第二十章比色法和分光光度法

第二十章比色法和分光光度法第1页，共57页，2023年，2月20日，星期三20.1概述20.1.1光度分析法的特点20.1.2物质对光的选择性吸收第2页，共57页，2023年，2月20日，星期三20.1.1光度分析法的特点

有色物质颜色的深浅和浓度有关，利用比较溶液颜色深浅来测定含量的分析方法称为比色分析法。目视比色称为比色法；利用分光光度计测试，称为分光光度法。光度分析法特点：(1)具有较高的灵敏度。一般物质可测到10-3~10-6molL-1

(2)有一定的准确度。相对误差为2%~5%(3)操作简便、快速，选择性好，仪器设备简单。(4)应用广泛。第3页，共57页，2023年，2月20日，星期三20.1.2物质对光的选择性吸收

在可见光区(400~760nm)不同波长的光具有不同的颜色。溶液呈现一定的颜色是对光选择性吸收的结果。当一束白光通过一有色溶液时，某些波长的光被溶液吸收，另一些波长的光则透过，溶液的颜色由透过光决定。透射光与吸收光又可组成白光，这两种光称为互补色光。

第4页，共57页，2023年，2月20日，星期三如CuSO4溶液呈蓝色就是吸收了白光中黄光。第5页，共57页，2023年，2月20日，星期三

如果将不同波长的光通过一固定浓度和厚度的有色溶液，测量每一波长下有色溶液对光的吸收程度（吸光度A），然后以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得一曲线，称吸收曲线。第6页，共57页，2023年，2月20日，星期三图中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三条曲线，代表同一被测物质含量由高到低的吸收曲线。邻二氮杂菲亚铁溶液的吸收曲线第7页，共57页，2023年，2月20日，星期三（1）同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长λmax（2）不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似，λmax不变。而对于不同物质，它们的吸收曲线形状和λmax则不同。（3）在λmax处吸光度随浓度变化的幅度最大，所以测定最灵敏。吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。第8页，共57页，2023年，2月20日，星期三20.2光吸收的基本吸收定律20.2.1朗伯-比尔定律20.2.2吸光度的加和性20.2.3对朗伯-比尔定律的偏离第9页，共57页，2023年，2月20日，星期三20.2.1朗伯-比尔定律

当一束平行的单色光通过均匀、透明的有色溶液时，如溶液的浓度越大、液层厚度越大，则光强度的减弱越显著。I0：入射光强度；It：透射光强度

“A”称为吸光度，量纲为1。溶液对光的吸收程度越大，则透射光强度越小，A越大。第10页，共57页，2023年，2月20日，星期三吸光度测量中，也用透光度T表示透过光强度越大，T值越大。第11页，共57页，2023年，2月20日，星期三b：液层的厚度cm；c：溶液的浓度g·L-1K：吸光系数

L·g-1·cm-1如“c”的单位：mol·L-1，此时的吸光系数称为摩尔吸光系数k

k：摩尔吸光系数L

·mol-1·

cm-1

式中M为摩尔质量

第12页，共57页，2023年，2月20日，星期三k是吸光物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数。

在温度和波长等条件一定时，k仅与吸收物质本身的性质有关，与待测物浓度无关。

k是吸光物质吸光能力的量度，k值越大，光度法测定该物质的灵敏度越高。由实验结果计算时，常以被测物质的总浓度代替吸光物质的浓度，这样计算的k值实际上是表观摩尔吸光系数。第13页，共57页，2023年，2月20日，星期三

分光光度分析的灵敏度还可以用桑德尔灵敏度S表示。S是指当仪器的检测极限为A=0.001时，单位截面积光程内所能检测出来的吸光物质的最低含量，其单位为μg·cm-2。

S=M/k第14页，共57页，2023年，2月20日，星期三例20-1：已知含Fe2+浓度为1.0mg·L-1的溶液，用邻二氮菲光度法测定铁(Fe2+与邻二氮菲反应，生成橙红色配合物)。使用厚度为2cm的吸收池，在波长510nm处测得吸光度A=0.390。计算该配合物的

摩尔吸光系数。。解：已知铁的相对原子质量为55.85。第15页，共57页，2023年，2月20日，星期三例：用双硫腙光度法测定Pb2+。Pb2+的浓度为0.08mg/50mL，用2cm比色皿在520nm下测得T=53%，求k。解：已知铅的相对原子质量为207.2第16页，共57页，2023年，2月20日，星期三20.2.2吸光度的加和性在含有多组分的体系中，若各组分对同一波长的光都有吸光作用，且各组分的吸光物质彼此不发生作用，则测得的吸光度等于各组分的吸光度之和。

A=A1+A2+…+A3第17页，共57页，2023年，2月20日，星期三20.2.3对朗伯-比尔定律的偏离1.比尔定律的局限性2.非单色入射光引起的偏离

3.由于溶液本身发生化学变化的原因引起的偏离

第18页，共57页，2023年，2月20日，星期三1.比尔定律的局限性

通常在用分光光度法进行分析时，多采用标准工作曲线法。即固定液层厚度、入射光的波长，测定一系列不同浓度标准溶液的吸光度，此时A与c应成直线关系。

在实际工作上，特别是在浓度较高时，常出现标准曲线不为直线，即偏离了朗伯—比尔定律。第19页，共57页，2023年，2月20日，星期三

比尔定律是一个有限制性的定律，它假设入射光为单色光，吸收粒子间没有干扰。因此仅在稀溶液中才适用。在高浓度时，由于吸光物质微粒间相互影响，从而改变了它对光的吸收能力，使吸光度与浓度的线性关系发生偏离。第20页，共57页，2023年，2月20日，星期三2.非单色光引起的偏离比尔定律假设入射光为单色光，但是目前仪器所能提供的入射光不是严格的单色光，是由波长范围较窄的光带组成的复合光。

A=kbc，k在一定波长下是一常数，如入射光不为单色光，则k不为常数，A与c不成直线关系。第21页，共57页，2023年，2月20日，星期三在最大吸收波长附近通常有一个吸收强度相差较小的区域，如入射光在此范围内，因k变化较小，引起的偏离也较小，A与c基本上呈直线关系。

λ

Aλmax第22页，共57页，2023年，2月20日，星期三

3.由于溶液本身发生化学变化

的原因引起的偏离

由于被测物质在溶液中发生缔合、离解或溶剂化、互变异构、配合物的逐级形成等化学因素，造成对比耳定律的偏离。

Cr2O72-+H2O2CrO42-+2H+橙色黄色

应控制条件，使溶液中仅存在Cr2O72-或CrO42-，这样，c与A之间才成直线第23页，共57页，2023年，2月20日，星期三20.3比色法和分光光度法及其仪器20.3.1目视比色法20.3.2分光光度计的基本部件20.3.3常用的几种分光光度计第24页，共57页，2023年，2月20日，星期三20.3.1目视比色法

目视比色法是一种用眼睛辨别溶液颜色的深浅，以确定带测组分含量的方法。常用标准系列法，在一套等体积的比色管中，加入不同体积的标准溶液，分别加入等量显色剂及其它试剂，待测液在同样条件下显色。稀释至刻度，摇匀。比较待测液和标准色阶溶液的颜色深浅，确定待测液的浓度。目视比色法仪器简单，操作简便，但准确度较差。第25页，共57页，2023年，2月20日，星期三20.3.2分光光度计的基本部件

1.光源作用：发出所需波长范围内的连续光谱。要求具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。可见光区常用钨灯、或碘钨灯，波长范围：320~2500nm光源单色器吸收池检测系统读数指示器第26页，共57页，2023年，2月20日，星期三2.单色器

作用：将光源发出的连续光谱分解为单色光。单色器由棱镜和光栅等色散元件及狭缝和透镜组成。

①入射狭缝：光源的光由此进入单色器；②准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束；③色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅；④聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝；⑤出射狭缝。第27页，共57页，2023年，2月20日，星期三3.吸收池作用：用于盛放试样溶液。也叫比色皿。吸收池主要有石英和玻璃两种。在紫外区须采用石英吸收池，可见区一般用玻璃吸收池。吸收池大多是长方形的，一般仪器都配有一套厚度为0.5、1、2、3cm的吸收池。吸收池放置的位置应使透光面垂直于光束方向。第28页，共57页，2023年，2月20日，星期三4.检测系统作用：将光强度转化为电流进行测量。光电转换器对测定波长范围内的光有快速灵敏的响应，产生的电流应与光电转换器上的光强度成正比。常用的光电转换器有硒光电池、光电管。5.读数指示器作用：把光电流或放大的信号以适当的方式显示或记录下来。第29页，共57页，2023年，2月20日，星期三20.3.3常用的几种分光光度计

72型、722型、751型等。第30页，共57页，2023年，2月20日，星期三20.4显色反应及显色条件的选择20.4.1对显色反应的要求20.4.2显色反应条件的选择第31页，共57页，2023年，2月20日，星期三20.4.1对显色反应的要求将待测组分转化为有色化合物的反应叫显色反应。显色反应有配位反应和氧化还原反应。1.灵敏度高因为光度法一般用于测定微量组分含量，故通常选择灵敏度高的显色反应。生成的有色化合物摩尔吸光系数大，灵敏度高，通常k值达104~105，认为灵敏度较高。2.选择性好即显色剂只与一种或少数几种物质反应而显色。3.有色化合物组成固定，化学性质稳定4.显色剂在测定波长处无明显吸收第32页，共57页，2023年，2月20日，星期三20.4.2显色反应条件的选择

1．显色剂的用量

通常显色反应可用下式表示：M(被测离子)+HR(显色剂)MR+H+

从平衡角度看，显色剂过量越多，越有利于有色配合物的形成。但显色剂过量太多，有时会引起副反应，故有一适宜用量，通常由实验确定。

固定其它条件，改变显色剂的浓度，测A，作A~c

R曲线，选择原则：选择曲线上平坦部分

第33页，共57页，2023年，2月20日，星期三吸光度与显色剂用量关系曲线cRcRcRAAA(a)适合进行光度分析(对显色剂浓度控制不严格)(b)只能选择较窄的显色剂浓度范围(c)必须严格控制显色剂浓度。

第34页，共57页，2023年，2月20日，星期三2.酸度

酸度对显色反应的影响是多方面的：H+浓度大，不利于有色配合物的形成；酸度还影响有些显色剂的颜色；某些被测组分与显色剂能形成不同组成的配合物；金属离子在酸度下降时会水解。

适宜的酸度范围由实验确定：固定其它条件，改变pH值测A，作A~pH曲线，选择曲线平坦部分对应的pH值作为测量条件。第35页，共57页，2023年，2月20日，星期三吸光度与pH关系曲线pHA第36页，共57页，2023年，2月20日，星期三3．显色时的温度和时间多数显色反应在室温下能很快进行，有些反应需要加热。多数显色反应须经一定时间才能完成，有些有色物质放置时受到空气和光的作用，颜色会减弱。适宜显色时间可通过实验确定。

第37页，共57页，2023年，2月20日，星期三AtAt(2)(1)(1)随着时间的增加，有色化合物的浓度增大，A增大。反应完成后，A保持不变。(2)有色化合物性质不太稳定，随着放置时间的增加，在日光，空气的的作用下，有色化合物分解，浓度下降，A降低。第38页，共57页，2023年，2月20日，星期三4.溶剂的影响许多有色配合物在水中解离度较大，而在有机溶剂中解离度较小。有些配合物易溶于有机溶剂。5.干扰物质的影响及消除干扰离子本身有颜色或与显色剂作用显色等，都将干扰测定。消除干扰的方法有：(1)加掩蔽剂(2)选择适当的显色条件如通过控制酸度，使干扰离子不作用(3)选择适当的测量条件如波长、参比溶液等(4)分离干扰离子第39页，共57页，2023年，2月20日，星期三20.5分光光度法仪器测量误差及其消除20.5.1入射光波长的选择20.5.2光度计读数范围的选择20.5.3参比溶液的选择20.5.4溶液浓度的测定

第40页，共57页，2023年，2月20日，星期三20.5.1入射光波长的选择

入射光波长应根据吸收光谱曲线选择。1)在一般情况下选择最大吸收波长作为入射光的波长，因此时k

最大，测定的灵敏度高；2)如干扰物在待测物的最大吸收波长处有强烈的吸收，则选择非最大吸收波长作为入射光的波长，这时灵敏度虽有下降，但却消除了干扰。第41页，共57页，2023年，2月20日，星期三曲线A为钴络合物的吸收曲线曲线B为显色剂的吸收曲线吸光度测定条件的选择第42页，共57页，2023年，2月20日，星期三20.5.2光度计读数范围的选择

任何光度计都有一定的测量误差，误差来源于：入射光源不稳定；吸收池玻璃厚薄不均匀；池壁不够平行、表面有水迹、油污或划痕等；光电池不灵敏、疲劳现象及检流计刻度不准等。以上因素造成测量误差的总和，表现为透光度读数误差△T。T与c之间是对数关系，同样的△T对不同浓度造成的△c不同。在不同的吸光度范围内读数，引入的浓度测量误差是不同的，因此必须选择合适的吸光度读数范围。第43页，共57页，2023年，2月20日，星期三根据朗伯-比尔定律：

或求微分：

两式相除：

以有限值表示：

第44页，共57页，2023年，2月20日，星期三浓度的相对误差；T：透光度读数的绝对误差

何时浓度的相对误差最小？

T=0.368或A=0.434时，浓度的相对误差最小。第45页，共57页，2023年，2月20日，星期三

一般分光光度计的T在±0.2%~±1%之间，如果为±0.5%，根据上式计算不同A或T%时浓度的相对误差。如图18-9、表18-29(p351)。T%：10~70A：1.0~0.15，浓度的测量误差较小。而A过高或过低，因读数造成的浓度的相对误差都是很大的。第46页，共57页，2023年，2月20日，星期三

为了减小测量的相对误差可采取如下措施：(1)控制溶液的浓度，如改变试样的称出量或改变稀释度等。(2)如溶液已显色，则可选择合适厚度的比色皿，使吸光度在上述范围内。第47页，共57页，2023年，2月20日，星期三20.5.3参比溶液的选择

参比溶液用来调节仪器的零点，以消除吸收池壁及溶剂等对入射光的反射和吸收带来的影响，使测得的吸光度能真正反映被测物质的含量。选择参比溶液的原则：(1)如果仅所测物质有吸收，显色剂及其它试剂均无吸收，可用纯溶剂作参比，如蒸馏水；(2)如显色剂和其他试剂略有吸收，则应用不含被测组分的试剂溶液（空白溶液）作参比溶液；第48页，共57页，2023年，2月20日，星期三(3)如果试样中其他组分有吸收，但不与显色剂作用，当显色剂无吸收时，可用试样溶液（不加显色剂）作参比；当显色剂也略有吸收，或干扰离子也与显色剂作用且产物有吸收，可在试液中加掩蔽剂，掩蔽待测组分，再加显色剂，以此溶液作参比。第49页，共57页，2023年，2月20日，星期三20.5.4溶液浓度的测定1.工作曲线法配制一系列不同浓度的被测组分的标准溶液，在选定的λmax和最佳操作条件下，测得吸光度，作工作曲线（A~c），为一直线，也叫标准曲线。在完全相同条件下，测得试样溶液的吸光度，从工作曲线上查得相应浓度。第50页，共57页，2023年，2月20日，星期三2.比较法同一波长的光，通过两个厚度相同而浓度不同的溶液，则浓度之比等于吸光度之比。A标=kbc标

A试=kbc试第51页，共57页，2023年，2月20日，星期三