肿瘤的过继性细胞免疫治疗

学习内容与要求掌握肿瘤的过继性细胞免疫治疗的定义及原理。熟悉LAK、TIL、CD3AK、CIK、CTL细胞的制备方法及研究进展。目前一页\总数七十二页\编于点概述肿瘤的过继性细胞免疫治疗(Adoptivecellularimmunotherapy，ACI或AIT)是指向肿瘤患者转输具有抗肿瘤活性的免疫细胞(特异性的和相对特异性的)直接杀伤肿瘤或激发机体免疫反应杀伤肿瘤细胞，达到治疗肿瘤的目的。

目前二页\总数七十二页\编于点简要历史回顾20世纪60年代：发现细胞免疫引起组织器官移植排斥启发人们应用过继性细胞免疫治疗肿瘤。20世纪80年代：85年，Rosenberg报道LAK/IL-2治疗晚期恶性肿瘤具有疗效。86年，报道TIL。1991年，斯坦福大学的SchmidtWolf等报道了CIK细胞。目前三页\总数七十二页\编于点一）淋巴因子激活的杀伤细胞

(Lymphokineactivatedkillercells,LAK)病人外周淋巴细胞（体外）IL-2激活回输病人目前四页\总数七十二页\编于点LAK治疗方法优点只对肿瘤细胞产生细胞毒性；基本无毒副作用；不依赖荷瘤者免疫功能；可与其他疗法联合使用；无免疫抑制作用。目前五页\总数七十二页\编于点LAK细胞杀伤肿瘤细胞的作用机制LAK细胞的异质性LAK细胞表面存在多种与肿瘤识别相关的特异性分子。LAK杀伤肿瘤细胞不受MHC限制目前六页\总数七十二页\编于点LAK细胞杀伤肿瘤细胞的作用机制

效靶细胞结合后，通过分泌细胞毒颗粒，在Ca2+存在时，释放其中的穿孔素、丝氨酸酯酶、TNF样分子等杀伤介质，直接杀伤靶细胞。通过LAK细胞表面的杀伤分子(如m-LT)直接杀伤靶细胞。通过分泌其他细胞因子间接杀伤靶细胞。目前七页\总数七十二页\编于点同种异体LAK细胞(Allo-LAK)Allo-LAK细胞的有效性

Allo-LAK细胞的安全性目前八页\总数七十二页\编于点

LAK细胞分布特点和临床疗效一致，即对肺、肝、肾等器官肿瘤疗效较好，而对其他器官的肿瘤疗效不明显。

LAK细胞体内回输后组织器官分布目前九页\总数七十二页\编于点LAK细胞的制备LAK细胞的来源:患者自体外周血、6～7个月龄的胎儿胸腺和脾脏细胞、同种异体外周血、脐带血。细胞因子对LAK的诱导

IL-2/IL-15/IL-7目前十页\总数七十二页\编于点（二）肿瘤浸润性淋巴细胞(tumorinfiltratinglymphocyte,TIL)1）肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）激活病人Tumor分离淋巴细胞IL-2回输目前十一页\总数七十二页\编于点目前十二页\总数七十二页\编于点TIL细胞的特征TIL细胞的异质性

CD3、CD4、CD8T细胞TIL的作用机理诱导肿瘤细胞凋亡机制：TIL分泌细胞因子诱导调亡；释放穿孔素引起凋亡。目前十三页\总数七十二页\编于点

影响TIL扩增和转化的因素

影响因素作用

抗原辐射灭活的自身肿瘤抗原刺激TIL生长高水平表达HLA-1抗原的肿瘤细胞诱导TIL中CD4＋CTL细胞产生缺乏HLA-1抗原的肿瘤细胞诱导TIL中CD4＋细胞产生细胞因子低浓度IL-2(10-20U/ml)诱导对自身肿瘤细胞的特异性杀伤

IL-2+IL-4促进TIL细胞的增殖

GM-CSF+IL-2促进CTL细胞的增殖

IL-6促进肾癌来源的TIL增殖和特异性与非特异性的CTL的产生

IL-7促进TIL的增殖

GM-CSF+IL-2扩增TIL和提高TIL的杀伤活性抑制因子

IL-10+TGF-β抑制TIL生长和杀伤活性前列腺素抑制TIL的转化目前十四页\总数七十二页\编于点细胞毒药物对TIL的影响

化疗药物对TIL毒性大于对肿瘤细胞的杀伤性，因而在应用TIL过继免疫治疗时不宜同时使用化疗药物.目前十五页\总数七十二页\编于点TIL细胞的制备方法

TIL来源：①手术切除或活检的瘤体组织；②癌性胸水、腹水中淋巴细胞；③转移淋巴结。TIL体外激活：(1)白介素系统；

(2)TNF-α与IL-2的协同作用；(3)TIL与自身瘤细胞、自身淋巴细胞共同培养；(4)淋巴因子基因转导TIL；(5)双功能抗体导向TIL。

目前十六页\总数七十二页\编于点TIL的临床应用及展望

TIL细胞的临床应用受到许多因素制约发展方向：①增强TIL细胞增殖力以及特异性杀伤肿瘤细胞活性；②与其它细胞因子联合治疗，提高疗效；③改变TIL细胞的输注途径，缩短距离，使TIL细胞能更有效地达到并聚集瘤体处；④提高T细胞分泌Th1型细胞因子的能力，抑制分泌Th2型细胞因子。目前十七页\总数七十二页\编于点抗CD3

McAb激活的杀伤细胞(CD3AK)

CD3AK细胞是指用特定的抗CD3McAb激发免疫活性细胞的增殖并诱导相关细胞因子的表达和分泌，从而产生的可有效攻击肿瘤的杀伤细胞，故称之为抗CD3McAb激活的杀伤细胞(anti-CD3McAbactivatedkillercells,CD3AK)。

目前十八页\总数七十二页\编于点目前十九页\总数七十二页\编于点CD3AK细胞的免疫学特征

CD3AK细胞中含有高比例的CD3＋细胞和CD56＋或CD57＋细胞。通过自体辅佐细胞(单核或巨噬细胞)提呈处理过的抗原作用于TCR可激活T细胞。作用于TCR-CD3复合物的抗CD3McAb可模拟这种效应。目前二十页\总数七十二页\编于点CD3AK细胞制备人外周血单个核细胞(淋巴细胞)

加入CD3McAb再加入低剂量的IL-2目前二十一页\总数七十二页\编于点CD3AK细胞治疗肿瘤的优点

CD3AK细胞选择性地杀伤肿瘤细胞CD3AK细胞具有更为广谱的杀伤肿瘤作用CD3AK细胞增殖能力大大优于LAK细胞CD3AK细胞的增殖和维持可以不依赖或少依赖外源的IL-2目前二十二页\总数七十二页\编于点多种细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokinesinducedkillers,CIK)

将人外周血或骨髓单个核细胞在体外用多种细胞因子与CD3McAb共同培养一段时间后获得的杀伤细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokines-inducedkillercells,CIK细胞)目前二十三页\总数七十二页\编于点CIK细胞的制备分离获取外周血单个核细胞

诱导活化(IL-2,,Anti-CD3McAb,IFN-γ,PHA)高效扩增（IL-2,Anti-CD3McAb,IFN-γ,PHA）外周血收集CIK/TIL，全身/局部回输目前二十四页\总数七十二页\编于点细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocyteCTL)

T淋巴细胞通过TCR-CD3复合物、MHC分子、抗原肽及协同刺激分子共同刺激，增强T淋巴细胞增殖及效应。

目前二十五页\总数七十二页\编于点目前二十六页\总数七十二页\编于点CTL细胞的制备①分离肿瘤细胞；②调变肿瘤细胞：用直接导入方法或逆转录病毒介导的转移方法向肿瘤细胞导入B7基因，并检测肿瘤细胞表达B7分子的情况；③诱导CTL：用调变修饰后的肿瘤细胞与效应细胞共同培养，诱导高活性的CTL；④分离CTL用于临床治疗。目前二十七页\总数七十二页\编于点过继性免疫疗法存在的问题

由于肿瘤细胞的不均一性及效应细胞的异质性造成疗效的不确定性;体外大量扩增过继免疫细胞技术有待开发；输注的细胞向肿瘤组织的聚集性弱;体内过继免疫机制的进一步明确；与其它肿瘤治疗方法的有机整合需要进一步完善；缺乏统一的能指示临床转归的的免疫检测指标；目前二十八页\总数七十二页\编于点单克隆抗体与肿瘤分子靶向治疗目前二十九页\总数七十二页\编于点概述肿瘤分子靶向治疗：利用肿瘤组织或细胞所具有的特异性(或相对特异的)结构分子作为靶点，使用某些能与这些靶分子特异结合的抗体、配体等达到直接治疗或导向治疗目的的一大类治疗方法。

目前三十页\总数七十二页\编于点分子靶向治疗的靶点细胞受体信号转导细胞周期血管生成目前三十一页\总数七十二页\编于点单克隆抗体在肿瘤分子靶向治疗中的地位

肿瘤抗体靶向治疗的发展历史

肿瘤单克隆抗体靶向治疗的作用机制目前三十二页\总数七十二页\编于点肿瘤抗体靶向治疗的发展历史鼠源性多克隆抗血清是最早被用于治疗肿瘤的抗体分子

1975年利用杂交瘤技术成功地制备McAb，大大推动了肿瘤生物靶向治疗的进展

近十年来已研究制备出人鼠嵌合抗体、人源化抗体和完全人源抗体目前三十三页\总数七十二页\编于点抗体的结构和功能目前三十四页\总数七十二页\编于点抗体作为肿瘤的靶向治疗得益于抗体两个关键性技术的突破：人鼠嵌合抗体、人源化抗体和完全人源抗体技术及制备技术的成熟，基本上可以克服鼠源性抗体用于人体产生抗抗体的问题抗体库的建立和筛选以及多价重组抗体制备技术的发展，使人们能够直接获得特异性强和亲和力高的单克隆抗体。目前三十五页\总数七十二页\编于点1人一鼠嵌合抗体(ChimericAntibodies)

人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体。目前三十六页\总数七十二页\编于点①嵌合抗体鼠源V区人源C区小鼠杂交瘤细胞人B细胞V区基因C区基因鼠源V区鼠源C区目前三十七页\总数七十二页\编于点

构建嵌合抗体的大致过程是，将鼠源单抗的可变区基因克隆出来，连到包含有人抗体恒定区基因及表达所需的其它元件(如启动子、增强子、选择标记等)的表达载体上，在哺乳动物细胞(如骨髓瘤细胞、CHO细胞)中表达。构建重组表达载体目前三十八页\总数七十二页\编于点2鼠单抗可变区的人源化

尽管嵌合抗体的免疫原性已降低很多，但有时它仍可能引发较强的免疫反应。为了进一步降低抗体的鼠源成分，发展出CDR移植技术。

CDR移植即把鼠抗体的CDR序列移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体称CDR移植抗体或改型抗体，也就是人源化抗体。

目前三十九页\总数七十二页\编于点②人源化抗体小鼠杂交瘤细胞人B细胞CDR区基因V支架区

C区基因目前四十页\总数七十二页\编于点③完全人源化抗体小鼠B细胞敲除小鼠

Ig基因人Ig基因Ag骨髓瘤细胞杂交瘤细胞目前四十一页\总数七十二页\编于点

由于抗体技术的发展，至今全球已报道的抗体有１０多万种，其中基因工程抗体有１０００多种，人源化抗体２００多种。目前国际上已有５００多种抗体用于诊断和治疗，ＦＤＡ至今已批准１８种抗体上市，其中８种是用于治疗肿瘤的靶向抗体。

单克隆抗体靶向治疗目前四十二页\总数七十二页\编于点目前四十三页\总数七十二页\编于点至2000年底，在美国药品市场上生物技术药物有76种，其中抗体药物有15种2003年治疗用单抗的销售总额已超过52亿美元;2006年预计50~60个治疗性单抗上市;2010年预计单抗销售额200亿美元;美国已占全球单抗市场90%—一支独秀;完全人源化单抗现有多个处于临床前阶段。目前四十四页\总数七十二页\编于点肿瘤单克隆抗体靶向治疗的作用机制直接作用ADCC作用：(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity,ADCC)CDC作用（complement-dependentcytoxicity,CDC）通过McAb的主动免疫

目前四十五页\总数七十二页\编于点目前四十六页\总数七十二页\编于点CDC作用：抗体的Fc段与补体成分C1q结合，通过经典途径激活补体，导致肿瘤细胞溶解死亡。目前四十七页\总数七十二页\编于点间接作用：抗体结合同位素、化疗药物或细胞毒素，通过携带抗肿瘤制剂，直接抵达肿瘤局部，提高抗肿瘤制剂的疗效。目前四十八页\总数七十二页\编于点目前四十九页\总数七十二页\编于点抗人白细胞分化抗原的抗体治疗白细胞分化抗原（CD分子）是白细胞在正常分化成熟不同谱系和不同阶段以及活化过程中，出现或消失的细胞表面标记。多种抗人白细胞分化抗原已用于肿瘤的治疗靶点。目前五十页\总数七十二页\编于点抗CD20抗体

85%-90%的淋巴瘤属于B细胞来源。CD20存在于超过90%B淋巴细胞。造血干细胞、浆细胞、淋巴祖细胞以及其它组织均无表达，人体血清中亦无游离CD20的存在。CD20不会轻易从细胞膜上脱落。目前五十一页\总数七十二页\编于点抗CD20抗体（美罗华（Rituximab，Rituxan），第一个通过FDA批准应用于临床的人鼠嵌合型单抗。作用机制：激活补体介导的溶解及参与抗体依赖细胞介导的细胞毒作用，有效杀灭CD20阳性的B淋巴瘤细胞；增加化疗药物的细胞毒作用并诱导凋亡。目前五十二页\总数七十二页\编于点同位素结合性抗体同位素免疫结合可用于抗体携带同位素到达肿瘤细胞，产生杀肿瘤的局部治疗效果；还可作为临床检测肿瘤的一种敏感的工具。Zevalin（泽娃灵）钇９０（90Y）同位素标记的鼠源性抗CD20抗体与癌变的B—淋巴细胞表面的CD-20抗原结合，杀死癌细胞。目前五十三页\总数七十二页\编于点抗CD33结合性抗体

CD33可以在90%的AML原始细胞上被检出。几乎在所有的正常早期髓系、红系前体细胞上均有表达，但在正常造血干细胞或非造血细胞上并不表达。没有证据表明与CD33抗体结合可以引起凋亡。目前五十四页\总数七十二页\编于点单抗能特异性捕捉肿瘤抗原，用抗体携带化疗药物，可提高化疗药物在肿瘤的局部剂量，减少化疗药物的全身毒性反应。2000年FDA批准用于治疗急性复发性髓性白血病的Mylotarg（麦罗塔）是由抗CD33单抗与抗肿瘤抗生素calicheamicin（卡奇霉素）构成的偶联物，也是第一个获批准用于临床治疗的以化疗药物为“弹头”的抗体药物。

目前五十五页\总数七十二页\编于点肿瘤放射免疫靶向治疗利用特异性抗体作载体，与能释放β或α射线的放射性核素耦合，注入体内与肿瘤细胞特异性结合，实现对瘤体的内照射治疗。一般用于治疗白血病及淋巴瘤。鼠源性抗体作载体。目前五十六页\总数七十二页\编于点阻断信号传导通路的靶向治疗许多肿瘤中存在EGFR的高表达或异常表达。EGFR与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关。

目前五十七页\总数七十二页\编于点肿瘤细胞特别是EGFR+的肿瘤细胞的生长明显依赖于EGFR信号传导，其EGFR表达水平可比正常细胞高几千倍。目前五十八页\总数七十二页\编于点抗EGFR的单抗

（Erbitux）作用机制：特异性与表皮生长因子受体（EGFR,HER1,c-ErbB-1）结合，竞争性抑制表皮生长因子与该受体的结合，阻止相应酪氨酸激酶磷酸化后的信号传导过程，从而抑制细胞生长，诱导凋亡。抑制基质金属蛋白酶和血管内皮生长因子的活性。临床疗效：适用转移性大肠癌。目前五十九页\总数七十二页\编于点HER2具有以下重要特点：①体外试验中HER2+细胞表现致瘤特性；②HER2扩增／过度表达是肿瘤发生过程中的早期事件；③在各期乳腺癌中，HER2状态长时间保持稳定；④HER2定位于细胞膜，成为易于攻击的潜在治疗靶点目前六十页\总数七十二页\编于点抗HER-2的单抗

（Herceptin）作用机制：与HER-2受体结合，抑制细胞生长信号传递通路；加速HER-2受体降解，使HER-2受体表达下调。对肿瘤细胞株可介导抗体依的细胞毒作用，杀伤靶细胞；抑制血管内皮生长因子的生成，阻断肿瘤内血管组织的生长。临床疗效：适用转移性乳腺癌。

目前六十一页\总数七十二页\编于点酪氨酸激酶抑制剂Glivec(STI571，Gleevec，格列卫）是瑞士诺华公司上市的一种抗白血病药物。通过抑制生长因子受体酪氨酸激酶信号转导系统而抑制肿瘤细胞生长，已成功用于慢性髓细胞白血病、胃肠基质瘤(GIST)、的治疗，显示出良好前景。目前六十二页\总数七十二页\编于点

ZD1839(Iressa，易瑞沙)

易瑞沙是一种低分子量的合成性苯胺喹唑啉，可逆转的、选择性EGFR酪氨酸激酶抑制剂，口服有效。可诱导细胞周期停滞、促进凋亡、抗血管生成。主要用于治疗非小细胞性肺癌。采用单药易瑞沙治疗经含铂类化疗失败的晚期NSCLC的临床Ⅱ期试验结果显示：女性和未吸烟者有更好的疗效。目前六十三页\总数七十二页\编于点

抑制肿瘤血管生成的靶向治疗血管生成对大多数实体瘤的生长扩张是至关重要的,一些特殊的细胞产物和因子可以促进血管的生成,抑制血管生成是控制肿瘤生长的一种重要的靶向治疗方法。抗血管生成药物是由各种不同作用机制组成的一大类药物,可以破坏或抑制肿瘤的新生血管生成阻止肿瘤的生长和转移目前六十四页\总数七十二页\编于点肿瘤血管生成理论1971年,Dr.Folkman等提出可通过阻断肿瘤血管的生成来抑制肿瘤的生长,防止肿瘤的转移。基于肿瘤血管生成机理,抑制肿瘤血管生成的策略包括:利用小分子药物和内源性血管生成抑制因子直接抑制血管内皮细胞增殖!迁移,抑制细胞外基质形成,诱导血管内皮细胞凋亡;利用中和抗体、可溶性受体、受体拮抗剂阻断血管生成因子传递;利用反义核酸或生物因子抑制血管生成促进因子表达。目前六十五页\总数七十二页\编于点肿瘤生长与血管生成机制(Folkman,J.Ann.Surg.,1972)

第一步：直径大于1～2mm3的肿瘤释放VEGF及招募bFGF因子启动肿瘤血管生成步骤。

第二步：VEGF及bFGF刺激毛细血管内皮细胞增殖及内皮细胞迁移肿瘤，形成血管供给肿瘤所需营养物质。

第三步：血管内皮抑制素靶向毛细管内皮细胞，抑制正在形