研究黄芪精中黄芪甲苷

研究黄芪精中黄芪甲苷含量测定的新方法发表人：卢晶晶扬子江药业集团有限公司飞跃QC小组YangtzeRiverPharmaceuticalGroup扬子江药业集团目前一页\总数六十八页\编于二十三点一．产品概况黄芪精是我公司开发研制的虚症类OTC产品，为补血养气，固本止汗之良药。其疗效佳，口感好，携带方便。

YangtzeRiverPharmaceuticalGroup扬子江药业集团目前二页\总数六十八页\编于二十三点二.小组概况

(一)小组简介

小组名称飞跃QC小组课题注册号TZ2005015课题类型创新型小组成员8人成立时间2005.10活动时间2005.10～2006.4课题名称研究黄芪精中黄芪甲苷含量测定的新方法活动次数19次出勤率100%制表人：张集盘日期：2006.3.20YangtzeRiverPharmaceuticalGroup扬子江药业集团目前三页\总数六十八页\编于二十三点(二)QC小组成员一览表序号姓名性别受教育情况职务组内分工1张集盘男大专标准研究员组长，资料整理2黄新兰女本科，工程师，质量管理工程师QC主管副组长，技术指导3马军男大专标准研究员方案实施4卢晶晶女本科标准研究员方案实施，成果汇报5陆莉娟女大专标准研究员方案实施6祖若玉女大专标准研究员方案实施7牛萍女硕士，高工，质量管理工程师质管经理技术指导8季洪英女大专，工程师，质量管理工程师质管部长技术指导目前四页\总数六十八页\编于二十三点三．选择课题1.薄层扫描法测定黄芪精中黄芪甲苷含量的缺陷分析基线不稳定耗时长易出现鬼峰偏差大缺陷目前五页\总数六十八页\编于二十三点1.1.扫描时基线不稳定目前六页\总数六十八页\编于二十三点1.2.容易出现鬼峰目前七页\总数六十八页\编于二十三点1.3.检测偏差大，方法的准确性较差目前八页\总数六十八页\编于二十三点1.4.薄层板展开耗时长，且一块薄层板只能点一个批号的供试品，检测批次很有限，导致出成品检测报告的周期较长。1.5.按照部颁标准，以薄层扫描法（TLCS）对黄芪精中黄芪甲苷进行含量测定，结果如下。目前九页\总数六十八页\编于二十三点黄芪精按部颁标准含量测定结果批号含量（mg·ml-1）含量平均值（mg·ml-1）相对平均偏差（%）030301-10.114120.105260.109694.1030401-10.110680.106490.108582.0030501-10.126550.119450.123002.9030601-10.120410.113520.116963.0030702-10.129010.119300.124164.0030801-10.125070.133710.129393.4TLCS法测定本品含量时偏差大，不利于产品质量的控制。目前十页\总数六十八页\编于二十三点2.课题确定

研究黄芪精中黄芪甲苷含量测定的新方法可供直接借鉴的方法少黄芪化学成分复杂黄芪为君药黄芪甲苷为主要有效成分目前十一页\总数六十八页\编于二十三点四.设定目标拟制定黄芪精中黄芪甲苷含量测定的新方法的回收率不低于90%；含量测定结果的相对平均偏差小于2.0%。目前十二页\总数六十八页\编于二十三点五．提出并选择最佳方案1.提出方案（1）HPLC-UV（高效液相色谱-紫外检测器）法（2）HPLC-RI（高效液相色谱-示差折光检测器）法（3）HPLC-ELSD（高效液相色谱-蒸发光散射检测器）法目前十三页\总数六十八页\编于二十三点2.方案的分析、评估与确定序号方案内容原理分析评估人方案评估综合得分方案选定可操作性准确性经济性1HPLC-UV（高效液相色谱-紫外检测器）法利用黄芪甲苷在203nm处有末端吸收的原理,建立以乙腈-水（32：68）为流动相的HPLC-UV法张集盘▲▲●44因在203nm处干扰大不选黄新兰▲●●马军●●●卢晶晶●●●陆莉娟▲▲●祖若玉▲●●牛萍▲▲●季洪英▲▲●目前十四页\总数六十八页\编于二十三点序号方案内容原理分析评估人方案评估综合得分方案选定可操作性准确性经济性2HPLC-RI（高效液相色谱-示差折光检测器）法样品组分折射率与流动相溶剂折射率有差异，当组分洗脱出来时，会引起流动相折射率的变化，该变化与样品组分的浓度成正比

张集盘●

▲

●32因灵敏度不高不选黄新兰▲

●

●马军●

●

●卢晶晶●

●

●陆莉娟●

▲

●祖若玉▲

●

●牛萍●

●

●季洪英●

●

●目前十五页\总数六十八页\编于二十三点序号方案内容原理分析评估人方案评估综合得分方案选定可操作性准确性经济性3HPLC-ELSD

（高效液相色谱-蒸发光散射检测器）法

ELSD可以对所有挥发性低于流动相的物质作出准确检测,而与被检测物质的化学基团关系不大,响应值与样品的质量成正比张集盘▲■●76因检测范围广、灵敏度高，故选定黄新兰▲■●马军▲■●卢晶晶▲■●陆莉娟▲■●祖若玉▲■●牛萍■■●季洪英■■●备注：可操作性、准确性、经济性三个指标均以1分（●一般）、3分（▲良好）、5分（■显著）为评分标准，上述综合得分为QC小组成员所评分数的总和。目前十六页\总数六十八页\编于二十三点3.确定方案的采用顺序（3）HPLC-ELSD（高效液相色谱-蒸发光散射检测器）法（1）HPLC-UV（高效液相色谱-紫外检测器）法（2）HPLC-RI（高效液相色谱-示差折光检测器）法PDCA目前十七页\总数六十八页\编于二十三点六．制定对策

根据以上选择的最佳方案制订对策表对策目标措施地点时间负责人色谱条件的确定峰形对称，目标峰与相邻峰分离度不小于1.5，保留时间适中对不同的色谱柱、流动相、流速等进行摸索，尽量与药典中黄芪药材含量测定的色谱条件划一仪器室05.11.21～05.11.28张集盘马军供试品前处理方法的选择有效地提取目标物且操作方便摸索科学、准确的供试品前处理方法，尽量与药典中黄芪药材含量测定的前处理方法划一仪器室05.12.05～05.12.17张集盘马军卢晶晶陆莉娟目前十八页\总数六十八页\编于二十三点对策目标措施地点时间负责人线性关系的确定

相关系数大于0.9990配制至少5个系列浓度，选择适当的曲线拟和类型进行确定

仪器室

06.01.05～06.01.20

张集盘马军卢晶晶精密度试验

峰面积的相对标准偏差RSD＜2.0%

同一供试品至少连续进样5次，考查色谱峰面积的相对标准偏差（RSD）

仪器室

06.02.05～06.02.11

张集盘马军祖若玉目前十九页\总数六十八页\编于二十三点对策目标措施地点时间负责人重复性试验

含量测定结果的相对标准偏差RSD＜2.0%同一批号的供试品同一人同一仪器平行操作6份，考查含量测定结果的相对标准偏差（RSD）

仪器室

06.02.13～06.02.18

张集盘稳定性试验峰面积的相对标准偏差RSD＜2.0%

同一供试品分别在0、2、4……小时进样分析，考查色谱峰面积的相对标准偏差（RSD）仪器室

06.02.20～06.02.23

张集盘马军卢晶晶祖若玉

目前二十页\总数六十八页\编于二十三点对策目标措施地点时间负责人方法回收率试验

方法回收率不低于90%

同一批号已知含量的供试品加入适量的对照品（或对照品溶液）平行操作6份，考查方法回收率

仪器室

06.02.25～06.03.10张集盘马军陆莉娟

目前二十一页\总数六十八页\编于二十三点七．对策实施实施一：色谱条件的确定1.仪器与试药Agilent1100高效液相色谱仪；Attech2000蒸发光散射检测器；梅特勒AG285电子天平。

黄芪精；天津农药总厂D101型大孔吸附树脂；甲醇、乙腈为色谱纯；95%乙醇为分析纯；水为超纯水。目前二十二页\总数六十八页\编于二十三点2.对照品溶液的制备取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇溶解，配制成0.1mg•ml-1的对照品溶液。3.供试品溶液的制备精密量取本品10ml，置分液漏斗中，加水10ml，摇匀，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次20ml，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇10ml使溶解，0.45µm有机系微孔滤膜滤过，即得。目前二十三页\总数六十八页\编于二十三点4.色谱条件的确定目前二十四页\总数六十八页\编于二十三点色谱条件筛选图1色谱柱：AgilentXDB-C18柱（4.6×150mm，5µm）流动相：乙腈-水(40：60)柱温：40℃流速：1.2ml·min-1min24681012mAu100200300400500600700ADC1A,ADC1CHANNELA(ZJP\HQJ21528.D)1.4057.917目前二十五页\总数六十八页\编于二十三点色谱条件筛选图2色谱柱：AgilentXDB-C18柱（4.6×150mm，5µm）流动相：乙腈-水(40：60)柱温：40℃流速：1.0ml·min-1目前二十六页\总数六十八页\编于二十三点色谱条件筛选图3色谱柱：AgilentXDB-C18柱（4.6×150mm，5µm）流动相：乙腈-水(40：60)柱温：40℃流速：0.9ml·min-1目前二十七页\总数六十八页\编于二十三点色谱条件筛选图4色谱柱：AgilentXDB-C18柱（4.6×150mm，5µm）流动相：乙腈-水(40：60)柱温：40℃流速：0.9ml·min-1目前二十八页\总数六十八页\编于二十三点色谱条件筛选图5色谱柱：AgilentXDB-C18柱（4.6×150mm，5µm）流动相：乙腈-水(32：68)柱温：40℃流速：1.0ml·min-1目前二十九页\总数六十八页\编于二十三点色谱条件筛选图6色谱柱：AgilentXDB-C18柱（4.6×150mm，5µm）流动相：乙腈-水(32：68)柱温：40℃流速：1.0ml·min-1目前三十页\总数六十八页\编于二十三点色谱条件筛选图7色谱柱：DikmaDiamonsilTM（钻石）C18柱(4.6×250mm,5µm)流动相：乙腈-水(40：60)柱温：40℃流速：1.0ml·min-1前延峰目前三十一页\总数六十八页\编于二十三点色谱条件选择情况汇总表色谱柱流动相不同流速（ml·min-1）下的对照品溶液色谱峰分离情况不同流速（ml·min-1）下的供试品溶液色谱峰分离情况0.91.01.20.91.01.2AgilentXDB-C18柱（4.6×150mm，5µm）乙腈-水(40：60)峰形对称；目标峰与相邻峰分离度大于1.5，保留时间适中峰形对称；目标峰与相邻峰分离度大于1.5，保留时间适中DikmaDiamonsilTM（钻石）C18柱（4.6×250mm，5µm）乙腈-水(40：60)峰形对称；目标峰与相邻峰分离度大于1.5，tR＞10min峰形对称；目标峰与相邻峰分离度大于1.5，tR＞10minAgilentXDB-C18柱（4.6×150mm，5µm）乙腈-水(32：68)峰形对称；目标峰与相邻峰分离度大于1.5，tR＞10min峰形对称；目标峰与相邻峰分离度大于1.5，tR＞10minDikmaDiamonsilTM（钻石）C18柱（4.6×250mm，5µm）乙腈-水(32：68)峰形较对称；目标峰与相邻峰分离度大于1.5，tR＞10min峰形较对称；目标峰与相邻峰分离度大于1.5，tR＞10min目前三十二页\总数六十八页\编于二十三点因此，可以选择AgilentXDB-C18柱（4.6×150mm，5µm）、以乙腈-水(32：68)为流动相，流速为1.0ml·min-1进行后续试验。目前三十三页\总数六十八页\编于二十三点实施二：供试品前处理方法的选择1.供试品溶液的制备精密量取本品10ml，置分液漏斗中，加水10ml，摇匀，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次20ml，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水5ml使溶解，放冷，通过D101型大孔吸附树脂柱，以水50ml洗脱，弃去水液，再用A％乙醇30ml洗脱，弃去洗脱液，继用B％乙醇50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，即得。目前三十四页\总数六十八页\编于二十三点2.提取分离条件的确定收集上述水液和各拟弃去的乙醇洗脱液，蒸干，加甲醇适量使溶解，得溶液C按照上述色谱条件分别进样20µl，记录色谱峰面积。目前三十五页\总数六十八页\编于二十三点各拟弃去的乙醇洗脱液蒸干，加甲醇适量使溶解，得溶液C水液30%40%50%60%70%80%95%黄芪甲苷峰检出情况未检出未检出检出量较小检出量较大检出量最大未检出未检出未检出目前三十六页\总数六十八页\编于二十三点试验结果表明：（1）弃去的水液中目标物无损失；（2）当A=40，即采用40%乙醇洗脱时，目标物有损失；（3）当B=60，即继续采用60%乙醇洗脱时，则目标物洗脱不完全。因此确定A%、B%的最佳值分别为：30%、70%，并以此值确定的提取分离条件进行后续方法学的验证。目前三十七页\总数六十八页\编于二十三点实施三：线性关系的确定取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇溶解并稀释至8个系列浓度,分别进样10µl，测定峰面积，以对照品浓度X(mg•ml-1)的lg值为横坐标，峰面积积分值Y的lg值为纵坐标进行线性回归，得回归方程：

Y=0.1819X+1.9515r=0.9992目前三十八页\总数六十八页\编于二十三点工作曲线评价：结果表明黄芪甲苷在76.560～255.20µg•ml-1范围内线性关系良好。目前三十九页\总数六十八页\编于二十三点实施四：精密度试验取同一供试品溶液，在上述色谱条件下重复进样6次，每次10µl，测得黄芪甲苷色谱峰峰面积平均值为978.57883，RSD为0.5%。目前四十页\总数六十八页\编于二十三点进样次数峰面积峰面积平均值RSD（%）1977.09442978.578830.52980.079413975.409004986.095835976.362926976.43140目前四十一页\总数六十八页\编于二十三点评价：精密度良好，达到预期目标。目前四十二页\总数六十八页\编于二十三点实施五：重复性试验取同一批号样品，制备6份供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液10μl、20μl，供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定峰面积值，以外标两点法对数方程计算，即得黄芪甲苷的含量。目前四十三页\总数六十八页\编于二十三点重复性试验结果试验次数含量（mg•ml-1）含量平均值（mg•ml-1）RSD（%）10.1234380.1223571.20.12196820.1233660.12376830.1238620.12227040.1211760.12373450.1211650.11947860.1209460.123113目前四十四页\总数六十八页\编于二十三点评价：重复性试验RSD为1.2%，达到预期目标。目前四十五页\总数六十八页\编于二十三点实施六：稳定性试验取同一供试品溶液，于0、2、4、6、12、14h分别精密吸取10µl注入液相色谱仪分析，测得峰面积值，计算RSD。目前四十六页\总数六十八页\编于二十三点稳定性试验结果进样时间（h）峰面积峰面积平均值RSD（%）01071.514771069.388771.821064.4517841077.6015661053.73657121098.48413141043.48083目前四十七页\总数六十八页\编于二十三点

评价：上述结果表明供试品溶液在14h内稳定性良好。目前四十八页\总数六十八页\编于二十三点实施七：方法回收率试验

精密吸取已知含量同一批号样品5ml，6份，分别精密加入已知浓度的对照品溶液5ml，制备溶液，分别进样10µl，测得峰面积值，计算平均回收率和RSD。目前四十九页\总数六十八页\编于二十三点回收率测定结果（n=6）取样量（ml）样品含量（mg）加入量（mg）测得量（mg）回收率（%）平均值（%）RSD（%）50.8219550.52701.3168893.9196.761.911.3248795.4350.8219550.52701.3455599.351.3418698.6550.8219550.52701.3305796.511.3396498.2350.8219550.52701.3352697.401.3371497.7650.8219550.52701.3218994.861.3219794.8850.8219550.52701.3432198.911.3241195.29目前五十页\总数六十八页\编于二十三点评价：平均回收率为96.76%，RSD为1.91%，表明方法准确度良好，可以用于本品的定量分析。目前五十一页\总数六十八页\编于二十三点评价1.初步评价建立了黄芪精中黄芪甲苷含量测定的新方法，方法学研究符合《中国药典》2005年版（一部）附录“中药质量标准分析方法验证指导原则”。目前五十二页\总数六十八页\编于二十三点2.综合评价

取本品3批，将两法的含量测定结果进行对比。目前五十三页\总数六十八页\编于二十三点批号含量（mg•ml-1）相对平均偏差（%）TLCS法平均值HPLC-ELSD法平均值TLCS法HPLC-ELSD法060313010.133960.1393240.1304560.1352832.60.70.1332480.127400.1381040.139324060314010.152920.1585610.1441870.1512221.91.20.1442410.147310.1578980.158561060315010.148710.1541390.1454340.1496721.80.70.1460540.143720.1530620.154139目前五十四页\总数六十八页\编于二十三点目前五十五页\总数六十八页\编于二十三点评价：采用HPLC-ELSD法测定黄芪精中黄芪甲苷含量比采用TLCS法测定时的相对平均偏差小，测定的结果较理想。目前五十六页\总数六十八页\编于二十三点八.效果检查1.效果验证取不同批号的黄芪精，依法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样10µl，测得峰面积值，并计算黄芪甲苷含量。10批样品含量测定结果见下表。目前五十七页\总数六十八页\编于二十三点10批样品含量测定结果（n=4）批号含量（mg•ml-1）含量平均值（mg•ml-1）相对平均偏差（%）060102010.1573570.1586401.10.1565360.1602440.160424060120010.1554750.1555660.60.1556130.1539920.157184060202010.1634490.1643911.40.1611400.1659520.167023目前五十八页\总数六十八页\编于二十三点批号含量（mg•ml-1）含量平均值（mg•ml-1）相对平均偏差（%）060203010.1523720.1525030.50.1513820.1527150.153544060204010.1433190.1428430.80.1435370.1405860.143930060204020.1326390.1327960.40.1321470.1335680.132828目前五十九页\总数六十八页\编于二十三点批号含量（mg•ml-1）含量平均值（mg•ml-1）相对平均偏差（