宏基因组测序在感染性疾病病原体检测中的应用

宏基因组测序在感染性疾病病原体检测中的应用李林海;陈丽丹;肖斌;孙朝晖【摘要】感染性疾病的致病因素复杂,临床表现多样.快速、全面、准确地鉴别病原体，是临床医生及时、有针对性地采取治疗措施的前提.传统的病原体检测方法目标单一、耗时长、操作复杂，很难满足当今感染性疾病诊治的要求.宏基因组测序技术克服了多数病原体不能培养的弊端，能够准确高效地获得全部病原体遗传物质信息,直接检测出感染性疾病的病原体，对疑难感染性疾病的诊断具有重要参考价值.本文对宏基因组测序在感染性疾病病原体检测中的最新研究进展和应用进行综述.％Theinfectiousdiseasesarediversiforminclinicalmanifestationduetothecomplexpathogenicfactors.Arapid,comprehensiveandaccurateapproachtoidentifypathogenicagentsistheprerequisiteforclinicianstotakeactivetreatmenttimelyandspecifically.However,traditionaldiagnosticmethodsarelimitedindetectingsmallrange,time-consumingandcomplicatedoperations,whicharenotsuitableforthetreatmentofinfectiousdiseasesatpresent.Themetagenomicsequencingtechnologyisappliedtoobtainthewholegenomesequenceofapathogenwithoutpathogencultureanddirectlydetectthepathogenthatcausestheinfectiousdiseases.Themetagenomicsequencingisavaluableapproachindetectingrareinfectiousdiseases.Inthisstudy,wereviewthelatestresearchprogressandapplicationofmetagenomicsequencingindetectingthepathogensofinfectiousdiseases.【期刊名称】《传染病信息》【年(卷)，期】2018(031)001【总页数】4页(P15-18)【关键词】高通量测序;宏基因组测序;感染性疾病;病原体【作者】李林海;陈丽丹;肖斌;孙朝晖【作者单位】510010,解放军广州总医院检验科;510010,解放军广州总医院检验科;510010,解放军广州总医院检验科;510010,解放军广州总医院检验科【正文语种】中文【中图分类】R37感染性疾病是临床常见疾病之一，多为细菌、病毒和真菌等病原体及其产物所引起的局部或全身性炎症或器官功能障碍，具有较大的危害性和较高的病死率。在快速准确地查明病因的基础上，选择合理的治疗方案，可有效地控制疾病的发生发展。但目前，病原体的常规检测方法存在阳性率低、周期长、对操作人员的技术水平要求比较高等局限。宏基因组测序是指对特定环境样品中的全部病原体基因组进行高通量测序，该方法能够快速、准确、高效地获得整个病原体群体的基因组信息。宏基因组测序不依赖于病原体的分离培养，可以得到环境中丰度较低甚至是痕量病原体的信息，目前该技术已广泛应用于工业生产、食品安全和环境污染防治等各个领域［1-3］。近年来，宏基因组测序越来越多的应用于医学研究及临床诊断领域，如感染类型诊断、抗性基因的鉴定和传染病的防控等［4-9］。本文对感染性疾病的现状、病原体的高通量测序技术概况及宏基因组测序在感染性病原体检测中的应用进行综述，旨在进一步揭示宏基因组测序在感染性疾病中的重要作用与应用价值。1感染性疾病及实验诊断现状目前，全球感染性疾病的发病率有所上升，病原体呈现多样化和复杂化的发展趋势。重症急性呼吸综合征、新型冠状病毒感染、新变异型克雅病、H7N9禽流感等新发感染性疾病不断出现［9］。而HIV、多重或广谱耐药的结核分枝杆菌、沙眼支原体等经典感染性疾病病原体又死灰复燃或出现新的致病特征。各种新发和再发的感染性疾病、不易发现的多重感染以及不明病因的发热等，都给人类健康带来了巨大的威胁，因此，临床上对感染性疾病诊断的准确性和时效性提出了更高的要求。在感染性疾病领域中，获得病原体的活体（对于细菌、真菌、病毒而言，主要是培养阳性），是感染性疾病诊断的金标准，但病原体的体外培养耗时普遍较长，操作步骤繁琐，且绝大多数病原体不可培养；免疫学方法（如补体结合试验、中和试验、酶联免疫吸附实验、免疫荧光法和酶标斑点免疫法等）操作简单，但由于病原体种类繁多，已研发的抗原、抗体数量远远不能满足市场需求；PCR检测具有极高的灵敏度和特异性，但无法完成高通量筛查，检出率较低；基因芯片技术只能对已知的病原体基因组进行意向性筛查，而无法检测新的未知病原体［10］。据统计，约70%的感染性疾病患者因传统检测方法无法确定病原体信息，不能得到及时有效地救治，从而使病情恶化。因此，快速、特异且高通量的病原体检测方法，对有效诊断和及时防治感染性疾病具有重要的意义［11］。2病原体的高通量测序技术目前，以感染性疾病病原体为检测目标的高通量测序技术包括全基因组测序、16srRNA基因测序和宏基因组测序，不同的方法检测目的不同。全基因组测序可以得到病原体的全部基因组序列，能够更全面地了解病原体的遗传信息，研究样品中的功能基因及其在环境中的作用。但全基因组测序分析费用高、周期长，其检测效率和实验步骤决定了该技术更多应用于科学研究和病原体基因组数据库的建立［12］。16srRNA测序能够检测高度保守的16s核糖体亚基，准确地鉴定已知细菌和发现新细菌，分析样品中病原体物种的丰度和分布情况，无须构建文库，极大地缩减了分析周期及成本。该技术的缺点是无法对不同物种的基因功能进行分析，也不能鉴定和区分病毒、真菌及寄生虫等其他病原体。宏基因组学是以某一特定环境样品中的病原体群体基因组为研究对象，以测序分析为研究手段，以病原体多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的病原体研究方法。基于宏基因组学的高通量测序可以分析病原体群体基因组成及功能，解读病原体群体的多样性与丰度，探求病原体与环境、宿主之间的关系，挖掘具有应用价值的基因资源，开发新的病原体活性物质。宏基因组测序直接从环境样品中提取基因组DNA后进行测序分析，将所测序列与专业数据库比对，得出样本中所含物种的信息；通过严格的宏基因组拼接，可获得较长的DNA片段；若测序达到一定的通量，可直接获得一个或多个病原体基因组草图；在此基础上进行功能分析及病原体群落结构和多样性分析，可更准确地反映病原体生存的真实状态。该方法不仅可以避开传统方法（培养法、血清法和PCR法）的局限性，快速地检测出已知病原体，还可以发现许多未知病原体，直接分析出样本中的病原体谱、丰度和分布情况，了解潜在病原体的变化情况，有助于诊断一些不明病原体引发的感染性疾病。随着周期短、通量高、成本低的第二代、第三代测序技术的广泛应用，宏基因组测序方法发生了巨大的变化［13-16］，在获得海量的测序数据后，能够快速、全面地分析病原体群落结构，为研究病原体组提供了极大便利。基于宏基因组测序的病原体组研究已渗透到各个领域，尤其在科学研究与临床诊断领域，更是取得了极大发展。3宏基因组测序在感染性病原体检测中的应用近年来，随着病原体的进化与变异，抗生素、激素、免疫抑制剂的大范围使用及恶性肿瘤、器官移植患者日益增加，许多新发的感染性问题不断出现，疑难感染病例也不断增多，传统的检测方法难以满足当前的临床需求。随着高通量测序技术的高速发展，一系列重要病原体全基因组数据被陆续公布，感染性疾病的病原谱逐个被解开，人们对病原体有了更多的认识，这些都为快速、准确、全面地诊断病原体的宏基因组带来了新的契机［17-20］。3.1宏基因组测序在细菌感染性疾病诊断中的应用细菌是感染性疾病最常见的病原体之一。培养法是细菌分离的标准方法，但细菌培养时间普遍较长，且许多细菌不易培养，多重感染易被忽视，而针对不明原因发热患者的病原体检测更是临床诊断的难点。采用宏基因组测序可以避开传统培养法的局限，直接对样本基因组进行测序，迅速鉴定样本中的已知病原体，有效发现各种未知病原体。菌血症是ICU患者常见的严重感染性疾病，须要对病原体进行快速诊断，从而有针对性地进行抗菌治疗。Long等［21］对78例ICU患者的血浆分别进行宏基因组二代测序和血培养，结果显示，宏基因组二代测序方法的病原体检出率为30.77%，而血培养法仅为12.82%，表明宏基因组测序在病原体检测中具有更高的灵敏性。Abril等［22］将1例脓毒症患者血浆中的游离细菌DNA进行宏基因组测序，24h内便检测出嗜二氧化碳噬细胞菌(Capnocytophagacanimorsus)基因序列高度富集，并使用16srRNA测序进行确认，体现出宏基因组技术相对传统检测方法具有更高的效率。单核细胞增多性李斯特菌常伴随EB病毒感染，引起传染性单核细胞增多症，也可引发脑膜炎、菌血症等，传统检测技术在早期很难发现感染该菌。Yao等［23］对3例临床疑似单核细胞增多性李斯特菌感染的脑膜炎患者的脑脊液进行细菌培养，结果为单核细胞增多性李斯特菌阴性，而脑脊液宏基因组测序确诊为单核细胞增多性李斯特菌感染，这是国际上首次将宏基因组测序技术应用于单核细胞增多性李斯特菌的诊断。Ye等［24］采用宏基因组二代测序方法检出1例病因不明且常规抗生素治疗无效的白血病患儿为痤疮丙酸杆菌感染，在进行针对性靶向治疗后，患者病情迅速好转。感染性疾病常见的病原体还包括支原体、衣原体、真菌和寄生虫等。宏基因组测序在这些病原体的临床检测中同样发挥了重要的作用［25-26］。Andersson等［27］用Illumina测序平台对阴道拭子进行宏基因组测序，发现了沙眼衣原体的染色体和质粒，可见对阴道拭子标本直接测序能够用于检测多种细菌的基因组序列。宏基因组测序在寄生虫诊断方面的研究还比较少，未来潜在的研究方向包括寄生虫的基因组特征与流行病学的关联性，以及寄生虫对肠道微生态环境的影响等。3.2宏基因组测序在病毒感染性疾病诊断中的应用目前，病毒感染的诊断以免疫学检测为主要方法，PCR检测等分子诊断方法的应用也较为广泛，但两种方法均须预判可能的病毒类型，并且无法检测未知的病毒。利用宏基因组学检测病原体时，无须预判病原体的范围，也不存在靶向测序法中的偏倚性。随着高通量测序耗时的减少和成本的不断降低，宏基因组测序在病毒感染诊断等领域同样有着广阔的应用前景［28］。Ni等［29］对5例ICU疑难重症患者的血浆样本DNA进行宏基因组测序，快速检出其中含有EB病毒DNA，说明宏基因组测序对于传统的EB病毒免疫学检测是一个很好的补充。Piantadosi等［30］报道了1例经常接触蜱、啮齿动物与蝙蝠的严重进行性脑炎患者，利用宏基因组测序技术，在4d内鉴定出该患者感染了罕见的博瓦桑病毒。相对于传统的血清学检测方法，该患者的病毒检出时间提早了4周，说明宏基因组测序可应用于中枢神经系统类病毒感染的快速检测。Guan等［31］对4例疑似中枢神经病毒感染患者的脑脊液进行宏基因组测序，均检出病毒感染，同时用PCR进行了二次验证，结果与宏基因组测序结果吻合。Somasekar等［32］对204例成年急性肝衰竭患者（17例患者已知为HAV或HBV感染）的血清样本进行病毒感染分析，通过宏基因组二代测序鉴定出8例新病毒感染病例，同时鉴定出一些之前未被检测出的多重感染病例，表明宏基因组二代测序能够较好地检出低丰度的多重感染病原体。4宏基因组测序存在的问题及展望目前，宏基因组测序技术应用于临床检测还存在很多实际问题。①临床标本数量多，摆放杂，可能会出现交叉污染而导致假阳性结果或数据丢失，特别是细菌感染样本中可能混有大量白细胞，导致宿主信息干扰读取的目标序列；病原体数据也可能与正常菌群混淆或者相互干扰。目前还没有建立统一的各类临床标本宏基因组测序的前处理标准；②高通量测序会产生大批量的数据，需要专业的生物信息团队进行大数据分析，由于许多病原体的基因组数据库并不完善，所以分析的成本和时间目前难以控制；③对于许多感染性疾病，其特征性的病原谱尚不明确，仅获取患者样本的病原体信息尚不足以明确致病原因和疾病发展过程，难以实现精确治疗和干预；④尚未开展与常规检测方法比对的规律性研究，检测的敏感度和特异性需要临床大数据评价及与现有方法的比较；⑤目前大部分的研究和应用是以病原体的定性分析为主，须要进一步扩大数据库规模，将定性信息转变为定量信息，以确保临床诊断结果的准确性［33-34］。尽管宏基因组二代测序技术的临床应用受到广泛关注，但是距离真正应用于感染性疾病检测还有许多差距和不足。目前，除了一些一类通用测序试剂和仪器设备，仅有应用于产前筛查的二代测序试剂获得我国国家食品药品监督管理总局批准上市，而其他研究领域，包括感染性病原体筛查的二代测序应用，仍处于产品的注册检测、优化、临床试验等一系列准备工作阶段。2016年5月13日，美国食品药品监督管理局发布了一项关于二代基因测序器械的指导草案，该草案对使用二代测序仪器检测感染性疾病病原体及毒力标志物的宏基因组测序验证进行了规范化指导。这是目前在该领域应用的二代测序仪器可供参考的信息。此外，针对宏基因测序检测感染性病原体实验操作方案及结果评价，目前仍缺乏统一的参考标准。随着高通量测序技术的发展，采用宏基因组测序技术可以突破传统检测方法的局限性。针对难以培养的病原体和不明病因无法预判的感染病患，利用高通量宏基因组测序技术和专业的病原体数据库，可直接对样本中的病原体DNA进行检测，通过软件分析得出覆盖齐全、准确可靠的样本病原体遗传信息。今后须要进一步推进数据库的建设、罕见病原体基因谱的研究、病原体的机制研究以及宏基因组测序标准化流程的建立等工作。相信未来宏基因组测序技术将会逐步解决感染性病原体鉴定的难题，进一步推动临床微生物学和感染病学的发展。【参考文献】KergourlayG,TaminiauB,DaubeG,etal.Metagenomicinsightsintothedynamicsofmicrobialcommunitiesinfood[J],IntJFoodMicrobiol,2015,213:31-39.Mulcahy-O'GradyH,WorkentineML.Thechallengeandpotentialofmetagenomicsintheclinic[J],FrontImmunol,2016,7:29.BikHM.Decipheringdiversityandecologicalfunctionfrommarinemetagenomes[J].BiolBull,2014,227(2):107-116.LynchT,PetkauA,KnoxN,etal.Aprimeroninfectiousdiseasebacterialgenomics[J].ClinMicrobiolRev,2016,29(4):881-913.ChenH,JiangW.Applicationofhigh-throughputsequencinginunderstandinghumanoralmicrobiomerelatedwithhealthanddisease[J].FrontMicrobiol,2014,5:508.QinJ,LiR,RaesJ,etal.Ahumangutmicrobialgenecatalogueestablishedbymetagenomicsequencing[J].Nature,2010,464(7285):59-65.SanfordJA,GalloRL.Functionsoftheskinmicrobiotainhealthanddisease[J].SeminImmunol,2013,25(5):370-377.Lopez-PerezM,MireteS.DiscoveryofnovelantibioticresistancegenesBlumHE.Thehumanmicrobiome[J].AdvMedSci,2017,62(2):414-420.王升启.分子诊断技术在传染病病原体检测中的应用[J].传染病信息，2014,27(5):266-269.MorensDM,FauciAS.Emerginginfectiousdiseasesin2012:20yearsaftertheinstituteofmedicinereport[J].MBio,2012,3(6):e00494-12.崔玉军，杨瑞馥.病原体全基因组测序在预防医学领域的应用[J].传染病信息，2014,27(5):274-278.LindahlBD,NilssonRH,TedersooL,etal.Fungalcommunityanalysisbyhigh-throughputsequencingofamplifiedmarkers--auser'sguide[J].NewPhytol,2013,199(1):288-299.LiuD,LeiL,YangB,etal.Directelectrontransferfromelectrodetoelectrochemicallyactivebacteriainabioelectrochemicaldechlorinationsystem[J].BioresourTechnol,2013,148:9-14.FleischmannRD,AdamsMD,WhiteO,etal.Whole-genomerandomsequencingandassemblyofHaemophilusinfluenzaeRd[J].Science,1995,269(5223):496-512.SimnerPJ,MillerS,CarrollKC.Understandingthepromisesandhurdlesofmetagenomicnext-generationsequencingasadiagnostictoolforinfectiousdiseases[J].ClinInfectDis,2017,65(9):1477-1485.BenderJM,BardJD.Metagenomicsinpediatrics:usingashotgunapproachtodiagnoseinfections[J].CurrOpinPediatr,2018,30(1):125-130.HandelsmanJ.Metagenomics:applicationofgenomicstounculturedDiBJ,BaoY,GloorGB,etal.Highthroughputsequencingmethodsandanalysisformicrobiomeresearch[J],JMicrobiolMethods,2013,95(3):401-414.WilsonMR,NaccacheSN,SamayoaE,etal.Actionablediagnosisofneuroleptospirosisbynext-generationsequencing[J],NEnglJMed,2014,370(25):2408.LongY,ZhangY,GongY,etal.Diagnosisofsepsiswithcell-freeDNAbynext-generationsequencingtechnologyinICUpatients[J].ArchMedRes,2016,47(5):365-371.AbrilMK,BarnettAS,WegermannK,etal.DiagnosisofCapnocytophagacanimorsussepsisbywhole-genomenextgenerationsequencing[J].OpenForumInfectDis,2016,3(3):ofw144.YaoM,ZhouJ,ZhuY,etal.DetectionofListeriamonocytogenesinCSFfromthreepatientswithmeningoencephalitisbynextgenerationsequencing[J].JClinNeurol,2016,12(4):446-451.YeM,WeiW,Yang乙etal.RapiddiagnosisofPropionibacteriumacnesinfectioninpatientwithhyperpyrexiaafterhematopoieticstemcelltransplantationbynext-generationsequencing:acasereport[J].BMCInfectDis,2016,16:5.MJPallen.Diagnosticmetagenomics:potentialapplicationstobacterialviralandparasiticinfections[J].Parasitology,2014,141(14):1856-1862.HagiwaraD,TakahashiH,WatanabeA,etal.Whole-genomecomparisonofAspergillusfumigatusstrainsseriallyisolatedfrompatientsAnderssonP,KleinM,LilliebridgeRA,etal.SequencesofmultiplebacterialgenomesandaChlamydiatrachomatisgenotypefromdirectsequencingofDNAderivedfromavaginalswabdiagnosticspecimen[J].ClinMicrobiolInfect,2013,19(9):405-408.Munan