第二章菌种选育

第二章菌种选育1第1页，共127页，2023年，2月20日，星期三第一节菌种的分离简介

一、菌种的来源根据资料直接向有关科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；从大自然中分离筛选新的微生物菌种。教材P302第2页，共127页，2023年，2月20日，星期三二、分离思路

新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合。3第3页，共127页，2023年，2月20日，星期三定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。采样：有针对性地采集样品。增殖：人为地通过控制养分或培养条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。分离：利用分离技术得到纯种。发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。三、新种分离与筛选的步骤4第4页，共127页，2023年，2月20日，星期三菌种筛选主要步骤调查研究及查阅充分的资料

↓

设计实验方案

↓确定采集样品的生态环境

采样

↓确定特定的增殖条件

增殖培养

确定特殊的选择培养基及可能的

定性或半定量快速检出法

平板分离

↓5第5页，共127页，2023年，2月20日，星期三原种斜面

↓确定发酵培养基础条件

筛选

↓

初筛（1株1瓶）

↓

复筛（1株3～5瓶）

↓结合初步工艺条件摸索

再复筛（1株3～5瓶）

↓

3～5株

↓

单株纯种分离

生产性能试验

→毒性试验

菌种鉴定6第6页，共127页，2023年，2月20日，星期三（一）采样1、采样对象以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主；富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。7第7页，共127页，2023年，2月20日，星期三从自然界筛选8第8页，共127页，2023年，2月20日，星期三2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。3、采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。9第9页，共127页，2023年，2月20日，星期三（二）增殖培养所谓增殖培养就是给混合菌群提供一些有利于所需菌株生长或不利于其他菌型生长的条件，以促使目标菌株大量繁殖，从而有利于分离它们。为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择性培养基，选择一定的培养条件来控制。例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。10第10页，共127页，2023年，2月20日，星期三（三）培养分离

尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这—步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。11第11页，共127页，2023年，2月20日，星期三1.稀释平皿分离法1.稀释平皿分离法100ml1g9ml9ml9ml9ml9ml9ml1/1001/100010-810-710-610-510-41ml1ml1ml1ml1ml(1)稀释12第12页，共127页，2023年，2月20日，星期三1.稀释平皿分离法b.涂布平皿分离法a.倾注平皿分离法13第13页，共127页，2023年，2月20日，星期三2.平皿划线分离法

a.分区划线分离法b.连续划线分离法14第14页，共127页，2023年，2月20日，星期三（四）筛选这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。15第15页，共127页，2023年，2月20日，星期三（五）毒性试验自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。16第16页，共127页，2023年，2月20日，星期三第二节培养分离从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要和基础的步骤。到目前为止，还没有一种分离培养方法能揭示一个试样中所包含的所有微生物总数和种类。在任一试样中所存在的微生物仅为极少数特定种类的菌株；在工业微生物筛选过程中，应及时调整检测方法，以与各种不同类型的生长和代谢之微生物相适应。17第17页，共127页，2023年，2月20日，星期三一、成功的分离培养方法(1)认真考查所需产品的特征和生产过程；(2)制订初步的筛选标准；(3)将生态学方法运用到分离和筛选过程。18第18页，共127页，2023年，2月20日，星期三二、将生态学方法用于培养分离的一般思路要点1．罗列出所要分离的微生物类群；2．根据所采集样本的各种生态参数，描述所要分离的微生物之生态系统或栖息地：3．将若干样本分成若干类型，如植物和植物各部，土壤(类型和土层)、岩石、水、昆虫和发酵食品等；4．罗列出所要考察和测量的环境参数，如pH、盐分、水分、氧化还原电势及温度等；19第19页，共127页，2023年，2月20日，星期三

5．列出生物系统中有用的自然底物，如森林土壤中的几丁质、葡萄表皮的果胶；

6．根据上述1-5项中所获得的数据，设计分离方法，即选择适宜的稀释液、底物、试样、天然浸出汁和培养条件；

7．用标准方法作对照来评价生态学分离方法；

8．根据待检材料的生态参数需要，修改已知的方法；

9．运用特定的富集方法，富集那些可能具有筛选意义的微生物类群。20第20页，共127页，2023年，2月20日，星期三三、自然界中细菌的分离21第21页，共127页，2023年，2月20日，星期三

(一)采样和采集方法为了从一特定生态系统中分离出具有代表性的细菌菌群，特别是分离那些在唯一微环境区域中出现的菌群时，必须十分重视样本的采集。样本采集时所需的工具通常有无菌刮铲、土样采集器、镊子、解剖刀、手套、无菌小塑料袋和塑料瓶等。三、自然界中细菌的分离22第22页，共127页，2023年，2月20日，星期三采样的注意事项1、采样时应尽可能保持相对无菌；2、所采集的样本必须具有某种代表性；3、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、地点以及采集地点的地理、生态参数等；4、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为真正的原地菌群的出现可能是短暂的；三、自然界中细菌的分离23第23页，共127页，2023年，2月20日，星期三5、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存于4℃下，但贮存时间不宜过长。这是因为一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱离了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生变化，微生物群体之间就会出现消长三、自然界中细菌的分离采样的注意事项24第24页，共127页，2023年，2月20日，星期三(二)生态学参数及培养基的组成原则1、加入培养基中的天然提取物种类和用量、环境生物物理学参数以及用于平板涂布分离样本的溶剂都会影响实验中所要分离的细菌的数量和种类。2、就分离培养基的组成而言，必须含有10-50%的天然提取物。加入培养基中的天然提取物，应含有多种碳、氮源，如几丁质、纤维素或果胶。三、自然界中细菌的分离25第25页，共127页，2023年，2月20日，星期三3、所有分离培养基中都应含有抗真菌剂(如放线菌酮和制霉素)，掺加浓度一般为50μg／m1，以抑制真菌的生长。4、琼脂平板在使用前应置于37℃培养箱中孵育l、2天。5、培养基的生物物理学参数，如pH及盐分也应调节到与试样的生态系统参数值相近。三、自然界中细菌的分离(二)生态学参数及培养基的组成原则26第26页，共127页，2023年，2月20日，星期三（三）分离目的微生物不纯，需分离纯化。采用简便迅速，有一定准确性的检出方法，提高筛选效率。常用平皿反应法：纸片培养显色法：浸有指示剂滤纸。透明圈法：混浊底物被分解后形成透明圈。如可溶性淀粉、碳酸钙等。

变色圈法：直接用显色剂或指示剂。

生长圈法：利用某些具有特殊营养要求的微生物作为工具菌，要分离的微生物能在一般培养条件下生长而合成该营养物而使工具菌能生长，形成生长圈。

抑制圈法：琼脂块培养法。三、自然界中细菌的分离27第27页，共127页，2023年，2月20日，星期三用刚果红染色法鉴定筛选降解纤维素的菌株

羧甲基纤维素钠作培养物28第28页，共127页，2023年，2月20日，星期三29第29页，共127页，2023年，2月20日，星期三四、放线菌的分离培养基的组成原则大多数放线菌的分离培养是在贫脊或复杂底物的琼脂平板上进行的。除嗜温性放线菌外，其他放线菌一般在培养4-20天内在分离平板上缓慢形成菌落。在放线菌分离琼脂中通常都加入抗真菌剂制霉菌素或放线菌酮，以抑制真菌的繁殖。选择性地添加抗生素。分离琼脂平板制备好后，一般皆应在37℃培养箱中存放3天。30第30页，共127页，2023年，2月20日，星期三放线菌的分离土样中放线菌的非选择性分离：土样风干，磨碎，无菌海绵压印土样后压印平板后培养。植物体上放线菌的分离：无菌取植物组织，干燥以减少细菌数量，剪碎植物材料后植入平板表层后培养。也可洗下微生物后振荡培养。水中放线菌的分离：为使所要分离的放线菌的数量种类增多，一般将水样离心或滤纸过滤，取离心沉积或滤纸表面沉积进行系列稀释和涂布。31第31页，共127页，2023年，2月20日，星期三次代培养及纯化菌落形成后可根据肉眼可见的菌落形态上的差异，作初步的鉴定和区分。通过高倍放大进行镜检，可了解气生和营养孢子形成情况。成功地分离出各种不同的放线菌属及种的关键是所采集样本的本身及其分离用的琼脂培养基；而肉眼识别不同的生长形态、从而初步地加以鉴定，在分离放线菌时显得尤为重要。将分离平板上所形成的菌落用经火焰灼烧灭菌的钩形针或无菌牙签挑取，点接到琼脂平板上进行影印培养，以进一步筛选和分离。放线菌的分离32第32页，共127页，2023年，2月20日，星期三放线菌菌落形态33第33页，共127页，2023年，2月20日，星期三五、真菌分离1、利用低碳／氮比的培养基可使真菌生长菌落分散，利于计数，分离和鉴定。这里主要是利用营养成分的减少而使生长减慢，并由此限制真菌的迁徙生长。2、改变培养温度将有利于不同嗜温区真菌的分离。3、有时，真菌子实体形成必须有光线，这在分离培养时应加以考虑。34第34页，共127页，2023年，2月20日，星期三4、选择性富集：是通过一定的方式使样本中一种或一群微生物数量上的增加而利于分离的一种技术。富集可以是种水平的，如通过营养要求的改变来富集分离镰刀菌；也可以是组成群水平的，如以纤维素为唯一碳源的选择性培养基可选择性富集所有能降解纤维素的纤维素裂解微生物。5、在分离培养基中加入一定的抗生素即可有效地抑制细菌生长及菌落形成。五、真菌分离35第35页，共127页，2023年，2月20日，星期三真菌的分离方法土中真菌的分离：稀释法，压贴法,注射器采集法，土过筛法。植物材料中真菌的分离：植入法，压贴法，洗涤法，浸泡法。水中真菌的分离：水样稀释后涂布分离。诱饵技术常用于水中真菌的富集。教材P32五、真菌分离36第36页，共127页，2023年，2月20日，星期三六、生产选种是在长年累月的生产实践中，在培养工艺条件没有任何可见变更情况下，突然发现某些批次生产水平提高较大，这就有可能是个别自然变异朝更好的方向变的细胞，在这种条件下很适应于培养条件，并逐渐显示出它的生长优势，这种优势的发展，促使它优良的生产性能表露。37第37页，共127页，2023年，2月20日，星期三第三节工业微生物育种2.3.1

工业化菌种的要求2.3.2

已工业化产品生产菌的介绍2.3.3

工业微生物育种简介2.3.4

诱变育种2.3.5

营养缺陷型的选育2.3.6原生质体育种38第38页，共127页，2023年，2月20日，星期三工业化菌种的要求

能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物

有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操作性要强

遗传性能要相对稳定

不易感染它种微生物或噬菌体

产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）

生产特性要符合工艺要求第三节工业微生物育种39第39页，共127页，2023年，2月20日，星期三放线菌（链霉素四环素；红霉素等）真菌（青霉素、头孢等）一些产芽孢的细菌植物或动物来源一、抗生素生产有关的微生物抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，目前发现的生物来源如下：已工业化产品生产菌的介绍第三节工业微生物育种40第40页，共127页，2023年，2月20日，星期三二、氨基酸生产有关的微生物代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。50,60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是发酵工业发展历史上的一个转折点：已工业化产品生产菌的介绍第三节工业微生物育种41第41页，共127页，2023年，2月20日，星期三HD:高丝氨酸脱氢酶黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸的合成调节机制

HT:高丝氨酸转乙酰酶AK:天冬氨酸激酶42第42页，共127页，2023年，2月20日，星期三氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚，代谢途径比较简单谷氨酸发酵的菌种：其它氨基酸生产菌：棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌43第43页，共127页，2023年，2月20日，星期三三、食品酶制剂生产有关的微生物开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。关于食品用酶，美国需要得到FDA的批准。目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌和地衣牙孢杆菌已工业化产品生产菌的介绍第三节工业微生物育种44第44页，共127页，2023年，2月20日，星期三第三节工业微生物育种工业菌种的育种：是运用遗传学原理和技术对某个用于特定生物技术目的的菌株进行的多方位的改造。通过改造，可使现存的优良性状强化，或去除不良性质或增加新的性状。45第45页，共127页，2023年，2月20日，星期三工业菌种育种的方法诱变基因转移基因重组46第46页，共127页，2023年，2月20日，星期三育种过程包括下列3个步骤：

(1)在不影响菌种活力的前提下，有益基因型的引入。(2)希望基因型的选出。(3)改良菌种的评价(包括实验规模和工业生产规模)。47第47页，共127页，2023年，2月20日，星期三选择育种方法时综合考虑的因素

(1)待改良性状的本质及与发酵工艺的关系(如批式或连续发酵试验)；

(2)对这一特定菌种的遗传和生物化学方面认识的明了程度；

(3)经济费用。如果对特定菌种的基本性状及其工艺知晓甚少，则多半采用随机诱变、筛选及选育等技术：如果对其遗传及生物化学方面的性状已有较深的认识，则可选择基因重组等手段进行定向育种。48第48页，共127页，2023年，2月20日，星期三工业菌种改良方法

(1)解除或绕过代谢途径中的限速步骤：通过增加特定基因的拷贝数或增加相应基因的表达能力来提高限速酶的含量；在代谢途径中引伸出新的代谢步骤，由此提供一个旁路代谢途径。

(2)增加前体物的浓度。

(3)改变代谢途径，减少无用副产品的生成以及提高菌种对高浓度的有潜在毒性的底物、前体或产品的耐受力。49第49页，共127页，2023年，2月20日，星期三(4)抑制或消除产品分解酶。(5)改进菌种外泌产品的能力。(6)消除代谢产品的反馈抑制。如诱导代谢产品的结构类似物抗性。工业菌种改良方法50第50页，共127页，2023年，2月20日，星期三

改进菌种的生长效率提高菌株对底物的利用率方法：

a.通过确定并改变代谢中的耗能部分;b.赋予菌种对多种底物，特别是价廉而丰富的底物的利用能力，由此可降低操作费用。51第51页，共127页，2023年，2月20日，星期三2.3.4诱变育种以微生物的自然变异作为基础的生产选种的机率并不很高，一个基因的自然突变频率仅10-6-10-10左右。诱变育种：以诱发突变为基础的育种，是迄今为止国内外提高菌种产量、性能的主要手段。教材P3752第52页，共127页，2023年，2月20日，星期三诱变物理、化学或生物诱变方法53第53页，共127页，2023年，2月20日，星期三

一、诱变剂和诱变处理物理诱变剂：射线如紫外线、X—射线、γ—射线，快中子；物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线。许多高产菌株的选育都用过紫外线，对于一般实验室、中小型工厂都适用，也很安全。其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿透力，一般都由专业人员在专门的设备中使用，否则有一定危险性。教材P4054第54页，共127页，2023年，2月20日，星期三超净工作台小型X射线衍射仪Co60射线机55第55页，共127页，2023年，2月20日，星期三化学诱变剂：化学因子如碱基类似物、5—氟尿嘧啶、烷化剂等。化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。使用化学诱变剂的优缺点：1、大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射更有效。56第56页，共127页，2023年，2月20日，星期三2、化学诱变剂是很经济的，因为只需要少量的合适的诱变剂，设备是实验室的一般玻璃器皿，一个蒸气罩。而用电离辐射工作时，设备费用大，并要注意安全性。3、大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用中必须非常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，且切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其敏感，甚至未直接接触就会过敏，这就更要当心。使用化学诱变剂的优缺点：57第57页，共127页，2023年，2月20日，星期三诱变剂的选择1．碱基类似物和羟胺具有很高的特异性，但很少使用，回复突变率高，效果不大。2．亚硝酸和烷化剂应用的范围较广，造成的遗传损伤较多。其中亚硝基胍和甲基磺酸乙酯常被称为“超诱变剂”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变剂之一。58第58页，共127页，2023年，2月20日，星期三3．吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径的完全中断。4．紫外线仍十分有效。电离辐射是造成染色体巨大损伤的最好诱变剂，它能造成不可回复的缺突变。但它可能影响邻近基因的性能。诱变剂的选择59第59页，共127页，2023年，2月20日，星期三空间诱变近年来用宇宙系列生物卫星、科学返回卫星、空间站及航天飞机等空间飞行器,进行搭载微生物材料的空间诱变育种是培养新的生物菌种的一种有效方法.近年空间诱变的研究进展迅速,已涉及到形态学、细胞学、生理生化、分子生物学等领域。并开始进行地面模拟失重实验。60第60页，共127页，2023年，2月20日，星期三空间诱变空间环境的主要特征为微重力、空间辐射、超真空和超净环境等。一般认为空间诱变的主要因素有以下几个方面：微重力。影响细胞分裂细胞运动、细胞间信息传递、光合作用和生长发育等生理生化过程。引起遗传物质的改变。微重力通过提高生物对诱变剂的敏感性和抑制DNA损伤的修复，加剧生物损伤并提高变异率。61第61页，共127页，2023年，2月20日，星期三空间诱变一般认为空间诱变的主要因素有以下几个方面：太空辐射空间诱变与地面辐射处理发生的变异情况有许多类似之处，辐射敏化剂预处理能增加生物损伤。62第62页，共127页，2023年，2月20日，星期三空间诱变——卫星中微生物生长的情况某种链霉菌搭载后其菌落生长加快（比地面对照快6倍）悬浮生长的微生物细胞在空间与在地面以不同的速度繁殖。微重力可以使许多微生物生长加快1倍以上。因为在微重力条件下，空气中的氧可以均匀地供给细菌应用。这表明了在空间生产生物制品的优越性。63第63页，共127页，2023年，2月20日，星期三空间诱变真空度的提高会导致孢子突变频率的提高，但对质粒DNA无影响。宇宙射线会导致DNA链的断裂而促使生物发生突变。64第64页，共127页，2023年，2月20日，星期三神七：清华大学搭载了新型生物材料、生物燃料、医药和食品的重要微生物菌种，主要用于“工业生物技术”研究领域。中国科学院搭载了用于空间生命科学实验的南芥、番茄等材料，主要用于空间微重力对高等植物基因表达影响的研究，实验研究结果将为今后载人航天事业的空间保障系统的建立提供科学依据。中国林科院搭载了多种林草类种子，将用于国家“863”计划、国家自然科学基金等项目的研究工作，其研究成果对城市园林绿化的植物配置、对恶劣生态环境的生物恢复等有着相当广泛的应用前景。卫生部纳米生物技术重点实验室搭载了用于医学领域研制抗恶性肿瘤的纳米药物生物原料等多种重要植物品种，可望筛选出具有更高活性和合成能力的抗恶性肿瘤的优良菌株，将产生相当大的经济效益。另外，福建水产研究院、中国空间科学学会等单位搭载了水产动植物生命活体和中草药，进行水产生物太空诱变育种科学研究及水产生物航天搭载存活技术研究。65第65页，共127页，2023年，2月20日，星期三二、诱变育种步骤出发菌株的选择处理菌悬液的制备诱变处理中间培养分离和筛选教材P3866第66页，共127页，2023年，2月20日，星期三(一)出发菌株的选择1．自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较敏感，容易达到好的效果。2．在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较相像，也是良好的出发菌株。3．每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变能积累较多的提高。4．出发菌株开始时可以同时选2～3株，在处理比较后，将更适合的出发菌株留作继续诱变。二、诱变育种步骤教材P3967第67页，共127页，2023年，2月20日，星期三

5．要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状大部分是隐性的，特别是高产基因。

6．根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态或诱变谱选择诱变剂，因为同一诱变剂的重复处理会使细胞产生抗性，使诱变效果下降。有的诱变剂是作用于营养细胞，就要选对数期的细胞：有的作用于休止期，就可选用孢子。二、诱变育种步骤(一)出发菌株的选择68第68页，共127页，2023年，2月20日，星期三

(二)处理菌悬液的制备这一步骤的关键是制备单细胞和单孢子状态的、活力类似的菌悬液，为此要进行合适培养基的培养，并要离心，洗涤，过滤。带玻璃珠的三角瓶内,加无菌水二、诱变育种步骤69第69页，共127页，2023年，2月20日，星期三(三)诱变处理根据前面有关诱变剂及诱变处理的介绍，结合诱变对象的实际，设计诱变处理方案。

二、诱变育种步骤70第70页，共127页，2023年，2月20日，星期三

(四)中间培养由于在发生了突变尚未表现出来之前，有一个表现延迟的过程，即细胞内原有酶量的稀释过程(生理延迟)，需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。此过程称为中间培养。这个过程对今后的筛选和获得稳定菌株都是极为重要的。二、诱变育种步骤71第71页，共127页，2023年，2月20日，星期三方法：让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，以让细胞的遗传物质复制，让细胞繁殖几代，以得到纯的变异细胞。若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。二、诱变育种步骤

(四)中间培养72第72页，共127页，2023年，2月20日，星期三(五)分离和筛选筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。因此在具体方法上就有差异.二、诱变育种步骤73第73页，共127页，2023年，2月20日，星期三初筛可以在平皿上直接以菌落的代谢产物与某些染料或基质的作用形成的变色圈或透明圈的大小来挑取参加复筛者，而将90%的菌落淘汰。在数量减少后就要仔细比较参加复筛和再复筛的菌株，最后才能选得优秀菌株。在以后的复筛阶段，还应不断结合自然分离，纯化菌株。摇床复筛降解纤维素产生产透明圈病毒产生产空斑74第74页，共127页，2023年，2月20日，星期三紫外线的诱变育种

紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为253-265nm．灯与处理物的距离为30cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在70～80%为宜。教材P4075第75页，共127页，2023年，2月20日，星期三

被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个/ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106～107个

/ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约0.5～1.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时和照射后的处理应在红灯下进行。紫外线的诱变育种教材P4076第76页，共127页，2023年，2月20日，星期三

(二)操作步骤

1．将细菌培养液以3000r／min离心5min，倾去上清液，将菌体打散加入无菌生理盐水再离心洗涤。

2．将菌悬液放入一已灭菌的，装有玻璃珠的三角瓶内用手摇动，以打散菌体。将菌液倒入有定性滤纸的漏斗内过滤，单细胞滤液装入试管内，一般处于浑浊态的细胞液含细胞数可达108个／ml左右，作为待处理菌悬液。

紫外线的诱变育种77第77页，共127页，2023年，2月20日，星期三3．取2～4mL制备的菌液加到直径9cm培养皿内，放入一无菌磁力搅拌子，然后置磁力搅拌器上、15W紫外线下30cm处。在正式照射前，应先开紫外线10min，让紫外灯预热，然后开启皿盖正式在搅拌下照射10～50s。操作均应在红灯下进行，或用黑纸包住，避免白炽光。紫外线的诱变育种78第78页，共127页，2023年，2月20日，星期三

4．取未照射的制备菌液和照射菌液各0.5ml进行稀释分离，计数活菌细胞数。

5．取照射菌液2ml于液体培养基中(300ml三角瓶内装30ml培养液)，120r／min振荡培养4～6h。

6．取中间培养液稀释分离、培养。

7．挑取菌落进行筛选。紫外线的诱变育种79第79页，共127页，2023年，2月20日，星期三亚硝基胍诱变曲霉菌

N—甲基—N'-硝基-N-亚硝基胍(NGN，MNNG或TG)对真核或原核微生物都有强烈的诱变作用。其精确的作用机制尚不很清楚，据认为是伴随着重氮甲烷的生成及在酸性条件下生成亚硝酸，直接作用于细胞内的DNA复制系统，从而诱发了变异。MNNG的诱变作用随pH的升高而增强。80第80页，共127页，2023年，2月20日，星期三

(二)操作步骤

1．单孢子悬液制备取斜面，加入6ml0.1mol／LpH6.0的磷酸缓冲液，用接种环刮下孢子，振荡试管，立即通过带滤纸漏斗过滤，由此制得单孢子悬液，若孢子液浑浊状，其孢子浓度可达106个／ml，此为待处理孢子悬液。

2．MNNG溶液的制备用分析天平称取2mg，加入2ml0.1mol／LpH6.0磷酸缓冲液，于暗处振荡溶解。亚硝基胍诱变曲霉菌81第81页，共127页，2023年，2月20日，星期三3．诱变处理吸取MNNG溶液lml，加入到1m1孢子悬液中，30℃振荡30min，立即稀释1000倍停止作用，然后以10-2，10-4两个稀释度于30℃下分离培养，3天后计数。

4．死亡率计算将未处理的孢子液1ml加入1ml磷酸缓冲液中，同上逐级稀释分离，30℃下培养3天。根据处理前后的活孢子数可计算出死亡率。

5．挑取菌落进行糖化酶及蛋白酶产量筛选．82第82页，共127页，2023年，2月20日，星期三影响诱变效果的因素出发菌株的遗传特性诱变剂菌种的生理状态诱变处理前后的培养条件T,O2,pH，可见光教材P3983第83页，共127页，2023年，2月20日，星期三2.3.5营养缺陷型的选育营养缺陷型是指通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质如氨基酸、维生素和碱基等的能力，必须在其基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长的变异株。与营养缺陷型对应的是野生型。84第84页，共127页，2023年，2月20日，星期三与筛选营养缺陷型有关的三类培养基

①基本培养基（M.M．，minimalmedium）——能满足某一菌种的野生型或原养型菌株营养要求的最低成分的合成培养基。

②补充培养基（S.M．，

supplementalmedium）——在基本培养基中有针对性地补加某一种或几种营养成分，以满足相应的营养缺陷型菌株生长需要（其他营养缺陷型仍不能生长）的培养基。

③完全培养基（C.M．，

completemedium）——可满足该菌各种营养缺陷型菌株营养需要的天然或半合成培养基。85第85页，共127页，2023年，2月20日，星期三营养缺陷型的用途

营养缺陷型在生产上和科学研究上用途很大。目前生产氨基酸、核苷酸的菌种都是各种类型的缺陷型。要研究代谢途径，育种技术都必须有营养缺陷型的菌株为材料。86第86页，共127页，2023年，2月20日，星期三筛选营养缺陷型的步骤诱变淘汰野生型检出缺陷型确定生长谱87第87页，共127页，2023年，2月20日，星期三一、诱变方法物理诱变化学诱变筛选营养缺陷型的步骤88第88页，共127页，2023年，2月20日，星期三二、淘汰野生型抗生素法：野生型能在MM中生长，而缺陷型不能，于是将诱变处理液在MM中培养短时让野生型生长，处于活化阶段，而缺陷型无法生长，仍处于休眠状态。由于细菌或酵母对一些抗生素敏感，于是就相应加入一定量的抗生素，结果活化状态的野生型就被杀死，保存了缺陷型。一般细菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。菌丝过滤法：对于霉菌，因孢子生长后会长出菌丝体，就可用滤纸过滤法将菌丝滤去，而缺陷型孢子却因未发芽而不能滤过。筛选营养缺陷型的步骤89第89页，共127页，2023年，2月20日，星期三

三、检出缺陷型原理：在固体基本培养基和完全培养基上，野生型和缺陷型生长情况完全不同，缺陷型在CM上生长良好，而在MM上则不生长，野生型都能生长。具体方法：影印法、点种法、夹层法

筛选营养缺陷型的步骤90第90页，共127页，2023年，2月20日，星期三1．将一较平皿直径小1cm的金属圆筒蒙上一层灭菌的丝绒，用金属夹夹住，灭菌。2．将完全培养基上长出的全部菌落在丝绒上轻轻一压，使之成为印模，标记方位。3．将基本培养基平皿和完全培养基平皿在标记的同一方位上先后轻轻一压，此菌印模即复印于上。

(一)影印法

三、检出缺陷型筛选营养缺陷型的步骤91第91页，共127页，2023年，2月20日，星期三4．将CM和MM在恒温箱中培养。5．二平皿相同方位进行比较，即可发现在MM平皿上长出的菌落少于CM平板上的。MM上未长而相应于CM上长出的那几个菌落就可能是缺陷型。此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之间应有一定间隔。

(一)影印法

三、检出缺陷型筛选营养缺陷型的步骤92第92页，共127页，2023年，2月20日，星期三

(二)点种法也就是任意法。用接种针或牙签将CM上长出的菌落在MM和CM两副平板上接种，依次在相应位置点种，然后一起培养，观察其生长情况。此法结果明确，但工作量大。

三、检出缺陷型筛选营养缺陷型的步骤93第93页，共127页，2023年，2月20日，星期三

(三)夹层法先在培养皿上倒一层基本琼脂培养基，凝固后涂上一层含菌的MM，凝固后再倒一薄层MM琼脂培养基，培养24h，将出现菌落标记，然后倒上一层CM琼脂培养基，再培养。这时第二批长出的菌落就可能是缺陷型。此法缺点是，结果有时不明确，而且将缺陷型菌落从夹层中挑出并不很容易。

三、检出缺陷型筛选营养缺陷型的步骤94第94页，共127页，2023年，2月20日，星期三四、营养缺陷型生长谱的确定验证确定是缺陷型后，就需确定其缺陷的因子，即生长谱测定。筛选营养缺陷型的步骤95第95页，共127页，2023年，2月20日，星期三生长谱测定的方法将缺陷型菌株培养后，收集菌体，制备成细胞悬液，与MM培养基(融化并凉至50℃)混合并倾注平皿。待凝固后，分别在平皿的5～6个区间放上不同的营养组合的混合物或吸饱此组合营养物的滤纸圆片。培养后会在某组合区长出，就可测得所需营养。—个平皿测一个菌。四、营养缺陷型生长谱的确定筛选营养缺陷型的步骤96第96页，共127页，2023年，2月20日，星期三以不同组合的营养混合物与融化凉至50℃的MM培养基混合铺成平皿，然后在这些平皿上划线接种各个缺陷型菌株于各相应位置，培养后根据在这些组合长出可推知其营养因子。在5～6个平皿上可测20株菌以上。生长谱测定的方法四、营养缺陷型生长谱的确定筛选营养缺陷型的步骤97第97页，共127页，2023年，2月20日，星期三2.3.6

原生质体育种原生质体育种技术主要有原生质体融合、原生质体转化技术，此外尚有原生质体诱变育种等。原生质体融合育种是基因重组的一种重要方法。原生质体融合作为一种新的基因重组手段是1978年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上提出来的。教材P4898第98页，共127页，2023年，2月20日，星期三1838Muller动物病理组织中发现多核细胞1873Lugmbuthl天花病脓胞周围发现多核细胞1896Unna水痘侵害过的皮肤中发现多核细胞1931Wathin麻疹病人扁桃腺中发现多核细胞1954Bndersetal组织培养中发现麻疹病毒能诱导细胞形成多核体1958Marston用副流感病毒诱发细胞融合1970Poweretal探索用硝酸钠诱导植物原生质体融合1972Carlson用NaNO3进行了烟草种间原生质体融合1972Ferenczyetal白地霉营养缺陷型为材料经原生质体融合首次完成异核体形成1974Michayluk发现PEG是一种良好的聚合剂用于原生质体融合1976Ferenczyetal曲霉青霉营养缺陷型为材料经原生质体融合首次完成异核体形成1976Fodoretal巨大芽孢杆菌内株间原生质体融合成功1977Hopwood链霉菌原生质融合并获融合重组子1978Glebaetal用PEG+高pH-Ca2+研究原生质体融合1981Menczel用高pH-Ca2++9℅DMSO(二甲基亚砜)与少量PEG获较高融合率1988Kirimalraetal原生质体融合获得黑曲霉二倍体柠檬酸高产菌株PEG原生质体研究的发展99第99页，共127页，2023年，2月20日，星期三

一、原生质体融合育种的特点(一)杂交频率较高：细胞壁去除后在高渗条件下形成类似于球形的原生质体。(二)二亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用，因此有利于不同种属间微生物的杂交。(三)遗传物质传递更为完整：原生质体融合是二亲株的细胞质和细胞核进行类似的合二为一的过程。100第100页，共127页，2023年，2月20日，星期三

(四)存在着两株以上亲株同时参与融合形成融合子的可能性。（五)有可能采用产量性状较高的菌株作融合亲株。

(六)提高菌株产量的潜力较大。

(七)有助于建立工业微生物转化体系。101第101页，共127页，2023年，2月20日，星期三二、原生质体融合育种步骤1．标记菌株的筛选和稳定性验证。2．原生质体制备。3．等量原生质体加聚乙二醇促进融合。4．涂布于再生培养基，再生出菌落。5．通过影印接种法，将其接种到选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融合子进一步试验、保藏。6．生产性能筛选。102第102页，共127页，2023年，2月20日，星期三原生质体融合操作示意图

去壁

[A+B-]

（高渗下）[A+B-]

PEG或电脉冲离心促融去壁

[A-B+]

（高渗下）[A-B+]

融合子（AA,BB,AB）长成菌落[--]检出[A+B+]融合子筛选优良性状的融合子103第103页，共127页，2023年，2月20日，星期三

三、原生质体融合育种的要点获得标记菌种的方法是采用常规诱变育种，筛选出营养缺陷型或／和抗药性菌株。这里最重要的是标记必须稳定。采用抗药性菌株除可作标记外，在实验室中还可排除杂菌污染的干扰。为的是确证融合的成功，可以采用多标记菌种。（一）标记菌种的选择104第104页，共127页，2023年，2月20日，星期三

(二)原生质体的制备原生质体的制备主要是在高渗压溶液中加入细胞壁分解酶，将细胞壁分离剥离，结果剩下由原生质膜包住的类似球状的细胞，它保持原细胞的一切活性。

在放线菌和细菌中，制备原生质体主要采用溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蜗牛酶或纤维素酶等。

三、原生质体融合育种的要点105第105页，共127页，2023年，2月20日，星期三

影响原生质体制备的因素1．菌体的前处理

为了使酶作用的效果好一些，可将菌作一些前处理。如细菌加入亚抑制剂量的青霉素。2．菌体的培养时间

为了使细胞易于原生质体化，一般选择增殖期的菌体。3．酶浓度

有人建议以使原生质体形成率和再生率之积达到最大时的酶浓度作为最佳酶浓度。106第106页，共127页，2023年，2月20日，星期三4．酶处理温度一般地说，酶解温度应控制在20～40℃。5．破壁时的pH值6．渗透压稳定剂

等渗透压在原生质体制备中，不仅起到保护原生质体免于膨裂，而且还有助于酶和底物的结合。

在细菌中多用蔗糖、丁二酸钠、NaCl等，在酵母菌中多用山梨醇、甘露醇等，在霉菌中多用KCl和NaCl等。稳定剂的使用浓度一般均在0.3～0.8mol/L之间。107第107页，共127页，2023年，2月20日，星期三原生质体融合的先决条件：获得有活力、脱壁较为完全的原生质体。原生质体融合的必要条件：能重建细胞壁，恢复完整细胞并能生长、分裂。影响原生质体再生的因素：菌种自身的再生性能、原生质体制备的条件、再生培养基成分、再生培养条件等。

(三)原生质体的融合和再生108第108页，共127页，2023年，2月20日，星期三(三)原生质体的融合和再生原生质体形成率可按下式进行计算：破壁前菌数-剩余菌数

原生质体形成率=---------------------------×100%

破壁前菌数109第109页，共127页，2023年，2月20日，星期三(三)原生质体的融合和再生再生培养基必须与原生质体内的渗透压相等。这就要在再生培养基中加入具有一定渗透压的基质即渗透压稳定剂，这与原生质体制备一样。对于不同的微生物来说，其原生质体的高渗再生培养基的主要成分是不同的。

110第110页，共127页，2023年，2月20日，星期三(三)原生质体的融合和再生融合后可能形成不稳定的异核体，会分离成亲本类型，有的甚至可以异核移接几代。要获得真正融合子，要在融合子再生后，进行几代自然分离、选择，才能确定。111第111页，共127页，2023年，2月20日，星期三第四节菌种的保藏在生物进化中：遗传性的变异是绝对的，稳定性是相对的；在变异中：退化性的变异是大量的，进化性的变异是个别的。112第112页，共127页，2023年，2月20日，星期三一.菌种的退化菌种退化degeneration的表现生产性状的劣化,遗传标记的丢失,原有的典型性状的不典型等菌落及细胞形态的改变生长速度缓慢代谢产物生产能力下降，即负突变致病菌对宿主侵染力下降抗不良环境条件（抗噬菌体，抗低温）能力减弱113第113页，共127页，2023年，2月20日，星期三2.菌种退化的原因：基因自发突变退化是发生在群体细胞中的一个从量变到质变的逐步演变过程。自发突变率10-8~10-9

加速退化的因素传代次数过多不适宜的培养条件114第114页，共127页，2023年，2月20日，星期三3.防止退化的措施（1）控制传代次数（2）创造良好的培养条件：培养基；培养温度等（3）利用不易衰退的细胞传代（4）采用有效的菌种保藏方法115第115页，共127页，2023年，2月20日，星期三二.菌种的复壮rejuvenation

狭义复壮在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施；广义复壮在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状的测定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。也称生产育种。116第116页，共127页，2023年，2月20日，星期三1、纯种分离对已衰退菌种配合一定培养条件进行单细胞分离纯化。2、通过宿主体复壮：病原菌3、淘汰已衰退的个体

对S.microflavus“5406”农用抗生菌的