第二章-细胞分离与破碎-2(0)

第二章-细胞分离与破碎--2(0).第一页，共86页。第二章

细胞分离与破碎第二页，共86页。主要内容1.发酵液预处理2.细胞分离3.细胞破碎

第三页，共86页。第一节发酵液预处理第四页，共86页。一、发酵液的一般特性二、发酵液预处理的目的和要求三、发酵液预处理的方法5/6/20235第五页，共86页。一、发酵液的一般特性水分含量高（90-99%）产物浓度低（<10%）发酵液黏度大，不易过滤残留培养基成分含有发酵代谢副产物发酵液含有色素、毒性物质和热源物质等有机杂质5/6/20236第六页，共86页。二、发酵液预处理的目的和要求（一）目的改变发酵液特性，加速固液分离富集分离产物于固相（或液相）去除部分杂质，减少后续分离负荷5/6/20237第七页，共86页。（二）要求菌体分离发酵悬浮物的去除固液悬浮物的去除蛋白质的去除重金属离子的去除色素、毒物和热源物等有机质的去除改变发酵液特性，利于后续分离工作调节适宜的pH值和温度5/6/20238第八页，共86页。杨白劳是怎么死的?第九页，共86页。卤水点豆腐——凝聚原理黄豆里的蛋白质团粒被水簇拥着不停地运动，聚不到一块儿，形成了“胶体”溶液。点卤用盐卤或石膏，盐卤主要含氯化镁，石膏是硫酸钙，它们能使分散的蛋白质团粒很快地聚集到一块儿，成了白花花的豆腐脑。5/6/202310第十页，共86页。三、发酵液预处理的方法（一）凝集和絮凝方法1、凝集在凝聚剂的作用下，使发酵液中的胶体脱稳并使粒子相互凝聚为1mm大小块状絮凝体的过程。本质：对初始粒子表面电荷的中和、消除离子表面稳定的双电荷层。5/6/202311第十一页，共86页。胶体双电子层的结构————————————++++++电荷密度+++++++++———————————————+++++++++吸附层扩散层距固体表面的距离正电荷分布负电荷分布5/6/202312第十二页，共86页。破坏双电荷层的方法加入具有相反电性的电解质，中和胶粒电性，降低双电子层的排斥力，导致胶粒的相互碰撞。另外，由于电解质在水中的水化作用，会破坏胶粒周围的水化层，促使胶粒碰撞、聚集、沉降。5/6/202313第十三页，共86页。凝聚剂种类：硫酸铝Al2(SO4)3·18H2O(明矾)、氯化铝AlCl3·6H2O、三氯化铁FeCl3·6H2O、硫酸亚铁FeSO4·7H2O、石灰、ZnSO4、MgCO3等。

机理：A、破坏双电层，B、水解后胶体吸附，C、氢键结合等。第十四页，共86页。（一）凝集和絮凝方法2、絮凝在高分子絮凝剂的作用下，通过桥架作用使粒子相互作用形成较大的絮凝团的过程。本质：悬浮粒子与絮凝剂之间的桥架作用。5/6/202315第十五页，共86页。絮凝现象与原理絮凝剂菌体细胞废水处理5/6/202316第十六页，共86页。絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物，具长链状结构，其链上含有许多活性功能团，包括带电荷的离子基团和不带电荷的非离子型基团。第十七页，共86页。絮凝剂种类：

①有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、聚苯乙烯类衍生物；②无机高分子聚合物，如聚合铝盐、聚合铁盐等；③天然有机高分子絮凝剂，如聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖等。

机理：絮凝剂主要起中和电荷、桥架和网络作用第十八页，共86页。复合型生物絮凝剂5/6/202319第十九页，共86页。凝聚和絮凝是两种方法，两个概念。

凝聚：投加的化学物质（铝、铁的盐类或石灰等）中和胶体的电荷，使粒子相互聚集成１mm

大小块状凝聚体的过程。絮凝：使用絮凝剂（天然的和合成的大分子量聚电解质）将胶体粒子交联成网，形成10mm大小絮凝团的过程。其中絮凝剂主要起架桥作用。第二十页，共86页。

凝聚：胶体粒子(10-100nm)中性盐促进下脱稳相互聚集成大粒子（1mm）

机理：a中和粒子表面电荷

b消除双电层结构絮凝：大分子聚电解质将胶体粒子交联成网状，形成絮凝团的过程

机理：架桥作用第二十一页，共86页。

凝聚和絮凝技术能有效的改变细胞菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态,使其聚集起来,增大体积以便固液分离,常用于菌体细小而且黏度大的发酵液的预处理中.第二十二页，共86页。（二）加热法前提：产物的热稳定性高目的：降低发酵液黏度加速凝聚作用除去热变性蛋白破坏凝胶状胶体稳定性增加滤饼空隙率5/6/202323第二十三页，共86页。（三）调节pH值法促进絮凝和凝聚作用释放或稳定产物，防止其氧化、变性或沉淀。调节pH值时应防止过酸或过碱（四）加水稀释法提高后续的离心沉降速度5/6/202324第二十四页，共86页。不同pH值条件下小球藻

具有不同的悬浮特性5/6/202325第二十五页，共86页。（五）加入助滤剂法防止滤布或生成的滤饼阻塞而影响过滤。常用的助滤剂：纸浆石棉活性炭硅藻土酸性白土5/6/202326第二十六页，共86页。（六）加吸附剂或盐吸附细胞常用的吸附剂有磷酸氢二钠和氯化钙形成的CaHPO4凝胶、氧化铝凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等。5/6/202327第二十七页，共86页。发酵液中的杂质不仅直接影响产品质量和收得率，同时对后继提取和精制有很大影响。高价无机离子（Ca2+、Fe2+等）可溶性蛋白质多糖的去除有色物质的去除（七）发酵液的相对纯化第二十八页，共86页。

1.

无机离子的去除

Ca2+

、Mg2+

、Fe2+等（如何去除？？）第二十九页，共86页。（1）Ca2+——加草酸钠沉淀C2O4Na2+Ca2+→C2O4Ca↓+2Na+（2）Mg2+——加三聚磷酸钠形成络合物Na5P3O10+Mg2+→MgNa5P3O10+2Na+（3）Fe2+——加入黄血盐，形成普鲁士蓝沉淀4Fe3++3K4Fe(CN)6→Fe4[Fe(CN)6]3↓+12K+高价无机离子的去除第三十页，共86页。

利用各种沉淀方法，可以去除液相中各种蛋白质。常用的有等电点沉淀法、变性沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法、反应沉淀法等。这些沉淀方法既可以作为除杂质的方法，也可以作为提取目标产物的技术手段。2．杂蛋白的去除第三十一页，共86页。

酶解法可将混合液中的不溶性多糖物质酶解，使其转化为溶解度较大的单糖，从而改变流体的流动特性，提高过滤速率。

3．多糖的去除第三十二页，共86页。

发酵液中有色物质可能是由于微生物生长代谢过程分泌的，也可能是培养基（如糖蜜、玉米浆等）带来的，色素物质化学性质的多样性增加了脱色的难度。有色物质如何去除？

4．有色物质的去除第三十三页，共86页。色素物质的去除，一般以使用离子交换树脂、离子交换纤维、活性炭等材料的吸附法来脱色最为普遍。一般发酵液的脱色往往是在过滤除去菌体后进行。第三十四页，共86页。活性炭可用于油脂、饮料、食品、饮用水的脱色、脱味。活性炭是一种由含炭材料制成的外观呈黑色，内部孔隙结构发达、比表面积大、吸附能力强的一类微晶质碳素材料。活性炭材料中有大量肉眼看不见的微孔。活性炭脱色第三十五页，共86页。（1）活性碳一般使用温度是75-80度比较好；（2）活性炭脱色效果在水中最强，在强极溶剂中使用效果也不错，在非极性溶剂中效果较差；（3）一般情况下，在pH3-6条件下使用较好；

（4）一般情况下，加入量为0.1—3％（W／V）；

（5）脱色时间一般为30-60min；注意事项：

（1）切不可在沸腾的溶液中加入活性炭，那样会有暴沸的危险。

（2）用活性炭脱色要待固体物质完全溶解后才加入。活性炭脱色原理和操作第三十六页，共86页。活性炭净化空气第三十七页，共86页。活性炭除甲醛第三十八页，共86页。固液分离胞外上清液/滤液提取生化物质的第一步，分两部分：胞内富集细胞第二节细胞分离第三十九页，共86页。大部分工业生物分离的第一步往往是将不溶物质从发酵液中除去。这些不溶性固体的浓度和颗粒大小的变化范围很宽。浓度可高达每单位体积含60%的不溶性固体，又可低至每单位体积仅含0.1%。

粒径的变化可以从直径约为1um的微生物，到直径为1mm的不溶性物质。第四十页，共86页。对于浓度较小，粒径较大，硬度较强的不溶物，我们可以采用过滤方法分离。

与过滤设备相比，离心设备的价格昂贵。但当固体颗粒细小而难以过滤时，离心操作往显得十分有效。当静置悬浮液时，密度较大的固体颗粒在重力作用下逐渐下沉，这一过程称为沉降。第四十一页，共86页。离心产生的固体浓缩物和过滤产生的浓缩不同：通常情况下离心只能得到一种较为浓缩的悬浮液或浆体；而过滤可获得水分含量较低的滤饼。

但是，对大多数生物发酵液可以离心但不能有效地过滤分离，所以离心往往是很有效的方法。第四十二页，共86页。常见的细胞分离方法重力沉降离心沉降过滤43第四十三页，共86页。

当一固体微粒通过无限连续介质时，它的运动速度受两种力的影响：

浮力作用流体阻力作用一、颗粒沉降（Sedimentation）

什么情况下颗粒在流体中会发生沉降过程？

第四十四页，共86页。（一）重力沉降由地球引力作用而发生的颗粒沉降过程，称为重力沉降

当一个球形颗粒放在静止流体中，颗粒密度大于流体密度时，则颗粒将在重力作用下作沉降运动。

设颗粒的初速度为零，则颗粒最初只受重力Fg与浮力Fb的作用。重力向下，浮力向上。Fb

浮力

Fg

重力根据沉降作用力可分为：重力沉降、离心沉降第四十五页，共86页。（一）重力沉降当作用于颗粒上的这两个外力之和不等于零时，颗粒将产生加速度。当颗粒开始下沉时，受到流体向上作用的阻力。Fb

浮力Fd

阻力

Fg

重力根据牛顿第二定律，可得到颗粒直径为d、颗粒密度为ρs的重力沉降运动基本方程式：（1）球形颗粒的自由沉降速度第四十六页，共86页。重力：（a）浮力：（b）

t

u

u0加速段匀速段

颗粒做匀速运动，沉降速度恒定不变，该速度称为自由沉降速度。达到恒定的沉降速度时，合力为：

阻力：（c）阻力系数Fb

浮力Fd

阻力

Fg

重力第四十七页，共86页。（球形颗粒的自由沉降速度）（2）阻力（曳力）系数（Dragcoefficient）

与流体的流动阻力系数类似，阻力（曳力）系数与颗粒沉降雷诺数有关，即注意：其中d为颗粒直径，u0为颗粒的沉降速度，ρ、μ分别为流体的密度与粘度。第四十八页，共86页。依靠离心力的作用，使流体中的颗粒产生沉降运动，称为离心沉降。适于分离两相密度差较小，颗粒粒度较细的非均相物系。由重力沉降可知，当颗粒较小时，其沉降速度小，需要较大的沉降设备。为了提高生产能力，可使用离心沉降。因为离心力可比重力大千倍或万倍。（二）离心沉降

第四十九页，共86页。颗粒离心沉降的速度方向是由圆心沿径向指向外周，但由于颗粒和流体同时做圆周运动，颗粒的实际运动轨迹是一个半径逐渐扩大的螺旋线。离心沉降速度并不是颗粒的实际运动速度，只是其在径向上的分量。r1r2ArCBuruut颗粒在旋转流体中的运动（1）球形颗粒的离心沉降速度（u）第五十页，共86页。重力场离心力场力场强度重力加速度gut2/R

方向指向地心沿旋转半径从中心指向外周Fg=mg

作用力惯性离心力场与重力场的区别沉降速度恒定变化第五十一页，共86页。离心加速度（离心力场强度）直径为d的球形粒子在流体中作匀速圆周运动，切线速度为uT；

径向速度ur；旋转半径为R粒子密度为ρs；流体密度为ρ

惯性离心力（与重力相当）:向心力(与重力场中的浮力相当):阻力(与颗粒径向运动方向相反):径向受力分析（指向中心）（指向中心）ur

uTuR（中心指向外周）第五十二页，共86页。三力达到平衡，则：

平衡时颗粒在径向上相对于流体的运动速度ur便是此位置上的离心沉降速度（绝对速度在径向上的分量）。——离心沉降速度表达式——重力沉降速度表达式两者区别在于加速度的不同，一个是“ut2/R”，一个是“g”

。第五十三页，共86页。（2）离心分离因数（Kc)

同一颗粒在同一种介质中的离心沉降速度与重力沉降速度的比值为：

比值Kc就是粒子所在位置上的惯性离心力场强度与重力场强度之比称为离心分离因数。

第五十四页，共86页。例如；当旋转半径R=0.4m，切向速度uT=20m/s时，求分离因数。

分离因数是离心分离设备的重要指标。某些高速离心机分离因数值可高达数十万。旋风或旋液分离器的分离因数一般在5～2500之间。

表明离心沉降速度是沉降速度的百倍，因此离心沉降设备分离效果远高于重力沉降设备。第五十五页，共86页。原理离心分离是基于固体颗粒和周围液体密度存在差异，在离心场中使不同密度的固体颗粒加速沉降的分离过程。动植物细胞的收集、细胞碎片和沉淀的分离等常用离心分离。二、离心分离法第五十六页，共86页。离心力与离心转速的换算第五十七页，共86页。RCF和rpm之间可以相互换算

rpm

—revolutionsperminute，每分钟转数，r/min

RCF—relativecentrifugalforce，相对离心力

一般情况下，低速离心时常以转速“rpm”来表示，高速离心时则以“g”

表示。第五十八页，共86页。通常离心力常用地球引力的倍数来表示，因而称为相对离心力“

RCF”。或者用数字乘“g”来表示，例如25000×g，则表示相对离心力为25000。相对离心力是指在离心场中，作用于颗粒的离心力相当于地球重力的倍数，单位是重力加速度“g”，此时“RCF”相对离心力可用下式计算：第五十九页，共86页。RCF=1.119×10－5×(rpm)2r

由上式可见，只要给出旋转半径r，则RCF和rpm之间可以相互换算。

计算颗粒的相对离心力时，应注意离心管与旋转轴中心的距离“r”不同，即沉降颗粒在离心管中所处位置不同，则所受离心力也不同。因此在报告超离心条件时，通常总是用地心引力的倍数“×g”代替每分钟转数“rpm”，因为它可以真实地反映颗粒在离心管内不同位置的离心力及其动态变化。科技文献中离心力的数据通常是指其平均值（RCFav），即离心管中点的离心力。

第六十页，共86页。

为便于进行转速和相对离心力之间的换算，Dole和Cotzias

利用RCF的计算公式，制作了转速“rpm”、相对离心力“RCF”和旋转半径“r”三者关系的列线图。换算时，先在r标尺上(单位rpm)取已知转速，在RCF标尺上取已知的离心半径(单位cm)，将这两点间划一条直线，与图中g标尺上的交叉点即为相应的相对离心力数值。第六十一页，共86页。按速度和离心力：1.常速离心机最大转速8000rpm(r/min),相对离心力(RCF)104g以下,用于细胞、菌体和培养基残渣等分离；2.高速（冷冻）离心机

1×104-2.5×104rpm，相对离心力104~105g,用于细胞碎片、较大细胞器、大分子沉淀物等分离；3.超速离心机

转速2.5-8×104rpm，相对离心力5*105g；用于DNA、RNA蛋白质、细胞器、病毒分离纯化；检测纯度；沉降系数和相对分子量测定等。（一）离心机的种类与用途第六十二页，共86页。对于常速和高速离心机，由于所分离的颗粒大小和密度相差较大，只要选择好离心速度和时间，就能达到分离效果。超速离心的离心方法：差速离心、密度梯度离心和等密度梯度离心。第六十三页，共86页。1.差速离心分级2.区带离心（密度梯度离心）差速区带离心平衡区带离心（二）离心分离方法第六十四页，共86页。1.差速离心:

工业上最常用的离心分离方法菌体、细胞大小/μm离心力/g实验室工业规模大肠杆菌2-4150013000酵母2-715008000红细胞6-91200－淋巴球7-12500－肝细胞20-30800－第六十五页，共86页。2.区带离心——多用于生化研究事先在离心管中用某种低分子溶质调配好密度梯度，在密度梯度之上加待处理的料液后进行离心。常用密度梯度物质：

蔗糖、CsCl、NaBr第六十六页，共86页。第六十七页，共86页。实验室常用的转子第六十八页，共86页。按离心机的作用方式：斜角式平抛式管式蝶式螺旋式多室（三）离心机的种类与用途第六十九页，共86页。（1）斜角式离心机是一类结构最简单的实验室常用离心机，指离心管腔与转轴成一定倾角的转子；颗粒在角转子中沉降时，先沿离心力方向撞向离心管，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一侧会出现颗粒沉积。第七十页，共86页。（1）斜角式离心机结构稳定，可装载较多的样品使用较高的转速。加速或减速时，对样品有搅动。第七十一页，共86页。大容量冷冻离心机第七十二页，共86页。(2）平抛式离心机一类结构简单的实验室常用的低中速离心机，转速一般在3000-6000rpm。转子活动管套内的离心管，静止时垂直挂在转头上，旋转时随着转子转动，从垂直悬吊上升到水平位置。转头结构复杂，最高转速相对要低容量也小一些。

第七十三页，共86页。平抛式离心机转子第七十四页，共86页。(３）管式离心机第七十五页，共86页。

管式离心机是一种分离效率很高的离心分离设备，其转鼓细长，可在15000-50000的高转速下工作。设备简单、操作稳定。适用范围

细胞、细胞碎片、细胞器、病毒、蛋白质、核酸等。特别适合一般分离机难以分离的固形物含量<1%