食品中志贺氏菌的检验

食品中志贺氏菌的检验第1页/共66页志贺氏菌的检验一、实验目的了解志贺氏菌生物学特性及原理掌握志贺氏菌检验方法

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检验志贺氏菌的方法很多，但食品卫生微生物检验具有法规性，检验必须采用国家标准规定的方法。近年来发展了许多快速检验的新方法，如技术等。我们下面介绍的方法即是国家标准规定的方法。要弄清检验原理，首先需要了解志贺氏菌的生物学特性。第3页/共66页志贺氏菌的检验二、志贺氏菌的生物学特性1、形态与染色：革兰氏阴性无芽胞杆菌，无荚膜，无鞭毛，不运动，有菌毛。革兰氏阴性鲍氏志贺菌第4页/共66页志贺氏菌的菌毛第5页/共66页志贺氏菌扫描电镜照片第6页/共66页志贺氏菌扫描电镜照片第7页/共66页志贺氏菌的透射电镜照片第8页/共66页二、志贺氏菌的生物学特性2、志贺氏菌的培养特性：需氧或兼性厌氧。营养要求不高，能在普通培养基上生长，最适温度为37℃，最适pH为6.4-7.8。37℃培养18-24小时后菌落呈圆形、微凸、光滑湿润、无色、半透明、边缘整齐，直径约2mm，宋内氏菌菌落一般较大，较不透明，并常出现扁平的粗糙型菌落。在液体培养基中呈均匀浑浊生长，一般不形成沉淀，无菌膜形成。第9页/共66页菌落形态学关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。第10页/共66页弗氏志贺氏菌的菌落特征第11页/共66页

宋内志贺菌乳糖迟发酵菌株在麦康凯平板上的菌落特征第12页/共66页第13页/共66页第14页/共66页第15页/共66页第16页/共66页第17页/共66页第18页/共66页细菌在肉汤培养基中的生长第19页/共66页二、志贺氏菌的生物学特性3、志贺氏菌的生化特性：本菌属都能分解葡萄糖，产酸不产气。大多不发酵乳糖，仅宋内氏菌迟缓发酵乳糖。靛基质产生不定，甲基红阳性，VP试验阴性，不分解尿素，不产生H2S。与肠杆菌科各属细菌相比较，志贺氏菌的主要鉴别特征为不运动，对各种糖的利用能力较差，并且在含糖的培养基内一般不形成可见气体。根据生化反应可进行初步分类。第20页/共66页不发酵乳糖和发酵乳糖菌落第21页/共66页二、志贺氏菌的生物学特性4、志贺氏菌的抗原构造与分型：志贺氏菌属细菌的抗原结构由菌体抗原（O）及表面抗原（K）组成。主要抗原有三种：型特异性抗原、群特异性抗原、表面抗原（K抗原）。根据抗原构造的不同，按最新国际分类法，将本属细菌分为四个群、39个血清型（包括亚型）附：志贺氏菌抗原分类。第22页/共66页附:志贺氏菌抗原分类

抗原构造与分型：志贺氏菌属细菌的抗原结构由菌体抗原（O）及表面抗原（K）组成。主要抗原有三种：型特异性抗原：型多糖抗原为菌体抗原的一种，是光滑型菌株所含有的重要抗原。当菌株变为粗糙型时，此抗原也常随之消失，各菌型所含的型抗原不同，可用于区别菌种的型别。群特异性抗原：为光滑型菌株的次要抗原，也是菌体抗原的一种。特异性较低，常在数种近似的菌内出现。在福氏菌株中，由于所含群抗原不同，可将某些菌型分为多种亚型，如福氏菌2型，根据群抗原不同，可分成2a、2b两个亚型。表面抗原（K抗原）：在新分离的某些菌株菌体表面含有此种抗原。不耐热，加热100℃1小时即被破坏。具有此种抗原的菌株，可阻止菌体抗原与相应免疫血清发生凝集。第23页/共66页志贺氏菌属的四个群

根据抗原构造的不同，按最新国际分类法，将本属细菌分为四个群、39个血清型（包括亚型）A群：也称志贺氏菌群，有10个血清型。不发酵甘露醇，无鸟氨酸脱羧酶，与其他各群细菌无血清学联系。B群：也称福氏菌群，已有13个血清型（包括亚型和变种）。最近又发现3个亚型（1c、4c、5b）。发酵甘露醇，无鸟氨酸脱羧酶。抗原结构较复杂，各型间有交叉凝集。每一福氏菌型具有二种抗原，即型特异性抗原和群抗原，前者只存在于同型菌株中，后者有许多种，存在于福氏各菌型中。例如福氏1b型除含有1型特异性抗原外，尚含有4、6群抗原。第24页/共66页C群：也称鲍氏菌群，有15个血清型，分解甘露醇，无鸟氨酸脱羧酶。各型内无交叉凝集。D群：也称宋内氏菌群，仅有一个血清型。分解甘露醇，有鸟氨酸脱羧酶，迟缓发酵乳糖。有Ⅰ(S相光滑菌落)、Ⅱ相(R粗糙菌落)之分。第25页/共66页

福氏志贺菌在HE琼脂平板上的菌落特征蓝绿色大肠埃希菌红色较大第26页/共66页二、志贺氏菌的生物学特性5、志贺氏菌的抵抗力：志贺氏菌属与沙门氏菌属及其他肠道杆菌相比，对理化因素抵抗力较低，对酸较敏感，必须使用含有缓冲剂的培养基。在外界环境中的生存力，以宋内氏最强，福氏菌次之，痢疾志贺氏菌最弱。一般在潮湿土壤中能存活34天，37℃水中存活20天，在粪便内（室温）存活11天。日光直接照射30分钟，56-60℃10分即被杀死，对高温和化学消毒剂很敏感，1%石炭酸中15-30分钟即被杀死，对氯霉素、磺胺类、链霉素敏感，但易产生耐药性。第27页/共66页二、志贺氏菌的生物学特性6、志贺氏菌的变异性：S-R型变异：菌落可由光滑型变为粗糙型，同时常伴有生化反应、抗原构造和致病性的变异。在机体内，尤其在慢性患者和恢复期患者，志贺氏菌可发生变异而失去原来的生化和抗原特性，成为不典型菌株。但其中部分不典型菌株，可通过10%胆汁肉汤等返祖为典型菌株。故在慢性患者或带菌者粪便检查时，对这类菌株要特别注意，必须多次反复检查。因这对传染源的发现及控制有重要意义。第28页/共66页二、志贺氏菌的生物学特性耐药性变异：自从广泛使用抗菌素以来，志贺氏菌的耐药菌株不断增加，给防治工作带来许多困难。国内部分地区报道（1972-1974），志贺氏菌对四环素的耐药率达74%、氯霉素73.6-97%、链霉素84-98%、金霉素75-100%、磺胺类97-100%，可见国内对常用几种抗菌素的耐药率相当高。第29页/共66页二、志贺氏菌的生物学特性毒力变异与其他变异：1963年南斯拉夫Mel氏首先创用依赖链霉素的志贺氏菌株（依链Sd株）口服预防痢疾。Sd株是一株必须有链霉素存在下才能生长的菌株，其毒力减弱但仍保持免疫原性。美国以天然变异无毒株与大肠杆菌杂交而获得的MH株制成疫苗，其免疫效果和稳定性均较Sd株差。我国正大力利用变异方法通过动物和药物处理等寻找安全有效可供口服的痢疾杆菌活菌苗，并已取得初步成效。第30页/共66页二、志贺氏菌的生物学特性7、志贺氏菌的致病性志贺氏菌引起的细菌性痢疾，主要通过消化道途径传播。根据宿主的健康状况和年龄，只需少量病菌（至少为10个细胞）进入，就有可能致病。致病因素：志贺氏菌的致病作用，主要是侵袭力、菌体内毒素、个别菌株能产生外毒素。第31页/共66页二、志贺氏菌的生物学特性侵袭力：志贺氏菌进入大肠后，由于菌毛的作用粘附于大肠粘膜的上皮细胞上，继而进入上皮细胞并在内繁殖，扩散至邻近细胞及上皮下层。由于毒素的作用，上皮细胞死亡，粘膜下发炎，并有毛细血管血栓形成以至坏死、脱落，形成溃疡。志贺氏菌一般不侵犯其他组织，偶尔可引起败血症。目前认为不论是产生外毒素的还是只有内毒素的志贺氏菌，必须侵入肠壁才能致病。因此，对粘膜组织的侵袭力是决定致病力的主要因素。第32页/共66页二、志贺氏菌的生物学特性内毒素：志贺氏菌属中各菌株都有强烈的内毒素，作用于肠壁，使通透性增高，从而促进毒素的吸收。继而作用于中枢神经系统及心血管系统，引起临床上一系列毒血症症状，如发热、神志障碍，甚至中毒性休克。毒素破坏粘膜，形成炎症、溃疡，呈现典型的痢疾脓血便。毒素作用于肠壁植物神经，使肠道功能紊乱，肠蠕动共济失调和痉挛，尤其直肠括约肌最明显，因而发生腹痛、里急后重等症状。第33页/共66页二、志贺氏菌的生物学特性外毒素：痢疾志贺氏菌1型及部分2型（斯密兹痢疾杆菌）菌株能产生强烈的外毒素。为蛋白质，不耐热，75-80℃1小时即可破坏。其作用是使肠粘膜通透性增加，并导致血管内皮细胞损害。外毒素经甲醛或紫外线处理可脱毒成类毒素，能刺激机体产生相应的抗毒素。一般认为具有外毒素的志贺氏菌引起的痢疾比较严重。第34页/共66页二、志贺氏菌的生物学特性志贺氏菌引起的细菌性痢疾可分为两类:A、急性细菌性痢疾：又分急性典型、急性非典型、急性中毒性菌痢三型。B、慢性细菌性痢疾：又分慢性迁延型、慢性隐伏型、慢性急性发作型三型。

第35页/共66页附:志贺氏菌引起的细菌性痢疾分类

志贺氏菌引起的细菌性痢疾可分为两类6型:A、急性细菌性痢疾：又分急性典型、急性非典型、急性中毒性菌痢三型。急性典型菌痢症状典型，有腹痛腹泻、脓血粘便、里急后重、发热等症状。各型菌都可引起，以志贺氏菌引起的较重，宋内氏菌引起的较轻。经治疗，预后良好。如治疗不彻底，可转为慢性。急性非典型菌痢症状不典型，易诊断错误延误治疗，常导致带菌或慢性发展。急性中毒性菌痢小儿多见，各型菌都可发生。中毒性菌痢一系列的病理生理变化，主要是内毒素造成机体微循环障碍的结果。导致内脏淤血、周围循环衰竭（休克），主要功能器官灌注不足，发生心力衰竭、脑水肿，急性肾功能衰竭。严重微循环障碍，再加上内毒素损伤血管内皮细胞、激活凝血因子等，而发生弥漫性血管内凝血（DIC）。第36页/共66页附:志贺氏菌引起的细菌性痢疾分类B、慢性细菌性痢疾：又分慢性迁延型、慢性隐伏型、慢性急性发作型三型。慢性迁延型，通常由急性菌痢治疗不彻底等引起。病程超过2个月，时愈时发，大便培养阳性率低。在有临床症状时为急性发作型，该型往往在半年内有急性菌痢病史。慢性隐伏型菌痢，是在一年内有过菌痢病史，临床症状早已消失，但直肠镜可发现病变或大便培养阳性。第37页/共66页附:志贺氏菌引起的细菌性痢疾分类慢性急性发作型，有急性菌痢史，常因饮食不当、受凉、劳累等而激起急性发作，但症状较急性期轻。免疫性：病后有一定的免疫力，但免疫期短，也不稳定。第38页/共66页三、志贺氏菌的检验1、增菌

称取检样25g，加入装有225mLGN增菌液的500mL广口瓶内，固体食品用均质器以8000-10000r/min打碎1min，或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品用金属匙或玻璃棒研磨使其乳化，于36℃培养6-8h。培养时间视细菌生长情况而定，当培养液出现轻微混浊时即应中止培养。第39页/共66页三、志贺氏菌的检验2、分离和初步生化试验

取增菌液1环，划线接种于HE琼脂平板或SS琼脂平板1个；另取1环划线接种于麦康凯琼脂平板和伊红美蓝琼脂平板各1个，于36℃培养18-24h。志贺氏菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。第40页/共66页HE琼脂平板原理及照片发酵乳糖的某种肠杆菌。酸碱指示剂为溴麝香草酚蓝发酵乳糖产酸使溴麝香草酚蓝变为黄色第41页/共66页HE琼脂平板原理及照片不发酵乳糖的某种肠道菌，而且产生硫化氢，可能是沙门氏菌不分解乳糖的菌株分解牛肉膏蛋白胨产碱,使溴麝香草酚蓝变为蓝绿色或蓝色,菌落也变为蓝绿色或蓝色第42页/共66页HE琼脂平板原理及照片不发酵乳糖的肠道菌，可能就是志贺氏菌。

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SS平板原理及照片

大肠杆菌或者别的发酵乳糖的肠杆菌

酸硷指示剂为中性红,配方中还有煌绿第44页/共66页SS平板原理及照片是沙门氏菌。有黑色中心。如果没有黑色中心，可能是志贺氏菌第45页/共66页麦康凯琼脂平板照片

乳糖阴性乳糖阳性培养基中加有乳糖结晶紫水溶液中性红水溶液第46页/共66页EMB平板照片及原理原理：伊红美蓝琼脂平板含伊红和美蓝染料，在此亦作为指示剂。大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，故可染上酸性染料伊红，又因伊红与美兰结合（该两种染料即结合成复合物）使大肠菌群产生带核心的、有金属光泽的深紫色的（龙胆紫的紫色）阳性菌落，从菌落表面的反射光中还可看到绿色金属闪光。在伊红美兰平板上的典型菌落呈紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常有金属光泽。由于药物影响，亦呈现紫色、粉紫、中心灰紫、无黑心、湿润等，常为大肠杆菌，均应注意挑选。第47页/共66页

伊红美蓝琼脂平板照片第48页/共66页伊红美蓝琼脂平板照片第49页/共66页2、分离和初步生化试验

挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体各1管。一般应多挑几个菌落，以防遗漏，经36℃培养18-24h，分别观察结果。第50页/共66页附:葡萄糖半固体原理及结果。第51页/共66页葡萄糖半固体原理及结果第52页/共66页附:三糖铁琼脂现象及原理分析三糖铁（TSI）琼脂试验的原理试验方法：以接种针挑取待试菌可疑菌落或纯培养物，穿刺接种并涂布于斜面，置36±1℃培养18-24h，观察结果。第53页/共66页附:三糖铁琼脂现象及原理分析三糖铁琼脂(TSI)成分：

蛋白胨20.0g;牛肉膏3.0g;乳糖10.0g;蔗糖10.0g;葡萄糖1.0g;硫酸亚铁铵(含6个结晶水)0.5g;酚红0.025g或5g/L溶液5mL;氯化钠5.0g;硫代硫酸钠0.5g;琼脂12.0g;蒸馏水1000.0mL

除酚红和琼脂外,将其他成分加入400mL蒸馏水中,搅拌均匀,静置约10min,加热煮沸至完全溶解,调至pH7.4±0.1。另将琼脂加入600mL蒸馏水中,搅拌均匀,静置约10min,加热煮沸至完全溶解。

将上述两溶液混合均匀后,再加入酚红指示剂,混匀,分装试管(12mm×100mm),每管约2～4mL,高压灭菌121℃10min或115℃15min,灭菌后置成高层斜面,呈桔红色。第54页/共66页三糖铁琼脂原理分析：本培养基适合于肠杆菌科的鉴定。用于观察细菌对糖的利用和硫化氢（变黑）的产生。该培养基含有乳糖、蔗糖和葡萄糖的比例为10:10:1，只能利用葡萄糖的细菌，葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。而发酵乳糖的细菌(E.coli)，则产生大量的酸，使整个培养基呈现黄色。如培养基接种后产生黑色沉淀，是因为某些细菌能分解含硫氨基酸，生成硫化氢，硫化氢和培养基中的铁盐反应，生成黑色的硫化亚铁沉淀。第55页/共66页下面照片所示2、3、4，可能是大肠杆菌、沙门氏菌还是志贺氏菌？答案：2－志贺氏菌3－沙门氏菌4－大肠杆菌第56页/共66页(3)下述培养物可以弃去：

a.在三糖铁琼脂斜面上呈蔓延生长的培养物；(无鞭毛无动力)

b.在18-24h内发酵乳糖、蔗糖的培养物(不发酵乳糖,仅宋内志贺氏菌迟缓发酵乳糖)；

c.不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的培养物；(分解葡萄糖,兼性厌氧)

d.产气的培养物；(分解葡萄糖产酸不产气)

e.有动力的培养物；(无动力)

f.产生硫化氢的培养物。(不产生硫化氢)

凡是乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气(福氏志贺氏菌6型可产生少量气体)，无动力的菌株，可做血清学分型和进一步的生化试验。第57页/共66页三、血清学分型挑取三糖铁琼脂上的培养物，做玻片凝集试验。先用4种志贺氏菌多价血清检查，如果由于K抗原的存在而不出现凝集，应将菌液煮沸后再检查；如果呈现凝集，则用A1、A2、B群多价和D群血清分别试验。如系B群福氏志贺氏菌，则用群和型因子血清分别检查。福氏志贺氏菌各型和亚型的型和群抗原见表1。可先用群因子血清检查，再根据群因子血清出现凝集的结果，依次选用型因子血清检查。4种志贺氏菌多价血清不凝集的菌株，可用鲍氏多价1、2、3分别检查，并进一步用1-15各型因子血清检查。如果鲍氏多价血清不凝集，可用痢疾志贺氏菌3-12型多价血清及各型因子血清检查。第58页/共66页血清诊断血清:是应用已知的标准菌株,免疫家兔获得.多价(混合)诊断血清:该血清含有两种(或型)以上细菌的相对应性抗体.单价诊断血清:该血清仅含有一种(