病理生理学课件-8-细胞凋亡与疾病

病理生理学课件---8-细胞凋亡与疾病第一页，共72页。四、细胞凋亡与疾病三、细胞凋亡的发生机制

二、细胞凋亡过程与调控

一、概述

五、细胞凋亡在疾病防治中的意义第二页，共72页。一、概述（一）研究背景人们研究细胞的发育、分化和成熟至今已有百余年的历史，近二十年才发展到在分子水平上研究相关基因的表达调控。和细胞增殖一样，细胞死亡规律的研究一直被人们所忽视。可寻的研究：1858年，Virchow提出细胞死亡在动脉瘤中的重要性，并将它简单地定义为细胞退化（degeneration）、坏疽（mortification）、软化（softening）和坏死（necrosis）。第三页，共72页。1885年，Flemming在退行性卵巢囊泡中观察到染色质凝聚成半月形和细胞核渐进性退化、消失等现象，并称之为“染色质裂解”（chromatolysis）。1914年，Graper进一步提出机体内必定存在和有丝分裂为敌的平衡机制，而“染色质裂解”的意义就在于生理性清除细胞。

第四页，共72页。1951年，Glucksman发现细胞在生物发育中的特定时空内发生死亡，并提出程序化细胞死亡（programmedcelldeath）的概念。

20年后，Kerr发现结扎门静脉诱导肝细胞缺血后，出现肝萎缩现象，他将它称为“固缩性坏死”（shrinkagenecrosis）。1972年，Kerr，Wyllie和Currie等正式以细胞凋亡（apoptosis）命名这种特殊的细胞死亡形式。

第五页，共72页。1976—1981年间，三个小组分别发现淋巴细胞凋亡伴随典型的“梯样”DNA电泳图谱。

1984年，Wyllie进一步提出细胞凋亡伴随内源性核酸酶的激活。

20世纪80年代末期，生命科学家逐渐认识到细胞死亡，特别是程序化细胞死亡特殊的生物学意义，引起众多学者的广泛关注，形成一个新的研究热点，并以惊人的速度取得新进展.第六页，共72页。（二）概念

细胞凋亡（apoptosis）——由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程，又称程序性细胞死亡（PCD）。

Apoptosis源自希腊语，意为“花瓣或树叶的凋谢枯落”，细胞像秋天树叶凋谢一样，一定的生理或病理条件下，遵循自身所定程序结束生命的过程，细胞凋亡是一种由基因控制的自主性死亡。….有学者认为凋亡是形态学概念，程序性死亡是功能性概念。第七页，共72页。第八页，共72页。（三）与细胞坏死的区别细胞坏死是由强烈损伤因素作用下（缺氧、毒物、强酸、强碱等）细胞死亡，正常组织不发生细胞坏死，细胞凋亡为生理性、主动的细胞死亡。第九页，共72页。第十页，共72页。（四）细胞凋亡的意义1、确保机体正常发育、生长

2、维持内环境稳定3、发挥积极的防御功能

第十一页，共72页。二、细胞凋亡过程与调控（一）细胞凋亡过程1、凋亡信号转导

2、凋亡基因激活

3、细胞凋亡执行

4、凋亡细胞的清除

诱导期效应期降解期第十二页，共72页。第十三页，共72页。（二）凋亡时细胞主要变化

1、细胞形态学变化胞膜逐渐脱离与周围细胞的接触—空泡化

胞体缩小—固缩内质网与胞膜融合,在膜表面突起—出芽染色质深缩成团，分布于膜边缘—边集胞膜皱缩、内陷，分割胞浆，蛋白浓染形成—凋亡小体第十四页，共72页。凋亡小体被邻近细胞吞噬、清除（主要是巨噬细胞）凋亡过程不导致周围组织损伤和炎症反应

2、细胞凋亡的生化改变（1）DNA片段化

DNA链上每隔200个核苷酸有1个核小体，核小体之间的连接区易受内切酶的切割而断裂，当在核小体连接区切开DNA时，可形成200bp或整倍数的片段，在凝胶电泳中呈“梯”状。第十五页，共72页。（2）内源性核酸内切酶激活该酶由细胞内信号转导环节被激活，在细胞凋亡过程中执行染色质DNA切割任务（3）凋亡蛋白酶（caspases）的激活及其作用凋亡蛋白酶是一组对底物天冬氨酸部位有特异性水解作用，活性中心富含半胱氨酸的蛋白酶。（含半胱氨酸的门冬氨酸特异水解酶）第十六页，共72页。

有人在研究无脊椎动物如线虫细胞凋亡时发现，细胞的死亡呈现严格的特异性，在雌雄同体发育产生的1090个体细胞中，131个细胞在特定的时空内以凋亡而终结，这些细胞凋亡至少受14个基因的调控，其中最重要的是凋亡活化基因Ced-3、Ced-4和凋亡抑制基因Ced-9。它们诱导和调控细胞凋亡的基本机制：Ced-3是具严格底物特异性的半胱氨酸蛋白酶，诱导细胞的特征性形态学和生化学变化。第十七页，共72页。Ced-3能结合Ced-4，后者能结合Ced-9。在活细胞，Ced-9以Ced-4为中介和Ced-3结合成三体复合物，扣押Ced-3使其以无活性的酶原形式存在于细胞内，在凋亡诱导信号的作用下，Ced-9自复合物中解离。其结果是导致Ced-3的活化和细胞凋亡。如Ced-3和Ced-9在人体的类似物分别代两大家族，即caspases家族和Bcl-2家族.第十八页，共72页。人体细胞凋亡要比线虫细胞调亡的机制复杂得多。差别可能在于线粒体在哺乳细胞凋亡中的重要性。哺乳细胞凋亡主要包括两条途径，即死亡受体途径和线粒体途径。它们通过一系列分子和生物化学途径导致两条途径共同的“中央处理器”分子即caspases的活化，并诱导许多细胞核和细胞浆内相关底物的降解。第十九页，共72页。

93年有人发现Ced-3基因与哺乳动物白介素1β转化酶—ICE功能和序列相似，和Ced-3一样，ICE高表达可致成纤维细胞凋亡，之后，许多实验室致力于识别ICE/Ced-3样蛋白，至今已发现14个ICE/Ced-3家族成员（分为三组），其中一些参于细胞凋亡，一些参于细胞因子加工和炎症，为避免命名上混乱，96年专门小组推荐ICE/Ced-3家族成员统一命名天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶，并按先后为序在caspase后加阿拉伯数字表示。第二十页，共72页。

其在凋亡中作用：①灭活细胞凋亡抑制物（如Bcl-2）②水解细胞的蛋白结构，导致细胞解体—凋亡小体；③在凋亡级联反应中水解相关活性蛋白，使该蛋白另具功能等。Caspase的天然抑制剂：病毒性蛋白、p35，抑制蛋白-抑制Caspase活化，凋亡蛋白抑制因子IAP等第二十一页，共72页。（三）细胞凋亡的调控

1、细胞凋亡相关因素

（1）诱导性因素

细胞外诱导因素启动细胞凋亡程序，使细胞趋于死亡①激素与生长因子失衡强烈应激使糖皮质激素分泌，可诱导淋巴细胞凋亡第二十二页，共72页。②理化因素

OFR增加，细胞处氧化应激状态，DNA受损，细胞凋亡③免疫性因素免疫细胞可分泌免疫分子，参于免疫细胞或靶细胞的凋亡④生物因素细菌、病毒及其毒素可诱导细胞凋亡第二十三页，共72页。（2）抑制性因素

某些细胞因子、激素具有抑制细胞凋亡的作用，如IL-2、NGF、ACTH、睾酮、雌激素等可抑制相应的靶细胞凋亡，防止其萎缩。某些二价阳离子（Zn++）药物（苯巴比妥）病毒（EB）、中性氨基酸亦具抑制细胞凋亡作用。第二十四页，共72页。2、细胞凋亡信号转导

凋亡信号转导系统是连接凋亡诱导因素与DNA片段化断裂及最终激活细胞死亡程序，导致细胞结构蛋白降解的中间环节。这个系统的特点是：①多样性：即不同种类的细胞有不同的信号转导系统；第二十五页，共72页。②偶联性：即死亡信号的转导系统与细胞增殖、分化过程中的信号转导系统在某些环节上有交叉；因此同一个信号，在不同条件下既可引起凋亡，也可刺激增殖；③同一性：即不同的凋亡诱导因素可以通过同一信号转导系统触发细胞凋亡。④多途径：即同一凋亡诱导因素可经过多条信号转导途径触发凋亡。第二十六页，共72页。（1）死亡因子介导的细胞凋亡

TNF受体家族至少12个成员，为I型膜蛋白。TNF受体家族中的Fas蛋白（膜受体）可与淋巴细胞表面Fas配体（Fasligand）或抗Fas抗体结合以三聚体形式与邻细胞的fas结合，并诱导受体的三聚化，激活的受体通过与多种具有死亡域的受体连接蛋白结合，形成死亡诱导信号复合体（DISC），同时激活caspase级联反应，诱发细胞凋亡。

TNF被称为死亡因子（deathfactor）,作用的受体被称为死亡受体（DR）。同受体结合后通过些接头蛋白活化caspase导致细胞凋亡第二十七页，共72页。（3）cAMP/PKA信号系统糖皮质激素＋淋巴细胞Ca++/Ca++调蛋白

cAMPPKA细胞凋亡（2）

胞内Ca++信号系统:胞内Ca++(+)Ca++

依赖性谷氨酰胺转移酶活化转录因子细胞凋亡第二十八页，共72页。

（4）神经酰胺介导的细胞凋亡神经酰胺是细胞凋亡信号调控中的第二信使分子，许多诱导和刺激因素能激活细胞膜上神经鞘磷脂酶，引起细胞膜上神经鞘磷脂水解产生神经酰胺。有人用维生素D3处理HL-60白血病细胞后，该细胞出现早期的和可逆的神经鞘磷脂水解，同时伴有神经酰胺升高，随后发生细胞凋亡。第二十九页，共72页。抗肿瘤药物红必霉素可激活神经酰胺合成酶引起神经酰胺升高，诱导细胞凋亡。

许多刺激因子如TNF、Fas、离子射线、IL-1、免疫分子、热休克蛋白、激素、抗癌药（红必霉素、长春碱）和活性氧等能激活神经鞘磷脂产生神经酰胺，诱导多种细胞发生凋亡。

第三十页，共72页。神经酰氨

鞘氨醇

1－磷酸鞘氨醇（SPP)传递增殖信号抗凋亡细胞凋亡水解激酶第三十一页，共72页。（6）PTK信号系统对细胞凋亡起负调控作用，神经、表皮生长因子与其受体结合，激活该系统，促进细胞分化。阻断该途径引起细胞凋亡。（5）二酰甘油/PKC信号系统激活的PKC可引起白血病细胞发生凋亡第三十二页，共72页。（7）p53+基因触发的细胞凋亡

p53在射线所致的、化学损伤的DNA损伤和生存必需因子短缺等触发细胞凋亡过程中起重要作用。也参与病毒感染、细胞癌基因异常表达或某些肿瘤抑制基因产物缺乏所诱发的凋亡。p53可使Bax表达增加，促进凋亡发生第三十三页，共72页。（8）线粒体损伤启动的细胞凋亡

1993年Jacobson等人发现用溴化乙锭除去线粒体DNA，诱导人成纤维细胞凋亡，表明线粒体在细胞凋亡中起重要作用，在细胞凋亡中线粒体功能损伤表现为：线粒体膜通透性增高，内膜的跨膜电位下降，能量合成水平显著降低等，从而启动细胞凋亡。第三十四页，共72页。3、调亡相关基因及调控细胞凋亡是级联式基因表达的结果，已知细胞凋亡相关基因多达数十种，根据其功能不同，分为三大类：①抑制凋亡基因，例如Bcl-2、EIB和IAP；②促进凋亡的基因，例如p53、Fas等；③双向调控基因，例如c-myc、Bclx。正常情况下前二类基因处于动态的平衡，以确保细胞生死有序。目前已发现多种基因编码的产物参与了调亡的发生和调控，研究得较多的是Bcl-2、p53等。第三十五页，共72页。（1）Bcl-2

是B细胞瘤/白血病-2的基因缩写，是讫今研究的最深入、广泛的抑制凋亡基因之一，最早从小鼠B细胞瘤中分离出来，是一种细胞内膜蛋白，主要定位于线粒体、内质网、核膜。至今已相继发现至少20个存在于哺乳动物的Bcl-2同源蛋白。其中，一些属于凋亡抑制蛋白如Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-w、Bcl-G等，一些则具有凋亡诱导活性如Bax、Bak、Bid、Bim、Bik、Bcl-B、Bcl-Xs等。

第三十六页，共72页。Bcl-2家族成员主要包含两大结构域，即位于羧基端的跨膜结构域（TM）和数量不等（1~4个）的Bcl-2同源结构域（Bcl-2homology，BH）。根据结构特点的不同，Bcl-2家族可划分为三个分别以Bcl-2;Bax和BH3-only域蛋白（Bik）为代表的亚类。

第三十七页，共72页。Bax由192氨基酸组成，与Bcl-2的同源性为21%，Bcl-2与Bax在体内可形成异二聚体，但Bax与Bcl-2的作用完全相反，Bax/Bax二聚体在体内过量表达时，可促进细胞凋亡，而Bcl-2的抑制凋亡功能可能通过与Bax形成异二聚体而实现。Bcl-2家族可决定细胞生死存亡。第三十八页，共72页。

Bcl-2高表达可导致肿瘤细胞对射线、抗癌药物的耐受性增强。Bcl-2抗凋亡机制：①直接抗氧化；②抑制线粒体释放促凋亡蛋白质；③抑制凋亡诱导蛋白Bax、Bak的细胞毒作用；④抑制凋亡蛋白酶（caspases）的激活；⑤维持细胞钙稳态。第三十九页，共72页。（2）FasFas基因对细胞凋亡有促进作用，Fas与其配体（Fasl）的相互作用是引起细胞凋亡的主要途径之一。Fas蛋白属于TNF受体家族，Fas与其细胞表面配体Fasl的结合，可诱导酪氨酸激酶活化使多种细胞蛋白的酪氨酸磷酸化，介导DNA裂解。有资料表明外周血T、B细胞中，Bcl-2的表达下降，而Fas表达显著升高，提出Bcl-2具有抑制Fas介导的凋亡作用。第四十页，共72页。（3）p53

因编码53KD蛋白质而得名，在细胞G1期监视细胞基因组的完整性，如DNA遭损伤，p53蛋白可阻止细胞进入细胞周期或与之结合使DNA得到修复，如修复失败则启动细胞凋亡。p53如何使细胞生长停滞在G1期与决定细胞走向死亡有机的结合起关健作用，但p53究竟是如何把此两个功能精确地结合起来，现在还是个谜。第四十一页，共72页。（4）C-myc、Bcl-x

已发现很多原癌基因与细胞凋亡过程有关，如c-fosjunmax、bcr-abl等，c-myc是调控细胞周期的主要基因，是一种转录调节基因，既是可介导细胞增殖的基因，也是可介导细胞凋亡的基因，取决于细胞接受的何种信号及所处的生长环境。研究表明,在缺乏生长因子时c-myc才诱导细胞凋亡，否则其功能仍呈增殖状态。基因表达与其他致癌因素同存时为增殖作用，与其他抑癌条件共存时就导致细胞凋亡。第四十二页，共72页。

Bcl-x，由241氨基酸残基组成，与人Bcl-2基因同源性达74%，其由于mRNA剪切方式不同可产生两种大小不同Bcl—x蛋白，大分子（Bcl-XL）含有Bcl-2的二个同源结构域（BH1和BH2）其功能与Bcl-2相似，可以抑制细胞凋亡；Bcl-x的小分子蛋白（Bcl-Xs）缺少BH1和BH2同源区，其功能与Bcl-2相反，可以促进细胞凋亡，mRNA的剪切加工是Bcl-x产生抑制或促进细胞凋亡的关健控制点。

第四十三页，共72页。４、吞噬细胞对凋亡细胞的吞噬吞噬细胞受体识别凋亡细胞，凋亡细胞有相应标记（１）吞噬细胞凝集素作用吞噬细胞植物凝集素凋亡细胞N-乙酰葡萄糖胺N-乙酰半乳糖半乳糖第四十四页，共72页。（２）血小板反应蛋白(TSP)介导吞噬吞噬细胞分泌的TSP黏附巨噬细胞在凋亡细胞间形成分子桥，介导对凋亡细胞的吞噬（３）磷脂酰丝氨酸受体的作用凋亡细胞膜内层磷脂酰丝氨酸暴露巨噬细胞磷脂酰丝氨酸受体吞噬第四十五页，共72页。三、细胞凋亡的发生机制（一）氧化损伤在细胞凋亡中的作用各种OFR氧化剂破坏机体正常的氧化/还原动态平衡，造成生物大分子核酸、蛋白、脂质）氧化损伤，形成严重氧化应激（oxidfivestress）状态，诱导细胞凋亡氧化应激引起细胞凋亡的可能机制

第四十六页，共72页。1、OFR—DNA损伤—（＋）p53—细胞凋亡2、OFR—DNA损伤NADATP细胞凋亡3、OFR——膜脂质过氧化——细胞凋亡钙内流4、OFR—（+）—Ca++/mg++依赖性核酸内切酶5、氧化应激——NFκB和Ap-1，凋亡相关基因表达——细胞凋亡消耗第四十七页，共72页。（二）钙稳态失衡在细胞凋亡中作用

1、细胞钙失衡可激活Ca++/mg++依赖核酸内切酶，降解DNA。2、钙失衡激活谷氨酰胺转移酶，催化胞内肽链酰基转移，在肽链间形成共价链，细胞骨架交联，有利于凋亡小体形成。第四十八页，共72页。3、激活核转录因子，增加凋亡相关基因转录。4、胞内Ca++—DNA链展开，暴露核小体酶切位点，DNA易被酶切割。第四十九页，共72页。（三）线粒体损伤在细胞凋亡中的作用

线粒体功能改变在细胞凋亡的发生中起关键性作用：抑制线粒体的三羧酸循环或呼吸链功能即可引起细胞凋亡；线粒体内膜通透性可增大，线粒体内膜的跨膜电位下降，能量合成水平显著降低，在细胞核出现凋亡性改变之前，常常先有线粒体跨膜电位的降低。已证明，阻止线粒体的通透性改变（permeabililtytransition，PT）可以防止细胞凋亡。第五十页，共72页。线粒体膜功能和结构上的完整性破坏引起细胞凋亡的可能机制是：线粒体内、外膜之间的通透性转换孔（PTP）是一种蛋白复合物，具有调节线粒体膜通透性作用。正常情况下，绝大多数PTP处于关闭状态。当线粒体跨膜电位在各种凋亡诱导因素作用下降低时PTP开放，导致线粒体膜通透性增大，使细胞凋亡启动因子如：细胞色素C、凋亡蛋白酶激活因子（Apaf）和凋亡诱导因子（AIF）等从线粒体内释放出来，促进细胞凋亡。第五十一页，共72页。Bcl-2具有恢复跨膜电位和调节PTP功能的作用，因而可阻止上述凋亡启动因子从线粒体向外释放，切断了细胞凋亡级联式反应中的关键性环节，所以具有很强的抗细胞凋亡的作用。氧化损伤、钙稳态失衡、线粒体损伤三者在细胞凋亡的发生上既可单独启动，又可联合作用，近来有人把它们合而为一，提出了细胞凋亡的网络假说。第五十二页，共72页。第五十三页，共72页。四、细胞凋亡与疾病

（一）细胞凋亡不足

1、肿瘤在肿瘤的研究与治疗中，人们一直在试图阐明肿瘤细胞是如何接受异常刺激信号而无限增殖的，尽管取得不少成果，发现一系列癌基因和抑癌基因，但至今未取得突破性进展。目前已认识到细胞增殖过度是肿瘤发病的一个途径，而凋亡受抑、细胞死亡不足是肿瘤发病的另一途径，结果导致第五十四页，共72页。病变组织内肿瘤细胞存活延长，使群体细胞内存活与死亡的平衡破坏，许多肿瘤组织中Bcl-2基因表达显著高于周围正常组织，提示肿瘤与细胞凋亡减弱有关。如前所述p53基因是目前最受关注的抑癌基因，作为转录调节蛋白，p53即上调细胞凋亡的促进因子Bax，又能抑制细胞周期的进展，并修复损伤的DNA。

第五十五页，共72页。许多应激信号如DNA损伤、端粒磨损（telemereattrition）、癌基因活化和低氧（hypoxia）等广泛存在于癌症的发生和发展包括肿瘤细胞的侵袭和转移过程中，而这些信号都能活化p53基因，p53基因作为防止潜的在恶性细胞生长和存活的应激反应信号途径中枢，在防止肿瘤发生机制中发挥关键作用。当p53基因突变或缺失时，肿癌发生发展明显增高。第五十六页，共72页。2、自身免疫病正常情况下，免疫系统在发育过程中可将针对自身抗原的免疫细胞以细胞凋亡方式有效清除，免疫系统对自身成份不发生免疫应答。而自身免疫病则是机体产生抗自身抗体或致敏淋巴细胞，对自身抗原攻击造成组织器官损伤。1994年mountz等提出自身免疫病可能同细胞凋亡有关。第五十七页，共72页。可能与免疫系统在发育过程中未能将针对自身抗原的免疫细胞以凋亡的方式有效清除有关。目前认为类风关、SLE等都同细胞凋亡有关。糖皮质激素治疗自身免疫病可能机制就是诱导异常存活的自身免疫性T细胞凋亡。第五十八页，共72页。（二）细胞凋亡过度

1、心血管疾病近年来研究发现越来越多的心血管疾病的发生发展与细胞凋亡有关。（1）心肌缺血——再灌流损伤与细胞凋亡第五十九页，共72页。有学者将离体大鼠心肌细胞置无氧的培养环境中，发现其在12小时后细胞出现凋亡，同时伴有Fas抗原mRNA表达的增加，而对照组成纤维细胞在72小时后的仍然无凋亡，Itoh等观察19例急性心梗者心肌细胞证实：心肌细胞除坏死外还存在凋亡，缺血早期以凋亡为主，晚期以坏死为主，梗死区周边细胞凋亡为主，中央以坏死为主，急性严重心梗以坏死为主，慢性轻度则发生细胞凋亡。第六十页，共72页。缺血——再灌注损伤引起细胞凋亡机制①可能同氧化应激有关（因SOD可减轻凋亡）②缺血缺氧使Fas受体上调，（FasL（配体）与受体反应促进凋亡）

③缺O2增加p53基因转录细胞凋亡第六十一页，共72页。（2）心衰

氧化应激

负荷增加

细胞因子

缺血缺氧

诱导心肌细胞凋亡

细胞数量减少

心衰发生发展第六十二页，共72页。2、神经原退行性疾病阿尔茨海默病（AD）帕金森氏病特定神经原进行性丧失AD可能机制：氧化应激（OFR）神经原钙内流（+）相关基因β淀粉样蛋白神经原凋亡临床用尼莫地平（钙拮抗）及抗氧化剂（VitE）治疗。第六十三页，共72页。3、病毒感染HIV感染的AIDS其关键发病机制为CD4+淋巴细胞发生凋亡，数量减少，导致免疫功能缺陷。（1）糖蛋白120（gP120）gP120与CD4+细胞上该蛋白受体结合——细胞凋亡（2）合胞体形成

CD4+细胞形成合胞体——凋亡第六十四页，共72页。（3）Fas基因表达上调提高CD4+细胞对Fas介导的敏感性（4）T细胞激活激活的CD4+淋巴细胞，