药品的微生物学检查

一、目的要求1、了解微生物学实验室常用消毒灭菌仪器设备2、了解空气、皮肤细菌检查方法3、掌握药品的微生物学检验程序和方法二、实验内容1.药品的微生物限度检查（一）1）口服药物的检查:①药品的预处理：②大肠杆菌的检查：③细菌总数的检查：2）外用药物的检查:①药品的预处理：②绿脓杆菌的检查：③金黄色葡萄球菌的检查：2.空气、皮肤细菌检查方法(验证)3.微生物学实验室常用消毒灭菌仪器设备：高压蒸汽灭菌锅、消毒煮沸器、G6玻璃滤菌器装置、洁净工作台、移动式紫外光灯、鼓风式干烤箱、紫外线杀菌标本。实验一药品的微生物限度检查（一）实验室常用消毒灭菌设备空气和皮肤细菌检查方法（综合实验+基础实验）目前一页\总数五十八页\编于二点

通过实验了解药品微生物限定检查法的意义、设计方法、细菌检查常用的基本技术和程序，结果分析方法。药品的微生物限度检查实验目的药品的微生物限度检查实验程序

一、药品的预处理二、药品的增菌培养、结果分析三、细菌分离鉴定、结果分析目前二页\总数五十八页\编于二点口服药外用药药品的微生物限度检查实验方法（一）

1.药品的预处理2克药品加20毫升生理盐水，研磨制成悬液

2.细菌培养外用药口服药药品混悬液10毫升加入胆盐乳糖增菌液中药品混悬液10毫升加入胆盐乳糖增菌液中药品混悬液10毫升加入亚碲酸钠增菌液中37℃,24小时37℃,24小时目前三页\总数五十八页\编于二点

将剩余口服药以10-110-210-310-4进行稀释(以生理盐水稀释)

3.细菌总数测定从上述四个稀释管中各取1ml混入溶化的琼脂培养基中，混匀，冷却后置37℃恒温培养箱培养24小时

。取四个中试管各加9ml生理盐水从剩余10ml悬液中取1ml加入上述四个稀释管中1ml1ml10-110-410-210-39ml生理盐水目前四页\总数五十八页\编于二点一、目的要求:1、了解细菌培养接种技术2、掌握细菌基本形态3、掌握药品的微生物学检验程序和方法二、实验内容1.药物的微生物限度检查（二）2.空气、皮肤细菌检查结果测定。3.讲授基础培养基的制备方法（营养琼脂、营养肉汤）。4.细菌在三种不同物理性状培养基上的接种方法(基本技能)

液体培养基 平板培养基 斜面培养基 双糖含铁半固体斜面培养基5.显微镜下观察

细菌的基本形态:球菌、枯草杆菌、霍乱弧菌。特殊结构：肺炎荚膜、变形鞭毛、破伤风芽胞。6.培养基的种类和用途普通培养基、营养培养基、厌氧培养基、选择培养基实验二药品的微生物限度检查（二）细菌的形态学检查及培养接种技术目前五页\总数五十八页\编于二点一、空气、皮肤细菌培养现象观察

（一）记录空气微生物培养结果菌落数目、大小、边缘、颜色、粗糙（光滑）（二）记录皮肤微生物培养结果比较消毒前后细菌菌落数，菌落特点。目前六页\总数五十八页\编于二点培养基的制备培养基分类根据物理性状分类：液体培养基主要用于增菌半固体培养基用于检测动力及保存菌种固体培养基用于分离鉴定细菌根据用途分类：基础培养基普通琼脂培养基营养培养基血液琼脂培养基选择培养基SS培养基鉴别培养基双糖铁培养基厌氧培养基庖肉培养基目前七页\总数五十八页\编于二点培养基的制备程序调配→矫正pH（）→分装→灭菌（121.3℃，20-30分钟）→放入冰箱冷藏备用。因高压之后pH值会下降0.1左右，所以矫正pH时应比所需的pH高。鉴定是否有菌可将培养基置于37℃培养24小时，然后观察。目前八页\总数五十八页\编于二点二、细菌的接种技术材料普通琼脂平板、肉汤培养基、半固体斜面培养基大肠埃希菌培养物（１套／台）目前九页\总数五十八页\编于二点方法1.平板划线接种法（1）平行划线法（2）分区划线法2.琼脂斜面的接种方法3.液体培养基接种法4.半固体接种法目前十页\总数五十八页\编于二点分区划线法目前十一页\总数五十八页\编于二点菌落目前十二页\总数五十八页\编于二点斜面移种技术目前十三页\总数五十八页\编于二点菌苔目前十四页\总数五十八页\编于二点液体移种技术目前十五页\总数五十八页\编于二点穿刺技术目前十六页\总数五十八页\编于二点取出前次实验培养物观察：1.口服药物1)细菌鉴定：在胆盐乳糖增菌液中有无细菌生长：增菌液变混浊―――――有-----接种在伊红美兰琼脂平板培养基上面。方法：分区划线接种。2)细菌总数测定：选择30-300个菌落平板，细菌总数＝菌落数×稀释倍数药物的微生物限度检查方法（二）目前十七页\总数五十八页\编于二点2.外用药1)判定胆盐乳糖增菌液培养物及亚碲酸钠增菌液培养物有无细菌生长：增菌液变混浊―――有2)细菌鉴定：（1）将胆盐乳糖增菌液培养物无菌接种在16烷三甲基溴化胺琼脂斜面培养基上面。方法：斜面化线接种；（2）将亚碲酸钠增菌液培养物，无菌接种在卵黄高盐琼脂平板培养基上面。方法：分区划线接种。37℃恒温孵育箱24小时培养后，观察结果。目前十八页\总数五十八页\编于二点细菌基本形态球菌杆菌螺形菌目前十九页\总数五十八页\编于二点葡萄球菌目前二十页\总数五十八页\编于二点链球菌目前二十一页\总数五十八页\编于二点大肠埃希菌目前二十二页\总数五十八页\编于二点枯草杆菌目前二十三页\总数五十八页\编于二点霍乱弧菌目前二十四页\总数五十八页\编于二点细菌特殊结构鞭毛荚膜芽孢目前二十五页\总数五十八页\编于二点破伤风梭菌spore目前二十六页\总数五十八页\编于二点一、目的要求:1、了解细菌的生长现象及代谢产物的观察2、掌握药品的微生物学检验程序和方法二、实验内容1.药物的微生物限度检查（三）2.细菌的生长现象及代谢产物的观察 1）液体培养基---沉淀、浑浊、表面生长现象。 2）三葡、三链、大肠与副伤乙培养基的菌落特征、溶血环观察。3）双糖含铁培养基---动力、气体、硫化氢、分解乳糖观察。 4）结核杆菌菌落的观察。 3.中草药、抗生素抑菌试验1）中草药---大蒜汁、黄连、黄芩、黄柏。2）抗生素---青霉素、庆大、氨苄、新诺明、生理盐水。实验三

药品的微生物限度检查（三）微生物的形态学检查及药物的敏感性试验

目前二十七页\总数五十八页\编于二点1）从伊红美兰琼脂平板培养基上-----挑取黑色带有金属光泽的湿润菌落，接种在普通琼脂斜面培养基上面，进行细菌的纯培养。2）观察外用药物在16烷三甲基溴化胺琼脂斜面培养基上生长状况。记录被检菌色素的溶解性质、液化明胶的状况及菌苔粘稠度等。革兰氏染色镜下观察其菌落形态。根据上述被检菌落的生物性质和状况及细菌形态，确定该被检菌的名称。3）从卵黄高盐琼脂平板培养基上生长，挑取黄色的湿润菌落，接种在普通琼脂斜面培养基上面，进行细菌的纯培养。药物的微生物限度检查（三）目前二十八页\总数五十八页\编于二点2.细菌的生长现象及代谢产物的观察混浊生长菌膜菌沉淀均匀浑浊对照目前二十九页\总数五十八页\编于二点菌膜生长目前三十页\总数五十八页\编于二点目前三十一页\总数五十八页\编于二点目前三十二页\总数五十八页\编于二点目前三十三页\总数五十八页\编于二点3.中草药、抗生素抑菌试验目前三十四页\总数五十八页\编于二点纸片法目前三十五页\总数五十八页\编于二点六、革兰染色法原理：革兰阳性菌与革兰阴性菌细胞壁差异应用方法标本片制备革兰染色结果目前三十六页\总数五十八页\编于二点

2.革兰染色（1）初染：滴加结晶紫染液l～2滴，1分钟.水洗（2）媒染：滴加碘液，l～2滴，作用1分钟后水洗。（3）脱色：滴加95％酒精数滴，（约15～30秒），立即水洗。（4）复染：滴加稀释复红染液1～2滴，作用1分钟后水洗。（5）结果：牙垢标本中革兰阳性菌染成紫色，革兰阴性菌染成红色。其中真菌(白色念珠菌)染成紫色，而螺旋体等被染成红色。口腔中脱落的组织细胞及个别白细胞被染成红色。其细胞质呈红色，细胞核呈深红色。

目前三十七页\总数五十八页\编于二点实验四药物的微生物限度检查（四）病毒和细菌及其他病原微生物一、目的要求1、了解抗酸染色方法及各种病毒和细菌的菌落形态2、掌握药品的微生物学检验程序和方法二、实验内容1、药物的药物的微生物限度检查（四）1）将口服药物中的细菌分别接种：①蛋白胨水培养基；②葡萄糖蛋白胨水培养基；③枸橼酸盐（西蒙氏）培养基。同时接种产气杆菌于上述培养管做对照，以备进行IMViC试验。2）取接种在普通琼脂斜面培养基上面的外用药物中细菌进行血浆凝固酶检测,依据其反应结果,确定该菌的性质及名称。2、抗酸染色 3、真菌培养物的观察------黑曲霉、木霉、青霉菌菌落，白色念珠菌假菌丝，酵母菌菌落的观察。4、记录中草药、抗生素抑菌试验结果5、观察鸡胚的结构 目前三十八页\总数五十八页\编于二点---------------------------------------------------试验培养基加试剂试验结果大肠埃希菌产气杆菌蛋白胨水2管11葡萄糖蛋白胨水2管11葡萄糖蛋白胨水2管11枸橼酸盐2管11目前三十九页\总数五十八页\编于二点实验四药物的微生物限度检查（四）病毒和细菌及其他病原微生物取接种在普通琼脂斜面培养基上面的外用药物中细菌进行血浆凝固酶检测,依据其反应结果,确定该菌的性质及名称。

目前四十页\总数五十八页\编于二点二.血浆凝固酶试验原理：非致病性葡萄球菌不产生血浆凝固酶而致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，可使含有枸橼酸钠或肝素抗凝剂的兔或人等血浆发生凝固。方法：1.取洁净玻片，用记号笔画两个圈并标号，其中一个滴加生理盐水另一个滴加兔血浆。2.接种环烧灼灭菌后挑取金葡菌苔，1/2在生理盐水中研匀混悬，另1/2在兔血浆中研匀混悬，静止片刻，观察结果。结果：凝集呈颗粒状判定为血浆凝固酶试验（+），呈均匀混浊状不凝集判定为（-）目前四十一页\总数五十八页\编于二点方法：1.取洁净玻片，用记号笔画两个圈并标号，其中一个滴加生理盐水另一个滴加兔血浆。2.接种环烧灼灭菌后挑取金葡菌苔，1/2在生理盐水中研匀混悬，另1/2在兔血浆中研匀混悬，静止片刻，观察结果。结果：凝集呈颗粒状判定为血浆凝固酶试验（+），呈均匀混浊状不凝集判定为（-）目前四十二页\总数五十八页\编于二点制片（涂片、干燥、固定）；石炭酸复红初染（加温、盖滤纸片）5min---水洗；3％盐酸酒精脱色（15S,水洗）；美兰复染（1min，水洗）-滤纸吸干镜检。抗酸染色步骤目前四十三页\总数五十八页\编于二点结核杆菌目前四十四页\总数五十八页\编于二点抗生素体外抑菌试验（二）

记录纸片法结果测量抑菌环直径

目前四十五页\总数五十八页\编于二点病毒的分离培养—鸡胚接种动物接种鸡胚培养组织细胞培养病毒的培养方法：目前四十六页\总数五十八页\编于二点病毒的分离培养—鸡胚接种目前四十七页\总数五十八页\编于二点病毒名称接种部位鸡胚胚龄（天）痘类病毒绒毛尿囊膜10～13流感、副流感、腮腺炎病毒尿囊9～11嗜神经病毒卵黄囊5～8初次分离标本羊膜腔10～12病毒的分离培养—鸡胚培养目前四十八页\总数五十八页\编于二点实验五药物的微生物限度检查（五）一、目的要求掌握药品的微生物学检验程序和方法二、实验内容以生化反应（IMViC）检测口服药中细菌的性质。目前四十九页\总数五十八页\编于二点---------------------------------------------------试验培养基加试剂试验结果大肠埃希菌产气杆菌吲哚(I)蛋白胨水2管苯甲醛试剂0.5ml(5滴)红阳性（+）无色变阴性（-）甲基红(M)葡萄糖蛋白胨水2管甲基红5滴红色阳性（+）黄色阴性（-）VP葡萄糖蛋白胨水2管培氏乙6滴——萘酚试剂6滴无色变阴性（-）红色阳性（+）枸椽酸盐(C)枸橼酸盐2管绿无色变阴性（-）绿—蓝色阳性（+）目前五十页\总数五十八页\编于二点IMViC结果吸哚试