型探针:WT1-WT8rpoB

突变探针:MUT1-3:D516V,H526Y,H526D,S531L→野生型缺失→野生型突变MTBDRplus

rpoB511513516518522526531533rpoBWT2rpoBWT4rpoBWT6rpoBWT8rpoBWT7rpoBMUT1(D516V)rpoBMUT3(S531L)rpoBMUT2A(H526Y)rpoBMUT2B(H526D)514515rpoBWT1rpoBWT3rpoBWT5509508505第13页，共35页，2023年，2月20日，星期四katG

基因突变MTBDRplus

katG野生探针区域突变探针突变KatGWT315KatGMUT1S315T1KatGMUT2S315T2第14页，共35页，2023年，2月20日，星期四MTBDRplus

inhA野生探针区域突变探针突变InhAWT1-15InhAMUT1C15T-16InhAMUT2A16GInhAWT2-8InhAMUT3AT8CInhAMUT3BT8AinhA

基因突变第15页，共35页，2023年，2月20日，星期四MTBDRplus反应条带(示范)第16页，共35页，2023年，2月20日，星期四南非的经验：GenotypeMTBDRplusassay:直接从涂片阳性标本中检测rpob基因突变(耐利福平),katG基因(高浓度异烟肼耐药),inhA基因(低浓度异烟肼耐药)灵敏度、特异度，阳性预测值、阴性预测值耐利福平98.9,99.4,97.9,和99.7耐异烟肼94.2,99.7,99.1,和97.9耐MDR-TB98.8,100,100,和99.7BarnardM,etal.AmJRespirCritCareMed2008;177:787-92第17页，共35页，2023年，2月20日，星期四结核耐药检测基因芯片激光共焦扫描仪软件判读结核耐药检测芯片获北京市自主创新产品证书样品制备仪杂交仪通

量：两个一线抗结核药速

度：

6小时（比传统药敏试验法快50-100倍）灵敏度：103CFU/反应特异性：对照设计严谨；自动判读基于rpoB/katG/inhA的基因突变，快速检测分离株或者痰样本中结核杆菌多药耐药（利福平、异烟肼）。InternationalJournalofTuberculosisandLungDisease,13:914-920,2009（IF=2.3）18获国家医疗器械证书和欧盟CE认证第18页，共35页，2023年，2月20日，星期四XpertMTB/RIF检测结核分枝杆菌检测利福平耐药直接标本检测100分钟可获得结果第19页，共35页，2023年，2月20日，星期四工作流程痰简单，仅需1个步骤的准备工作获得结果的时间<90min工作量:>16样本/天/模块不需要生物安全规综合控制性能对MTB特异敏感性与培养相似通过rpoB基因检测利福平耐药产品和系统设计GeneXpert系统的检测模块测试模块的扩大和交换对非分枝杆菌实验室人员仅需要最多1天的培训GeneXpert样本准备、扩增、检测自动化MTB/利福平耐药性检测痰标本可以直接放入模块中，而无需与任何试剂进行混合处理第20页，共35页，2023年，2月20日，星期四报告结果时间:1h45minGeneXpertDNA分子与PCR试剂混合样本自动过滤和清洗超声裂解捕获的生物体，释放DNA半嵌套实时PCR扩增

&检测集成反应管456浓缩细菌去除抑制剂12标本液化和作用15分钟后转移2ml3结束手工工作7结果可打印XpertMTB/RIF第21页，共35页，2023年，2月20日，星期四单中心评估研究（初步结果）不同研究设计和研究人群，肺结核和肺外结核标本检测结核汇总的未经校正的敏感性

92%汇总的未经校正的特异性

98%检测利福平耐药汇总的未经校正的敏感性

98%汇总的未经校正的特异性

99%第22页，共35页，2023年，2月20日，星期四操作方面废弃物管理–如痰标本容器储存和供应–反应盒庞大,2-28°C,有效期12个月电力供应–UPS(400VA)或电池组培训–需求不高(使用计算机、预防污染)生物安全–与涂片镜检相同每年校正–模块更换安全–防盗(计算机)第23页，共35页，2023年，2月20日，星期四世界卫生组织快速开展XpertMTB/RIF诊断试验技术和实施方面的考虑2011年3月第24页，共35页，2023年，2月20日，星期四WHO对XpertMTB/RIF的建议摘要：高度推荐用于怀疑MDR-TB以及合并HIV感染的结核病病人的初诊诊断对于MDR－TB、HIV不严重的地区，可以在涂片之后考虑使用XpertMTB/RIF，特别是用于诊断涂阴病人（取决于费用）肺外标本的有关证据尚有限增加检测次数可能增加敏感性，但需考虑费用增加适用于儿童不能替代传统涂片、培养、药敏试验第25页，共35页，2023年，2月20日，星期四步骤

1:特异抗原激发淋巴细胞IFN-

释放阴性对照ESAT-6或CFP-10孵育孵育显影步骤

2:用ELISA检测

IFN-

YYYYYYYYYYYY洗涤YYYYYY

洗涤YYYQuantiFERONTBGold™实验第26页，共35页，2023年，2月20日，星期四T-SPOTTB(ELISPOT)技术

单核细胞分离TB抗原刺激，IFN-

释放一抗捕获IFN-

与标记的二抗结合

酶作用标记物－显色每一斑点代表释放IFN-的一个细胞YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYIFN-抗原第27页，共35页，2023年，2月20日，星期四小结用途操作生物安全要求费用液体培养更敏感、快速的培养＋＋＋＋＋＋＋＋LPA/基因芯片快速诊断M/XDR＋＋＋＋＋＋＋LED涂阳病人发现＋＋＋＋Xpert快速诊断＋＋＋＋＋NTP中如何应用－给谁用？哪里做？怎么用？第28页，共35页，2023年，2月20日，星期四国家结核病参比实验室推荐建议液体培养用于:

结核病可疑症状者检查,可以作为结核病（耐药）的诊断依据和结核病患者治疗效果判断,液体培养可以代替传统培养推荐理由:液体培养在已经在我国注册；国内外研究显示其敏感性和TAT优于传统培养；数据显示在我国具有可行性,符合成本效果；推荐使用层级:

区县、地市和省级（医疗机构和疾病预防机构）第29页，共35页，2023年，2月20日，星期四国家结核病参比实验室推荐建议GenXpert即将可以用于:

结核病可疑症状者检查,可以作为结核病的辅助诊断方法和结核病患者治疗效果判断,它有望代替传统的培养和利福平的药敏试验（可疑耐药结核病患者）推荐理由:即将在我国获得注册证书；国内外研究显示其敏感性和特异性，阳性结果报告时间优于传统方法；WHO在全球推荐数据显示在我国具有可行性,符合成本效果；可能使用层级:

区县（？）、地市和省级（医疗机构和疾病预防机构）第30页，共35页，2023年，2月20日，星期四国家结核病参比实验室推荐建议LPA可以用于:

可疑耐药结核病患者查,它有望代替利福平和异烟肼的传统药敏试验推荐理由:在我国获得注册证书；国内外研究显示其敏感性和特异性（TAT)较好；WHO在全球推荐数据显示在我国具有可行性,符合成本效果；可能使用层级:

地市和省级（医疗机构和疾病预防机构）第31页，共35页，2023年，2月20日，星期四国家结核病参比实验室推荐建议基因芯片可以用于:

可