多肽合成演绎

多肽合成演绎各位朋友，各位同行，各位多肽爱好者：如果您有时间或条件的话，请您查阅下面的两篇文献：T.Curtius,J.Pract.Chem.24,239(1881);E.FischerandE.Forneau,Ber.Dtsch.Chem.Ges,34,2868(1901)。由于条件所限，我没有查到这两篇文献，具体内容不清楚。但是，固相多肽合成的创始人，诺贝尔化学奖得主梅菲尔德(BruceMerrifield)先生在他的一片文章中说：如果不首先对Curtius和Fischer两位鼻祖级大师表示最崇高的敬意的话，我们是无法开始谈论多肽化学的。1881年，Curtius先生合成了一条保护肽(protectedpeptide)，这应该被认为是人类在蛋白质合成领域内的第一次成功的尝试，推测由于当时化学科学的发展现状所限制，Curtius先生没有办法将氨基保护基团脱除下来，被迫停留在保护肽状态。设想一下，如果我们想合成丙氨酰甘氨酸二肽(Ala-Gly)，这个二肽的结构式见下图：丙彊酸¥ 丫甘氨麽2HN—D—t>-HN—(Wi—GH首先应该考虑将丙氨酸的氨基和甘氨酸的羧基进行保护，使丙氨酸的羧基和甘氨酸的氨基游离，这样才能使他们定向缩合。通过下面的反应，分别得到N-苯甲酰丙氨酸和甘氨酸苄酯，在1881年应该是可以的：这两种氨基酸衍生物均可在有机溶剂中溶解，可以通过下面的反应得到保护二肽，即N-苯甲酰(N-丙氨酰)-甘氨酸苄酯:苹甲旣用富瑕00甲酰(N-丙氨酰)-甘氨酸苄酯:苹甲旣用富瑕00卜"―hu_cJ—oh4-fcIjo甘京绘电SjHkl~~C—―0-U■裁甲哉-4丙菽职E筑瑕卞审000Hw—J—HW—CJ—OH.-/4童甲歆用富展亀下面的任务应该是脱除苯甲酰和苄酯两个基团而得到游离的二肽产物，皂化除去苄酯在当时应该能够办到，但是两个酰胺键的键能过分接近，想选择性脱除苯甲酰基团几乎无法实现，Curtius先生所遇到的困难可能就在此处，这也限制了整个蛋白质合成研究领域的进一步发展。寻找一个可以选择性脱除的氨基保护基团是解决蛋白质合成的关键，可以想象，以后的二十年里，化学家一致在寻求解决这个问题，并且取得了可喜的进展。1901年，Fischer成功合成了一个游离二肽，我们对他的具体做法还不清楚，但是显然他已经成功的对上述的氨基保护基团进行了选择性脱除。做为人类蛋白质合成的辉煌开端，Fischer的功绩是非常卓越的。在蛋白质组成及结构方面的资料非常缺乏的情况下，他不懈努力，解决了一个一个的问题和困难，他完全可以被称为多肽化学领域的奠基人，也是“多肽”这个术语的发明者。同时，Fischer的预见能力甚至是伟大的，远在二十世纪初叶，他便明确的预见了现在，那就是，蛋白质是可以合成的。可以推测到，Fischer所使用的氨基保护基团及脱除方法并不理想，所以在以后的40余年里，蛋白质或多肽合成技术经历了比其它任何科学都要缓慢的发展过程，基本上没有获得突破。这可能与1914-1918年的第一次世界大战和1939-1945年的第二次世界大战有关，政客们忙于军备竞赛，人类遭受了空前的灾难，除军事科学外，其它科学均遭遇了无情的摧残，但是，我们仍然要感谢那些执著追求的化学科学家。在这40余年里，一个杰出的例外发生在1932年［M.BergmannandL.Zervas,Ber.Dtsch.Chem.Ges.65,1192(1932)］，BergmannandZervas成功地合成出了氯甲酸苄酯(carbobenzoxychloride)，也可以叫做苄氧羰酰氯或苯甲氧甲酰氯，其结构是如下：现在一般称为Z-现在一般称为Z-保护氨基酸，仍然被广泛使用在很多多肽合成的场合。它可以用氢溴酸的这个物质可以与几乎所有的20种氨基酸的碱性水溶液在常温下很容易的反应，高收率地获得可以结晶的N-苄氧羰酰氨基酸，或者叫N-保护氨基酸：氨甲酸节豔 眞荃酸 节幫接册真基酸做醋酸溶液在常温下脱除：

H—HHBr/HOAc^H-O-Br+CftH—HHBr/HOAc^H-O-Br+Cft+2HPJ—C—C—OH也可以用催化氢化的方法在常温下脱除：0000—0—i!—HM—C—[!—OHH=/C/Fd--Q)—C+CO+2HM—C-J—OH这给从碳端逐步延伸肽链的多肽合成方法奠定了坚实的基础，只可惜几年以后，二次世界大战开始了，多肽合成的研究工作又一次落入了低谷。到了1950年，可以认为多肽合成技术已经迅速发展为一门成熟的科学，各种合成方法被设计出来，几乎所有的小分子多肽均可以被合成。这得益于二战的结束，世界的和平，多肽化学迎来了它的鼎盛时代。就像前几年，各个大学都要建立以基因研究为主要内容的分子生物学实验室，否则将视为落后一样，在全球范围内大批的多肽合成实验室被很快建立了起来，一个大学或者研究所，一旦建设了多肽合成实验室，则被视为尖端科学的象征。多肽合成方法的研究工作可谓轰轰烈烈，突飞猛进。如前所述，要合成一个多肽，可以将第一个氨基酸的羧基用酯来保护，比如甲酯或乙酯，第二个氨基酸的氨基用苄氧羰酰基保护，就可以定向所和，完成一个肽键即酰胺键的形成，再将苄氧羰酰基氢解或酸解脱除，使氨基游离出来，获得了一个碳端酯化保护而氮端氨基游离的二肽，再与第三个氮保护氨基酸缩合，如此反复，实际上可以合成我们期望的各种多肽，最后再皂化脱去碳端的酯基就得到了游离多肽，下面是一个三肽(Phe-Ala-Val)合成的具体过程：N-卡苗聂H丙迴股N-卡苗聂H丙迴股DH用HPLC来纯化，可以获得高纯度的保护二肽，当然这需要时间，接下来就是用酸解或氢解的方法脱去苄氧羰酰基：0 D《j—S0 D《j—S—0—!— H—D—<Q)—D+D0.+.HFd—I紀端毎泵曲誤的二脱霜0 CG—H—HN—D——「—'■-■-C!L同样，您需要用HPLC来纯化，可以获得高纯度的二肽酯，再耦链下一个N-保护氨基酸:DODDHN-O-I0H+DODDHN-O-I0H+出N—L也节较瑕朋菽再更最0]気端込总酋誤的二駄留：10i_HN—C—E—U纯化后获得保护三肽，重复脱保护及纯化步骤可以获得氮端氨基游离的三肽酯，皂化脱除酯基，再纯化获得游离三肽：苯丙氨酰-丙氨酰-缬氨酸。上述的耦链方法有很多，最早采用的是Curtius发明的叠氮酸耦链法(acidazidecouplingmethod)，这个方法虽然很慢，有时需要数天才能完成一个肽键的合成，但是被目前认为是对氨基酸构象损害最少的方法，可以认为没有消旋发生，一般是先将氨基酸酯化，再保护氨基，将N-保护氨基酸酯进行肼解，可得到N-保护氨基酸酰肼，在醋酸存在下用亚硝酸钠处理可以很容易得得到N-保护氨基酸叠氮酸，叠氮作为离去基团可以使氨基酸的羰基碳原子正电性增强，游离氨基作为亲核试剂进攻羰基碳，亲核反应由此发生，肽键形成：N-卡申畏N-卡申畏U求丙过檻己體卡弟毁u求丙过檢ateiD DC-J--Hhk-O—J—HhHNH.® 7眼节割接it萃丙察嚴脅氮眼节割接it萃丙察嚴脅氮| HOAtl NaNQr叠氮耦链法肽键生成机理如下：这个方法不理想的有两点，一个是成键速度肽慢，二是最后释放的叠氮会使人休克，用于大批量合成，爆炸的危险性很大。而Fischer采用的是酰氯法(acidchloridecouplingmethod)，前面已经讲过，这个方法的优点是成键速度非常快，有时只需要几分钟就可完成一个氨基酸的耦链，由于在常温下反应剧烈，故常常要在低温下进行，主要的一个缺陷是对氨基酸构象的损害：HEtBH□H00 CHEtBH□H00 C=汕2杂世=汕3杂化D-型HQC汕3杂化L_型HCCfl渡态当X为CI时，CI的离去性很强，夺取与羰基碳之间的成键电子以CI-离子的形式离去，可以造成羰基碳原子成为正离子，由于正碳离子的拉电子作用使a-碳上的氢更为活波，在多肽合成的碱性环境下，a-氢可能会被碱可逆性捕捉使a-碳成为一个负碳离子，产生了a-碳与羰基碳之间的烯式结构，使a-碳原子由原来的sp3立体杂化变为sp2平面杂化，当质子H+再次回到a-碳上形成sp3立体杂化时，从a-碳的两面进攻的几率是相等的，所以，每次将会造成一半氨基酸的构型改变。这是困扰多肽合成至今并没有得到彻底解决的问题。所以，温和的羧基活化方法是多肽合成健康发展的关键。很多化学家包括Wieland、Biossonnas、Kenner、Anderson等等，.对混合酸酐(mixedanhydridescouplingmethod)耦链法进行了深入的研究，由于混合酸酐的活性比酰氯要低一些，对于保护氨基酸的构象改善了许多，这对Curtius和Fischer的耦链方法是一个有益的补充。至今，混合酸酐耦链法在许多小分子多肽合成中仍然被广泛采用，包括氯甲酸乙酯、氯甲酸异丁酯几乎在同一时间，活波酯(activeester)被证明是一个很好的耦链试剂，包括苯硫基酯(thiophenylester)[LiebigsAnn.Chem.573,99(1951)];氰甲基酯(cyanomethylester)[Helv,Chim.Acta38,83(1955)];硝基苯酯(nitrophenylesters)[Nature(London)175,685(1955)];还有后来的各种卤代苯酯(halogenatedphenylesters)[J.Am.Chem.Soc.89,183(1967)]。而后来由Sheehan's小组开发的碳二亚胺(DCC,carbodiimides)对于用活波酯来构成肽键则是一个最为主要的进步[J.Am.Chem.Soc.77，1067(1955)]：这个方法的最好之处在于N-保护氨基酸对硝基苯酯中的离去基团，即硝基苯的离去活性远远低于酰氯或混合酸酐，一般情况下它不会离去而使羰基碳成为正离子，而以四面体的方式接受作为亲核试剂的氨基进攻形成肽键，这样就有效抑制了消旋反应。以DCC法来形成活波酯是目前认为消旋反应最少的方法，仍然被广泛使用在各种液相或固相多肽合成中。由于苄氧羰酰基团(benzyloxycarbonylfunction)作为氨基保护基团在脱除时要使用氢溴酸、氢氟酸或催化氢化，脱除条件仍然不理想，使多肽合成成为一项非常繁琐的工作。1957年，Carpino报道了对酸更不稳定的氨基保护基团：叔丁氧羰酰基团(tert-butyloxycarbonylgroup)，间称Boc基团，它可以用25%的三氟乙酸的二氯甲烷溶液在20分钟左右于室温下脱除。同时还有McKay、Albertson、Anderson、McGregor、Zervaslaboratory、Iselin等人均在1957年报道了对酸非常不稳定的各种氨基酸保护基团(veryacid-labilegroups)，如硝基苯硫基(nitrophenylsulfenylgroup)、联苯异氧羰酰基类(biphenylisopropyloxycarbonylderivatives)。在这一时期，三功能团氨基酸(trifunctionalaminoacid)的侧链保护(Side-chainprotection)及保护基团的选择性脱除方法的研究工作也取得了明显的成绩。同时，对于保护氨基酸在活化时的部分外消旋问题进行了大量的研究，幸运的是结果发现Na保护氨基酸在逐步延伸的多肽合成过程中，如果用活波酯法进行耦链，对消旋反应有良好的抑制作用。可以说，1950年以后，多肽合成的辉煌时期已经到来，多肽化学家可以随心所欲地合成他们所想合成的各种生物活性多肽，包括激素、抗生素、生长激素等等。一个划时代的成就出现在1953年，VincentduVigneaud和他的同时第一次很顺利的合成了一种多肽激素(peptidehormone)，催产素(oxytocin)。很快，各种振奋人心的成果不断出现，比如：后叶加压素(vasopressin),短杆菌肽(gramicidinS),a-,B-促黑激素(melanocyticstimulatinghormone)即a-MSH和p-MSH,以及促肾上腺皮质激素片断(fragmentsofadrenocorticotropin)ACTH等。但是，多肽合成仍然是一个非常繁琐的过程，如前所述，耦链反应可能只需要几个小时，耦链完成后对产物的分离纯化工作则可能需要几天，然后是脱保护反应，时间也很短，但接下来还是需要几天来纯化产物，这样才能使肽链延伸一个氨基酸，然后继续进行耦链---纯化---脱保护---纯化再使肽链延伸一个氨基酸，可想而知，一个长肽的合成就成为一个规模浩大的工程。1954年，上帝将一个天才科学家派到了多肽合成领域，他就是梅菲尔德先生。他当时的课题是研究一些五肽和七肽生长激素，他所在的实验室条件很好，也有很多小分子多肽合成的方法，梅菲尔德先生很快掌握了这些方法并且合成了他所需要的多肽，完成了他的研究工作。但是，他深深的感觉到多肽合成实在是太麻烦了，常常要花几个月时间才能完成合成工作，而且收率非常低。就这样，他的研究工作持续了好几年。1959年，梅菲尔德先认为一个新的多肽合成方法是必须的。不久，一个划时代的奇思妙想产生了，那就是固相多肽合成(solid-phasepeptidesynthesis)，而且他坚信这个方法可以使多肽合成变得极为简单和快速，他断定，这种方法不仅可以合成小分子多肽，对于那些超过10个氨基酸残基的多肽也能够合成，他甚至预见到可以通过全自动控制进行多肽合成。但他并没有预见到可以合成一个大分子的酶或蛋白质。当然也没有预见到在后来的十几年里发现了大量的生物活性多肽，还有固相多肽合成在生物活性蛋白的化学合成以及活性机理研究方面的角色。当然，多重同步合成以及肽库的合成更是出乎他的意料。1963年，梅菲尔德先生的固相多肽合成技术成果问世，在当时看来，这只是对原有多肽合成技术的改进，使原来麻烦大大减少，多肽合成的速度得以加快，似乎没有什么革命性的突破。当时的诺贝尔奖评审专家无法判断这个技术对蛋白质科学和生命科学的影响有多大，更没有想到固相有机化学、组合肽库、组合化学从此诞生。所以20年后的1983年，才将诺贝尔奖颁发给了梅