实验报告荧光蛋白基因的原核表达

题目：荧光蛋白基因的原核表达。实验目的：学习细菌质粒的提取与检测的原理和方法。学习制备感受态细胞并将质粒导入工程菌的原理和方法。实验原理感受态细胞的制备：将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0°c）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞，细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基一磷酸钙复合物。联合其它的二价金属离子（如Mn、Co）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100〜1000倍。质粒的导入在冰上融化感受态细胞，经过42度短暂热激后，由于细胞膜处于液晶态产生裂缝，外源DNA黏附于细胞表面，而后立即冰浴，促使细胞膜愈合。然后将菌体放入适宜的培养基中培养，以促进细胞的愈合恢复。阳性转化的培养基筛选方法。普通的大肠杆菌难以在含有Kana的LB培养基上存活繁殖，但由于载体质粒含有Kana霉素的抗性基因，所以成功导入载体质粒的大肠杆菌能够在含有Kana的LB培养基上形成菌落，即转化阳性，但是由于成功导入的质粒不一定携带了目的基因，所以可能会出现伪阳性，故需要进行PCR鉴定。实验材料及设备

实验材料：已完成转化的GFP与RFP质粒阳性克隆DH5a大肠杆菌。冰冻的感受态DH5a大肠杆菌。实验仪器：恒温摇床，高压灭菌锅，超净工作台，10、100、1000^L取液器各一支，台式高速离心机，制冰机，漩涡器；实验试剂：(1)质粒的转化与转化导入实验试剂：(1)质粒的转化与转化导入a・溶液I,溶液II,溶液III；卡那霉素(50mg/mL)；抽提液(饱和酚：氯仿：异戊醇=25:24:1)作用：氯仿可使蛋白质变性，有助于液相与有机相的分离。平衡酚密度大，可是DNA在上清中。异戊醇防止抽提液起泡。e・无水乙醇作用：除去DNA水化层，使DNA沉淀。70%乙醇作用：纯化质粒DNA。TE缓冲液或ddH2O作用：溶解DNALB培养液:胰蛋白月东（Tryptone）10g,酵母提取物（Yeastextract）5g,NaCl5g,琼脂（固体培养基）15g，用1NNaOH调pH7・5;实验方法及步骤实验流程图观察分析菌落载体质粒与目的基因连接转化质粒DNA的提取a）将带有质粒的DH5a大肠杆菌接种在液体培养基中（加氨苄青霉素50^g/mL）,37°C培养过夜；b）取培养菌液1.5mL置Eppendorf小管中，10000rpmX2min，弃上清液；c）加入100^L溶液I,漩涡器上充分混匀，在室温下放置10min；d）加入200^L新配制的溶液II,轻轻翻转2~3次，使之混匀，冰上放置5min；e）加入150^L冰冷的溶液III,盖紧后，温和颠倒3-5次使混匀，产生白色絮状物，冰上放置15min；f）10000rpmX5min，取上清液于另一干净的离心管中；g）向上清液中加入等体积（约400^L）酚：氯仿/异戊醇（25：24:1，v/v），振荡混匀，10000rpmX10min，将上清液转移至新的离心管中；h）加入等体积（约370^L）氯仿/异戊醇（24:1），混匀，10000rpmX2min,取上清液于新离心管中；i）向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，-200C放置1h；j）12000rpmX5min，倒去上清液，吸干液体；k）加800^L70%乙醇，离心12000rpmX1min，倒尽上清液，吸水纸吸干液体，室温自然干燥30min，直至变得透明无乙醇味l）加20^LddH2O，混匀使DNA溶解完全，取5^L做电泳检测，剩余的溶液保存备用。转化质粒的导入a）取出感受态细胞DH5a让其在冰上自然解冻，每100^L解冻的感受态细胞加入整管连接产物，混匀后冰浴30min。b）42°C热冲击45秒，立即置于冰浴5min。c）热激法：使用化学试剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA想粘附并在细胞表面形成脱氧核糖酸酶的羟基-磷酸钙复合物。此时，将该体系转移到420C下做短暂的热刺激，细胞膜的液晶结构会发生剧烈运动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收；d）冰浴过程中不要摇动EP管；（使破裂的菌体自然恢复）e）再在感受态细胞混合物中加入0.8mL的LB培养基，于37C摇床中培养1h。目的：使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因；f）涂布于含有kana的LB固定培养基表面，37C培养过夜。实验结果图1表达红色荧光蛋白的BL21图2表达绿色荧光蛋白的BL21图1表达红色荧光蛋白的BL21图2表达绿色荧光蛋白的BL21菌落生长情况:可以看到，在培养基的边缘分别有明显的绿色和红色菌落。绿色荧光蛋白表达大肠杆菌菌落较小，数量较多。大部分菌落都有明显的目的基因表达表型。但仍然可见少量的假阳性菌落。菌落分布不均，可能是倒置培养基过早或菌液过多导致菌液流动。结果讨论与结论：1.实验结论：

通过导入DH5a扩增的质粒，以及用ITPG诱导，我们成功实现了目的荧光蛋白基因在BL21中的大量表达。从菌落外观可以直接看出表达的荧光蛋白。2.讨论一:BL21与DH5a等感受态细菌特点及应用的特征，用处。2.讨论一:BL21与DH5a等感受态细菌特点及应用的特征，（1）DH5a和BL21都可以作为表达宿主。（2）BL21是蛋白酶缺陷株，表达出来的蛋白不会被降解，做蛋白表达是比较适合用的，。BL21生长要比DH5a快，这是他们的又一区别，在高密度发酵BL21表达蛋白时，需要控制它的表达条件，使得高密度且高表达。（3）DH5a复制稳定的特点，所以它是核酸疫苗通常使用的宿主株。DH5a中表达时外源基因的启动子必须被大肠杆菌的RNAPOLYMERASE识别，比较好用的载体有PLPR可诱导的启动子。而带有T7启动子的载体则不能在其中表达，因为识别T7启动子的T7RNAPOLYMERASE在DH5a中没有。对于BL21,已将T7RNAPOLYMERASE的编码基因整合到了菌的基因组上，能识别T7启动子，从而可容纳外源基因在此T7启动子的带动下表达。3.讨论二：IPTG在实验中的作用Lac阻抑物是一种具有4个相同亚基的四级结构蛋白，都有一个与诱导剂集结合的位点。在没有乳糖存在时，lac操纵子处于阻抑状态，LAC阻抑物能与操纵基因O结合，阻抑RNA聚合酶与P序列结合，阻止了转录的路径，从而抑制转录启动。而当有诱导剂（IPTG）存在时，诱导剂可与阻抑蛋白结合，使阻抑蛋白构象发生变化，导致阻抑物从操纵基因O上解离下来，RNA聚合酶不再受阻碍，启动子P开始发生转录，启动反应开始发生转录，启动反应开始发生转录。在这个操纵子体系中，真正的诱导剂是乳糖本身。乳糖进入细胞，经酶催化，转变为半乳糖一即生理上的诱导剂。而在实验中，通常选用IPTG作为诱导剂，IPTG是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。4.讨论三：为什么会出现假阳性，为什么部分菌落的荧光蛋白表达量高于其他菌落。由于导入质粒到DH5a时，没有携带目的基因片段的载体也能使大肠杆菌在卡那霉素中存活，所以经过简单筛选的菌体也可能会被扩