第三章基因工程第一节基因工程工具酶wangjx

第一节基因工程中的工具酶限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰其它酶类--用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等第一页，共四十二页。一、限制性内切酶（一）、限制修饰系统的种类（二）、限制性内切酶的定义、命名（三）、限制酶的特点（四）、异源同序酶（isoschizomer，同裂酶）（五）、限制酶的用途第二页，共四十二页。（一）、限制修饰系统的种类1.

I型：由三个基因构成，hsdR；hsdM；hsdS（hostspecificityforDNArestrictionmodificationandspecificity）位于染色体上，三个基因构成一个复合体，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM（５—腺苷甲硫氨酸），无特异切割位点。2.

II型：限制与修饰基因产物独立起作用，在Ｅ.coli中这两种基因位于质粒上。3.

III型：修饰酶与Ｉ型酶相同，hsdＭ与hsdＳ基因产物结合成一亚单位，限制酶是独立存在的。

上述三个系统中，只有II型限制酶与甲基化酶具有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。第三页，共四十二页。（二）、限制性内切酶的定义、命名

1.定义：广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II型限制酶。

2.

命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。例如：HindⅢ前三个字母来自于菌种名称H.influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。EcoRI—EscherichiacoliRIHindⅢ—Haemophilus

influensaedⅢSacI(II)—Streptomyces

achromagenesI(Ⅱ)第四页，共四十二页。（三）、限制酶的特点

1.识别顺序和酶切位点１）识别４-8个相连的核苷酸

MboINGATCN；AvaIIGG(A/T)CCBamHIGGATCC：PpuMIPuGG(A/T)CCPyNotIGCGGCCGC；SfiIGGCCNNNNNGGCCCCGGN’N’N’N’N’CCGG

FokI5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’外侧，产生５’-端突起２）富含ＧＣ第五页，共四十二页。

３）对称性—双对称

EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’

４）切点大多数在识别顺序之内，也有例外５）限制酶切后产生两个末端，末端结构是５’-Ｐ和３’-ＯＨ2.

末端种类

１）３’-端突起，个数为２或４个核苷酸

PstI5’-CTGCAG-3’5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’3’-GACGTC-5’

２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸

EcoRI5’-GAATTC-3’5’-GOH

PAATTC-3’3’-CTTAAG-5’3’-CTTAAP

HOG-5’

粘性末端能与另一个相同的粘连末端相连接，任何两个具有相同识别位点的DNA分子经限制酶切割后能够重新连接成新的重组DNA分子。在进行DNA重组时，应用限制酶同时切割目的基因和载体DNA，使之产生相对的粘性末端，然后再将二者连接成重组DNA分子第六页，共四十二页。

３）

平齐末端

SmaI5’-CCCGGG-3’5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’3’-GGGCCC-5’

４）非互补的粘性末端ａ）切点在识别顺序之外的，如：FokIFokI5’-GGATG(Ｎ)9-3’5’-GGATG(N)93’-CCTAC(Ｎ)13-5’3’-CCTAC(N)13ｂ）能识别简并顺序的，如：AvaI

AvaI

5’-CPyCGPuG-3’

CCCGGG;CTCGGG;CCCGAG;CTCGAG

第七页，共四十二页。

5’-GAATTC-3’3’-

CTTAAG-5’5’-GTTAAC-3’3’-

CAATTG-5’EcoRⅠ的识别序列HaeⅠ的识别序列第八页，共四十二页。5’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’5’NNNNNG

3’NNNNNCTTAApEcoRⅠ的识别序列和酶切切口（粘端）pAATTCNNNNNN3'GNNNNNN5’第九页，共四十二页。

5’NNNNNNGTTAACNNNNN3‘

3’NNNNNNCAATTGNNNNN5‘5’NNNNNGTT

pAACNNNNN3’3‘NNNNNCAAp

TTGNNNNN5’HaeⅠ的识别序列和酶切切口（平端）第十页，共四十二页。酶切条件：酶切缓冲液低盐组：0～50mmol/LNaCl中盐组：50～100mmol/LNaCl高盐组：100～150mmol/LNaCl第十一页，共四十二页。（四）、异源同序酶（isoschizomer，同裂酶）1.定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制酶2.特点：1）识别相同顺序2）切割位点的异同

KpnIGGTACCAsp718GGTACCSstICCGCGGSacICCGCGG

第十二页，共四十二页。（五）、限制酶的用途

1.

DNA重组2.

限制酶（物理）图谱绘制3.

突变分析（RFLP分析）4.限制酶的部分酶切与完全酶切附：IIS型限制酶的特点1.

具有特异型核苷酸顺序识别能力，但该顺序不具有对称结构。2.

酶切位点与识别位点不一致，切点常在识别位点的一侧，1--20nt。3.

酶切后的末端经补平后又可发生酶切反应。4.

产生粘性末端可以是1--5个核苷酸。5.

均为单体，分子量为47—108kD。第十三页，共四十二页。酶切图谱的构建（a）请构建该环状DNA分子的酶切图谱第十四页，共四十二页。酶切图谱的构建（b）第十五页，共四十二页。二、DNA甲基化酶

（一）、甲基化酶的种类与识别顺序1.

限制修饰系统I、II、III型中的甲基化酶三个系统中的甲基化酶可使细菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤发生甲基化，形成5’-甲基胞嘧啶和6’-甲基腺嘌呤。在DNA重组实验中，常用的甲基化酶属于II型，它与相应的限制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同。如：M.EcoRIGAmATTCCEcoRIGAATTC不同M．HpaICmCGGHpaICCGG相同第十六页，共四十二页。2.

II型甲基化酶对限制酶活性的影响

１）

抑制同种限制酶的活性

M.BamHIGGATmCC—BamHI(GGATCC)M.EcoRIGAmATTC—EcoRI(GAATTC)

２）

抑制不同种限制酶的活性a.顺序完全重叠如：M.ClaI（ATCGmAT）----TaqI（TCGmA）b.顺序边界重叠如：M.BamHI（GGATmCC）----MepI（mCCGG）

３）

抑制不同种限制酶的部分活性M．TaqI（TCGmA）---HindII（GTPyPuAC）：GTCAAC，GTTAAC，GTCGmAC，GTTGAC3.

甲基化酶的用途

１）

改变某些限制酶识别顺序的特异性，以便重组体的形成２）

在建立基因文库时，可先使DNA分子部分甲基化，然后再用限制酶切第十七页，共四十二页。M.RECH3CH3CH3RERERERERERERERERERERECH3CH3CH3与载体相连甲基化酶人工接头RE用于基因组文库的建立用于cDNA的连接RERERE第十八页，共四十二页。三、核酸酶

（一）、外切酶III（ExoIII）

1.一般特点：

来自于E.coli，分子量28,000kD

2.催化反应类型

1)外切酶活性：3’→5’，产生5’-单磷酸核苷酸和具各种结构的ds-DNA，pH7.6-8.52)核酸酶H活性：除去DNA-RNA杂交分子中的RNA分子，pH7.6-8.53)3’-磷酸酶活性：除去3’-磷酸基后形成3’-OH端，有利于DNA聚合酶反应，pH6.8-7.44)内切酶活性：在无嘌呤或无嘧啶处将DNA键切开，pH7.6-8.5第十九页，共四十二页。

3.

外切酶活性特点

1)反应底物：互补ds-DNA2)碱基释放速度：C>>A-T>>G3)反应产物：5’-单磷酸核苷和具缺口或5’-端突起的ds-DNA，过度反应将导致DNA降解

4.

用途

1)

核酸（DNA）标记2)

基因突变----缺失3)

DNA序列测定时作顺序缺失

5.

使用注意事项

1)

正式使用前，测定在一定条件下酶的反应速度2)

在一定条件下，ExoIII不能作用GC富集区(来自于cDNA加尾)第二十页，共四十二页。ds-DNA结构:切口,缺口,断口缺口(gap)切口(nick)断口(cut)3'HOP5'3'HOP5'第二十一页，共四十二页。5'P5'P5'P5'P5'P3'HO3'HO3'HO3'HO3'HO3'HO3'HO3'HOOH3'OH3'OH3'OH3'P5'P5'P5'P5'P5'P5'P5'3'HOP5'OH3'P5'RNaseHExoIII的外切酶和RNaseH的作用第二十二页，共四十二页。1234abc1234abc1234abc1234abc1234abc234abc34abc4abcabcExoIII用于顺序缺失ExoIII

ExoIII

[α-32P]

[α-32P]

dCTP

dCTP

5'PP5'5'PP5'3'HOOH3'3'HOOH3'ExoIII用于DNA标记第二十三页，共四十二页。（二）、RNase（三）、RNaseH（二）、RNase

大部分用于RNA的核苷酸序列分析或除去DNA样品或蛋白质合成系统中的RNA分子。

1.RNaseA

分离自牛胰脏，对热稳定，抗去污剂（100℃加热15min仍具活性）,用于除去DNA样品中的RNA分子

2.核酸酶S7，亦称微球菌核酸酶，对RNA敏感，用于除去蛋白质合成系统中的内源mRNA

（三）、RNaseH

作用于DNA-RNA杂交分子中的RNA链，用于cDNA文库建立时除去RNA链以便第二条链cDNA链的合成。

第二十四页，共四十二页。（四）、DNaseI1.特点：具内切酶活性，作用于ds-DNA，但无核苷酸序列特异型，产生5’-P低聚核苷酸;Ca2+,Mg2+或Ca2+,Mn2+可使酶活达最大值当酶浓度很低时，ds-DNA分子上将形成切口，不同类型二价阳离子对两条链上切口位置形成有以下影响：Mg2+存在时，两条链上的切口独立无关，Mn2+存在时，两条链上的切口几乎在同一位置

2.用途

1)切口移位，制备DNA探针2)制备RNA样品时除去DNA分子3)基因突变时产生切口

第二十五页，共四十二页。

Mn++存在时

Mg++存在时

DNaseI作用特点DNaseIHOP5’3’5’3’5’3’DNaseI与PolI的切口移位PolI第二十六页，共四十二页。四、聚合酶包括DNA聚合酶和RNA聚合酶（一）、E.coliDNA聚合酶I（polI）

1.E.coli的DNA聚合酶系统

PolI参与DNA修复,具3’→5’和5’→3’外切酶活性polII同上具3’→5’外切酶活性polIII参与DNA复制,具3’→5’和5’→3’外切酶活性

2.E.colipolI的特点

1）具两种外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其中小片段具5’→3’外切酶活性，大片段具3’→5’外切酶活性(大片段亦称为Klenow片段,polIK)2）聚合酶活性，5’→3’,要求3’-OH引物和模板DNA，其延续性受反应条件的影响3）外切酶活性

第二十七页，共四十二页。3.用途

1）除去3’-端突起的单链DNA（在无dNTP时）2）补齐5’-突起端3）合成第二条cDNA4）切口移位制备探针其中用途2)和3)常用大片段第二十八页，共四十二页。（二）、T4DNA聚合酶

1.特点：

5’→3’聚合酶活性，1500nt/min,为polI的两倍3’→5’外切酶活性，可作用于ss-DNA和dsDNA,其切除速度分别为40和4000nt/min,缺少5’到3’的外切核酸酶活性.

2.

用途：

制备高比活性探针(1010cpm/μgDNA);DNA末端修饰---缺失

外切酶活性

聚合酶活性

无dNTPdNTP第二十九页，共四十二页。(三)T7噬菌体DNA聚合酶具3’到5’端外切核酸酶活性和持续合成能力较低的DNA聚合酶活性.应用:1)合成DNA能力很强,可用于延伸很长的模板.2)可用于定点诱变中互补链的合成.3)3’末端的标记4)将双链DNA的黏性末端转变为平端.第三十页，共四十二页。（四）、TaqDNA聚合酶1.特点：

分离自水生栖热菌，分子量为94,000，最适反应温度75℃，对95℃高温具良好稳定性，该酶不存在3’→5’外切酶活性2.用途：

主要用于DNA的体外扩增，经25次循环后才进入酶的反应稳定期，一个DNA分子因而可被扩增4×106倍。DNA扩增技术又称为聚合酶链式反应，它包括以下三个步骤：DNA模板变性(95℃)→

与DNA引物退火(45℃)→引物延伸(75℃)

第三十一页，共四十二页。TaqPol和PCR

5’3’变性

3’5’

5’3’引物

3’5’复性

5’3’5’3’

3’5’引物3’5’5’3’延伸

5’3’3’5’

3’5’

第三十二页，共四十二页。(五)不倚赖于模板的DNA聚合酶末端转移酶特点:催化dNTP到DNA的3’羟基端,不需要模板,但需要2价阳离子.应用:1)克隆DNA片段.同聚物加尾.2)用32P标记DNA的3’末端.3)在DNA的3’末端掺入非放射性的标签.4)合成多脱氧核苷酸同聚体.第三十三页，共四十二页。(六)倚赖RNA的DNA聚合酶反转录酶合成cDNA克隆补平和标记5’端突出的DNA片段的3’末端.代替Klenow酶第三十四页，共四十二页。(七)倚赖DNA的RNA聚合酶噬菌体的RNA聚合酶:SP6,T7和T3应用:产生均匀标记的高比活性单链RNA探针(原位杂交)第三十五页，共四十二页。(八)不倚赖DNA的RNA聚合酶poly(A)聚合酶应用:用32P标记RNA的3’端加尾(poly(A)第三十六页，共四十二页。五、连接酶（一）、T4DNA连接酶

1.特点：

只连接ds-DNA分子，要求3’-羟基和5’-磷酸基

2.用途：

1)相同或相容粘性末端的连接2)平整末端的相连DNA平端来源：限制酶作用结果;限制酶与其它酶共同作用结果。平端的连接比粘性末端的连接要困难得多，所需的酶量也多

第三十七页，共四十二页。5’-AAGCTT-3’5’-AOH

PAGCTT-3’PAGCTTAOH3’-TTCGAA-5’3’-TTCGAP

HOA-5’HOATTCGAP

退火5’-AHOPAGCTTAHOPAGCTT-3’3’-TTCGAPOHATTCGAPOHA-5’