肠道门诊大便三线培养简述

肠道门诊大便三线培养简述第一页，共39页。*前言*根据我国食品卫生法第六章第二十六条的规定，食品生产经营人员必须每年进行健康检查，新参加和临时参加工作的也必须进行健康检查，取得健康证明后方可参加工作。根据我国公共场所卫生管理条例第二章第七条的规定，公共场所从业人员必须进行健康检查，取得健康证明后方可参加工作。凡患有痢疾、伤寒、病毒性肝炎等消化道传染病（包括病原携带者）是不得参加接触直接入口食品的工作，或者治愈前不得直接从事公共场所的服务工作。第二页，共39页。概念大便三线培养：

一般来说，广义的大便三线培养是指在医疗机构的肠道门诊中，日常进行的一些肠道致病菌的常规检测。主要包括：⑴霍乱弧菌；⑵沙门菌、志贺菌、（大肠埃希氏菌o157血清型）；⑶副溶血弧菌；卫生健康体检中大便三线培养：与上面相比，检测范围比较小，属于预防性体检，一般主要针对：⑴霍乱弧菌；⑵沙门菌；⑶志贺菌；⑷大肠埃希氏菌（o157血清型）第三页，共39页。*肠杆菌科*是一大群寄居在人和动物肠道中的生物学性状相似的G-无芽胞的短小杆菌，其中4类常引起腹泻和肠道感染（埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属、耶尔森菌属）；8类常导致院内感染的条件致病菌（枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属、肠杆菌属、多源菌属、沙雷菌属、变形杆菌属、普罗威登菌属、摩根菌属）形态、培养、生化特征：⑴G-杆状或球杆菌，无芽胞，多有鞭毛，能运动，致病性菌株多数有菌毛，多数具有F、R、COL等质粒，需氧或兼性厌氧，在普通和MAC培养基上生长良好，在液体培养基内均匀混浊生长；⑵发酵葡萄糖，产酸或产酸产气，氧化酶阴性，触酶阳性，硝酸盐还原试验阳性；多年来乳糖发酵试验是区分致病性和非致病性肠杆菌科细菌的重要依据；第四页，共39页。*肠杆菌科*抗原构造：⑴O抗原：是细胞壁的成分，为脂多糖（LPS），具有属、种特异性，以核心多糖为分子的中心，内侧是类脂A，为内毒素的毒性处，外侧是由重复的低聚糖组成的多糖链，决定O抗原的特异性；⑵H抗原：是不耐热的蛋白质抗原，由鞭毛蛋白多肽链上的氨基酸序列和空间构型决定H抗原的特异性；⑶表面抗原：是包绕在O抗原外侧的不耐热的多糖抗原，由黏液或荚膜多糖的结构决定表面抗原的特异性，在不同的菌属中表面抗原有不同的专有名称，如大肠埃希菌属的K抗原、沙门菌属的Vi抗原、志贺菌属的B抗原等；变异性：主要有S-R变异、H-O变异第五页，共39页。*沙门菌*

定义：是一群寄居于人类和动物肠道中，生化反应与抗原结构相关的革兰氏阴性杆菌，多数对动物致病，仅少数引起人类疾病，如导致肠热症的伤寒、甲副、肖氏、希氏沙门氏菌等。有些动物沙门氏菌也可传染给人类，引起食物中毒或败血症，如鼠伤寒沙门氏菌。形态和培养特性：1、G-细长杆菌，有鞭毛和菌毛（除鸡沙门氏菌和雏沙门氏菌），一般无荚膜，均无芽胞。2、需氧或兼性厌氧，最适温度37℃，PH7.2～7.4，对营养要求不高，在普通培养基生长良好，37℃，24h，能形成菌落中等大小，直径2～3mm，圆形或卵形，表面光滑湿润，无色半透明，边缘整齐的菌落。3、在液体培养基中，呈均匀混浊性生长，无菌膜。第六页，共39页。第七页，共39页。*沙门菌*生化特征：1、发酵GLU，甘露醇，山梨醇产酸产气（伤寒鸡伤寒沙门氏菌少数不产气）2、不发酵乳糖，蔗糖，侧金黄花醇3、多数产生H2S（+），不产靛基质（-），不分解尿素（-），不产生乙酰甲基甲醇（V—P）（-）4、能还原硝酸盐为亚硝酸盐（+），动力阳性（+）5、在KCN培养基中生长（-），苯丙氨酸脱羧酶（-）第八页，共39页。*沙门菌*第九页，共39页。*沙门菌*抗原结构（血清型）：

1、O(菌体)抗原

是细胞壁上的脂多糖（LPS），性质稳定，耐湿热100℃数小时，不被酒精或0.1%石炭酸破坏，用阿拉伯数字1，2，3……表示，目前发现有58种。将相同抗原组分的划归一组，称为群。

沙门氏菌中的主要菌群及其群特异性抗原A群─O2C群─O6C1亚群─O6、O7C2亚群─O6、O8B群─O4D群─O9F群─O11E群─O3E2亚群─O3、O10族E3亚群─O3、O15E4亚群─O1、O3、O19第十页，共39页。*沙门菌*

2、H（鞭毛）抗原

为蛋白质，性质不稳定，不耐热，湿热60℃15分钟或酒精处理即破坏。可分为Ⅰ相和Ⅱ相。其中Ⅰ相特异性高，故又称特异相，以a、b、c、d……表示；Ⅱ相特意性低,故又称为非特意相,以1、2、3、4……表示。同时有Ⅰ相和Ⅱ相H抗原的称为双相菌，仅有一相者为单相菌。

3、Vi(表面)抗原

化学成分为不耐热的聚-N-乙酸-D-半乳糖胺糖醛酸，不稳定，经60℃30分钟、石炭酸处理或传代培养后易消失。它是菌体表面抗原，有抗吞噬、抗补体的作用。

4、菌毛抗原第十一页，共39页。*沙门菌*临床意义：

1、致病物质：侵袭力、内毒素、肠毒素2、所致疾病：肠热症（伤寒）、胃肠炎（食物中毒）、败血症（多见于儿童和免疫力低下的人）、无症状带菌者3、免疫性：是细菌胞内寄生微生物，人体仅主要靠细胞免疫4、抵抗力：对湿热敏感，65℃，15～20分钟灭活，水中存活2～3周，粪便中存活1～2个月，在冰冻土壤中越冬，5%石炭酸5分钟可杀死，对某些染料有一定耐受（SS平板）。第十二页，共39页。*志贺菌*定义：是肠道中主要的病原菌之一，导致人类细菌性痢疾的革兰氏阴性短小杆菌。可分为4个群，痢疾志贺氏（A群），福氏志贺氏（B群），鲍氏志贺氏（C群），宋内氏志贺氏（D群），我国以B群最多见，占70%以上，其次为D群和A群。形态和培养特性：1、G-短小杆菌，无鞭毛，有菌毛，一般无荚膜，均无芽胞，胞质内有两种质粒，与侵袭力和耐药性相关。2、需氧或兼性厌氧，最适温度37℃，PH7.2～7.4，对营养要求不高，在普通培养基生长良好，37℃，24h，能形成菌落中等大小，表面光滑湿润，无色半透明，边缘整齐的菌落。3、在液体培养基中，呈均匀混浊性生长，无菌膜。第十三页，共39页。*志贺菌*第十四页，共39页。*志贺菌*生化特征：1、发酵GLU，产酸不产气，分解甘露醇（除A群外）2、不发酵乳糖，（宋内氏迟缓发酵，>48小时），不发酵蔗糖3、不产生H2S（-），不产靛基质（-），不分解尿素（-），不产生乙酰甲基甲醇（V—P）（-）4、甲基红试验阴性（-）5、动力阴性（-）第十五页，共39页。*志贺菌*根据生化反应和O抗原差异，分成4个血清群和44个血清型

1、A群：痢疾，不分解甘露醇，有10个血清型2、B群：福氏，有15个血清型，我国以2a、1b、3型居多3、C群：鲍氏，有18个血清型4、D群：宋内氏，迟缓发酵乳糖，只有1个血清型，但分为S和R型两种菌落，其诊断因子血清无交叉凝集现象第十六页，共39页。*志贺氏菌*临床意义：

1、致病物质：侵袭力、内毒素、外毒素（痢疾志贺氏产生，包括肠毒素、细胞毒素和神经毒素）2、所致疾病：急性菌痢、慢性菌痢（治疗不彻底造成的反复发作）、无症状带菌者3、免役性：人体主要靠肠道局部免疫4、抵抗力：对理化因素的抵抗力较弱，对酸敏感，对湿热敏感，50～60℃，10分钟灭活，日光照射30分钟灭活，1%石炭酸15～30分钟可杀死，容易发生S～R和耐药性变异，耐药性主要由R质粒决定，可在细菌间传播。第十七页，共39页。*检测和鉴定程序（沙门氏、志贺氏）

采样（湿润的10CM棉签、肛拭）

S.F增菌液10ml（37℃、18～24小时）GN增菌液10ml（37℃、4～6小时）S.S平板划线分离培养（37℃、18～24小时）无可疑菌落报告观察、挑选可疑菌落接种KIA或双糖铁（37℃、18～24小时）初步鉴定，根据结果做氧化酶试验等

全面生化反应实验血清学鉴定（多价诊断血清）

报告结果第十八页，共39页。*检测和鉴定程序（沙门氏、志贺氏）第十九页，共39页。*检测和鉴定程序（沙门氏、志贺氏）沙门氏菌在KIA或双糖铁上的生长情况：

斜面产碱鲜红色/底层产酸黄色，有少量产气或不产气，H2S阳性有显黑色（AK++）,动力阳性（沿穿刺线蔓延生长）志贺氏菌在KIA或双糖铁上的生长情况：斜面产碱鲜红色/底层产酸黄色，不产气，H2S阴性无显黑色（AK--），动力阴性（只沿穿刺线生长）第二十页，共39页。*检测和鉴定程序（沙门氏、志贺氏）三糖铁斜面高层培养现象2－志贺氏菌3－沙门氏菌4－大肠杆菌第二十一页，共39页。*检测和鉴定程序（沙门氏、志贺氏）半固体琼脂培养现象第二十二页，共39页。*检测和鉴定程序（沙门氏、志贺氏）沙门氏菌血清学分型：1、先A-F多价混合诊断血清进行玻片凝集;2、再单价抗O因子诊断血清进行玻片凝集;O4因子血清B群O9因子血清D群O3因子血清E群O11因子血清F群O2因子血清A群O6因子血清C群3、最后H单价抗原血清进行玻片凝集;第二十三页，共39页。*检测和鉴定程序（沙门氏、志贺氏）志贺氏菌血清学分型：

1、用4种志贺氏菌多价血清，如果由于表面抗原的存在而不出现凝集，应将菌液煮沸后再进行玻片凝集试验;2、用A1，A2，B群多价，C群多价，D群诊断血清分别试验;3、依次选用型因子血清分别进行试验;第二十四页，共39页。有关配制培养基的补充:从业人员体检大便三线培养基本要求***相关物品的准备***1、仪器设备①恒温培养箱②干燥箱③高压灭菌器④显微镜⑤接种环2、培养基①SS琼脂②4号琼脂(必须用9cm玻离平皿)③SF和GN增菌液④碱性胨水⑤KIA或双糖铁3、诊断血清①沙门氏多价②志贺氏多价③霍乱多价第二十五页，共39页。有关配制培养基的补充:检验要求及报告1.检验标本必须增菌或直接接种平板进行，增菌后再次接种平板，碱性胨水增菌液必须保存到阴性报告发出后。2.疑似霍乱菌株必须在18-24h内报县疾控中心。3.其他疑似菌株就近送县级医院或县疾控中心。第二十六页，共39页。有关配制培养基的补充:1、配制S.F和GN增菌液时，玻璃试管分装量一般为10ml／支，否则增菌效果不明显；亚硒酸，遇高温会还原成硒酸，失去抑制杂菌的作用，故采用先把干净的玻璃空试管加硅胶塞，高压灭菌，121℃，15～20分钟，再把S.F增菌液干粉培养基按比例要求加热彻底溶解，后采用无菌手法分装；贴上配制时间的标签，放冰箱冷藏，一般为2～8℃，可以保质1个月左右；但是要随时观察，如果发现试管底部有红色沉淀，说明增菌液长杂菌变质，需重新配制新的增菌液；同时，干粉培养基也应放冰箱储存；3、最好用直径9cm的玻璃平皿配制SS平板，厚度为2～3mm，估计400ml的培养基倾倒23个平皿，贴上配制时间的标签，放冰箱储存，一般为2～8℃；4、KIA或双糖铁配制时，干粉培养基应彻底充分溶解，否则分装后每支斜面高层内含琼脂量不均匀；由于其中含糖成分，高压灭菌温度不能太高，110℃，10～15分钟；所制成的高层斜面应该规范，保留1cm的垂直高度；第二十七页，共39页。*大肠埃希菌（O157:H7血清型）*

一般在人体肠道内，存在正常的大肠埃希菌，但是也有一些大肠埃希菌具有一定的毒力，感染肠道后即可致病引起腹泻，称为致病性大肠埃希菌，包括5种：⑴肠产毒型（ETEC）：主要在发展中国家引起儿童腹泻和旅行者腹泻，症状较轻，可治愈；⑵肠致病型（EPEC）：主要引起婴幼儿肠道感染，血清型有O55、O111等，可治愈；⑶肠侵袭型（EIEC）：引起类似志贺菌属的菌痢症状，可治愈；⑷肠出血型（EHEC）：它的代表菌为O157:H7血清型，引起的症状较严重，由并发症所导致的死亡率在3%～10%，经粪-口传播，形成爆发流行，1996年在日本大阪地区就有上万人感染，死亡11人，我国有散发病例的报告，应引起重视；⑸

肠凝聚型（EaggEC）:引起慢性腹泻，可治愈；第二十八页，共39页。*大肠埃希菌（O157:H7血清型）*生物学特性和生化特点：⑴G-直短杆菌，无芽胞，多数有鞭毛，能运动；⑵营养要求不高，兼性厌氧，普通琼脂上生长良好；液体培养基中混浊生长；在血平板上产生β溶血菌落；在SS平板上由于发酵乳糖形成粉红色、光滑、湿润菌落；⑶吲哚、甲基红、V-P、枸橼酸盐试验（IMVC）结果为++--；KIA斜面高层均产酸产气、H2S阴性，结果为AA+-；动力-吲哚-尿酶试验（MIU）结果为++-；迟缓发酵山梨醇（≥48小时），用SMAC平板纯培养；抗原构造：⑴O（菌体）抗原；⑵H（鞭毛）抗原；⑶K（表面）抗原；第二十九页，共39页。*大肠埃希菌（O157:H7血清型）*检测程序：

粪便、直肠拭子涂片染色镜检（37℃、18～24小时）血液增菌血平板、SS、MAC、EMB（37℃、18～24小时）可疑菌落（37℃、18～24小时）纯培养（SMAC）生化试验、血清学鉴定（O157:H7因子血清）第三十页，共39页。霍乱弧菌的检测第三十一页，共39页。*概述与流行病学*霍乱弧菌是属于弧菌科，弧菌属，是一群革兰染色阴性，菌体直或微弯曲，具有端极鞭毛，氧化酶试验阳性，葡萄糖利用试验为发酵型的细菌。根据菌体（O）抗原不同，目前将霍乱弧菌分出200个以上的血清型，但是到现在我们仅仅只是发现O1和O139，这两个血清型对人类致病的。目前，从1817年开始至今，全世界共引起发生了七次霍乱大流行，其中，1992年发生的大流行的由O139引起的，其余的由O1群引起的。第三十二页，共39页。*概述与流行病学*自古以来，印度恒河三角洲就是霍乱的地方性流行区，19世纪初由于在通商、朝圣和战争等因素的影响下，霍乱从印度向世界各地传播。我国于1820年，霍乱首次传入，其后世界上的历次大流行我国都遭受侵袭，除西藏外，其余省份几乎都波及。特别在1924～1948年期间，我国每年都发生，报告的病人数达数万到10万，病司死率也高达30%以上。解放后，我国的霍乱流行情况有所好转，但是，目前我国仍处于1961年开始的，至今尚未停息的第七次大流行期间，应该得到相应足够的重视。第三十三页，共39页。*概述与流行病学*传染源：①病人（重型、中型、轻型）；②带菌者（潜伏期带菌、病后带菌、健康带菌）；

传播途径：经口感染的肠道传染病，常通过水、食物、生活活接触、苍蝇等传播；人群易感性：人类不分种族、年龄、性别，对本病都是易感的；第三十四页，共39页。*病原学与检验诊断*分类：

气单胞菌属古典生物型邻单胞菌属O1群弧菌科弧菌属霍乱弧菌埃尔托生物型发光杆菌属O139群水栖菌属第三十五页，共39页。*病原学与检验诊断*形态与染色：革兰氏阴性，无芽胞，无荚膜，两端钝圆或稍平，油镜下呈现鱼群般排列，单端有一根长鞭毛，运动极为活泼，在暗视野显微镜下，如夜空中穿梭的流星；培养特性：营养要求简单，兼性厌氧，培养37℃适宜，初分离的增菌培养基PH为8.4～8.6，数小时内快速生长，在庆大霉素和4号平板上呈半透明、灰黑色、中心有灰黑点