研究生分子生物学2

研究生分子生物学演示文稿目前一页\总数六十五页\编于二十二点研究生分子生物学目前二页\总数六十五页\编于二十二点中心法则：遗传信息从DNA传递给RNA，再由RNA决定蛋白质的合成，以及遗传信息从DNA复制传递给DNA的规律。复制DNARNA蛋白质（性状）转录翻译复制逆转录表观遗传目前三页\总数六十五页\编于二十二点复制DNARNA蛋白质（性状）转录翻译复制逆转录主要的分子生物学调控水平：转录水平调控转录后水平调控翻译水平调控翻译后水平调控表观遗传水平调控主要是针对核酸进行操作主要是针对蛋白质进行操作表观遗传目前四页\总数六十五页\编于二十二点一、核酸研究方法1.基因克隆方法cis-elementuntranslationalregion(UTR)exonintron5’UTR3’UTR真核生物mRNA3’非翻译区(UTR)可以调节转录本的稳定性和翻译水平，决定某一特定mRNA的命运，是许多基因表达所必需的一个调节区。翻译水平的调控是真核基因表达调控的重要环节。近年来的研究表明，许多真核基因的翻译依赖于RNA5’端非翻译区(UTR)的结构元件。目前五页\总数六十五页\编于二十二点134562gDNA134562134562ab134562134562cDNAcda,mutantcomplementation,overexpressionb,seldomlyusedc,overexpression,mutantcomplementation,especiallyindifferentspeciesd,proteinbiosynthesisinprokaryotesoreukaryotes,overexpression目前六页\总数六十五页\编于二十二点PrimerPremier5和Oligo6可以在下载，primer3的主页位置在。引物设计注意事项1.

引物的长度一般为15-30bp，最好在18~24bp，太短或太长会降低特异性，并且降低产量；2.引物的特异性，避免非特异扩增；3.一对引物的Tm值不能相差太大；4.避免形成稳定的引物二聚体和发夹结构。利用PCR方法克隆序列已知的基因是最简易的方法。设计引物的区段选择；GC含量的确定；自由能的控制等模板？目前七页\总数六十五页\编于二十二点1.1.1脱氧核糖核酸（DNA）的提取1.1核酸的提取I.材料准备II.破碎细胞或胞膜－内容物释放

III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质

V.核酸溶解在适量缓冲液或水中目前八页\总数六十五页\编于二十二点

SDS法SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；

CTAB法组份Tris-HCl（pH8.0）

EDTA（pH8.0）

NaClSDS终浓度10mM20mM0.4M2%CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。

组份Tris-HCl（pH8.0）

EDTA（pH8.0）NaClCTABPVP40β-巯基乙醇

终浓度100mM20mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入目前九页\总数六十五页\编于二十二点Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；（TE溶解的好处）NaCl

提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。目前十页\总数六十五页\编于二十二点蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等）多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，加入1/10体积的5MNaAc，高盐可溶解多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA。多酚的去除：加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基乙醇、二硫苏糖醇等。加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合盐离子的去除：70％的乙醇洗涤。目前十一页\总数六十五页\编于二十二点目前十二页\总数六十五页\编于二十二点主要方法有：CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法，SDS(十二烷基磺酸钠)法，异硫氰酸胍法，LiCl沉淀法，TRIzol试剂法等。TRIzol的主要成分是苯酚，主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了异硫氰酸胍、8-羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。1.1.2核糖核酸（RNA）的提取目前十三页\总数六十五页\编于二十二点目前十四页\总数六十五页\编于二十二点chloroformRNAsolutionpellet目前十五页\总数六十五页\编于二十二点RNA质量评价盐离子残留重要吗？基因组的问题？？目前十六页\总数六十五页\编于二十二点qRCR中：反转录过程中：将影响逆转录酶的活性，最后影响逆转录结果目前十七页\总数六十五页\编于二十二点2.电泳检测：应该至少观察到28S和18S两条清晰的电泳条带。且28S条带的亮度约为18S亮度的两倍。目前十八页\总数六十五页\编于二十二点改善RNA提取质量的十大要点1.液氮瞬间冷冻样品，减少内源RNase对RNA的降解。2.使用正确的细胞或组织储存条件

在样品用液氮瞬间冻结之后，应该储存在-80度，千万不能解冻。即使是置于含有胍盐的裂解液中作匀浆前的短暂解冻，也会导致RNA的降解和损失。3.彻底匀浆样品

细胞或组织的彻底匀浆对RNA提取来说，是一个很关键的步骤，它能够防止RNA的损失和降解。4.在RNA提取之前预处理样品裂解液

对于某些样品（脑、脂肪、植物酚类和多糖等）来说，在匀浆之后，RNA提取之前，还需要一些额外的处理步骤。目前十九页\总数六十五页\编于二十二点5.选择合适的RNA提取方法。6.DNase处理

如果提取的RNA将用于RT-PCR，一定要用RNase-free的DNase处理RNA样品以去除残留的DNA污染。

7.减少环境RNase的污染

为了得到完整的、高品质RNA，在整个RNA制备过程中，当RNA离开强蛋白变性剂（如裂解液或酚）的保护时，避免引入新的RNase污染就非常关键。由于RNase几乎是无所不在，所以必须确保与RNA接触的每一试剂或容器都是无RNase污染的。必须保证一直使用无RNase的吸头、离心管和溶液，手套也应经常更换，提取RNA的环境应干净整洁，实验人员应避免说笑打闹。目前二十页\总数六十五页\编于二十二点8.正确的沉淀：异丙醇：室温；乙醇：-20度。若是低浓度的RNA，沉淀时加入共沉剂。9.重悬

许多RNA提取步骤的最后一步是溶解纯化的RNA沉淀。理想的重悬溶液应该满足3点要求：无RNase污染、较低的pH值（pH6-7）、含有螯合剂，以保护RNA不受带入的RNase的降解。

10.储存

如果只是短期储存，重悬的RNA应放置于-20度；如果是长期储存的话，就应该放置于-80度。尽管重悬于水或缓冲液中的RNA也可以储存在-80度，但保存于醋酸铵/乙醇溶液中的RNA沉淀则更加稳定。我们推荐将RNA溶液分装在几支管中。这会避免反复冻融损伤RNA，并预防偶然的RNase污染。

目前二十一页\总数六十五页\编于二十二点0.3mlabsoluteethanolRT,3min4℃,2000g,5min1.5mlisopropylalcoholRT,10min4℃,12000g,10minDNApelletproteinpelletPowerfulTRizol目前二十二页\总数六十五页\编于二十二点gDNA134562134562ab134562134562cDNAcdSequenceunknowngene?RACEandmap-basedclonning目前二十三页\总数六十五页\编于二十二点

核酸的定向改造重叠PCR（Overlap-PCR）的重要应用解决问题：定点突变片段的缺失或者添加片段连接PCR所获得的片段的5’和3’端的序列完全取决于引物的性质！e.g.引物中的酶切位点问题；菌液PCR过程中的退火温度；目前二十四页\总数六十五页\编于二十二点体外的定点突变（突变位点以星号表示）1.Tm值2.引物设计3.聚合酶的选择目前二十五页\总数六十五页\编于二十二点基因的体外定点缺失目前二十六页\总数六十五页\编于二十二点基因的体外定点添加目前二十七页\总数六十五页\编于二十二点4.启动子的获得与活性分析启动子：一段能被RNA聚合酶特异性识别和结合，能正确有效的起始转录的一段DNA调控序列，一般位于基因5端上游区域。真核生物具有三种RNA聚合酶，而RNA聚合酶Ⅱ型启动子在真核生物中最为常见，也最为复杂。目前二十八页\总数六十五页\编于二十二点A.物种全基因组测序成功或者启动子被分离的基因

PCR扩增启动子（长度？位置？）B.启动子未被分离的基因

a.Tail-PCRb.反向PCR4.1启动子的分离：目前二十九页\总数六十五页\编于二十二点a.TAIL-PCR:ThermalasymmetricinterlacedPCR热不对称交错PCR华南农业大学刘耀光教授发明目前三十页\总数六十五页\编于二十二点目前三十一页\总数六十五页\编于二十二点简并引物，退火温度低，结合能力强巢式引物，退火温度高，配合使用富集靶片段能力强PCR过程退火温度高低交错出现，形成超循环：既保证了简并引物的结合，又照顾了巢式引物的特异性。目前三十二页\总数六十五页\编于二十二点目前三十三页\总数六十五页\编于二十二点目前三十四页\总数六十五页\编于二十二点目前三十五页\总数六十五页\编于二十二点Tail-PCR电泳结果分析：由于巢式引物设计的原则是逐渐内缩的，故第三轮PCR产物大小比第二轮产物大小稍小。测序第三轮扩增的PCR产物，比对分析即可获得部分启动子。目前三十六页\总数六十五页\编于二十二点已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶连接酶反向PCR示意图

用反向的引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。b.反向PCR关键：1.限制酶的选择；2.连接酶的利用（强化自连接）目前三十七页\总数六十五页\编于二十二点4.2启动子的分析：4.2.1Reportergenemethod(报告基因法)promoterreporter作为报告基因的要求：1.表达产物在受体细胞中不存在，即无背景；2.其表达产物易于进行定性定量测定。GUS

、GFP、LUC目前三十八页\总数六十五页\编于二十二点GUS(glucuronidase，β-葡萄糖苷酸酶)：

GUS基因由大肠杆菌E．coli菌株K12中uidA基因座编码。该酶是一种外切水解酶，能催化多种β，D葡萄糖苷酸类物质水解为D-葡萄糖醛酸和糖苷配基。由于在绝大多数动植物的细胞内不存在内源的GUS活性，而且GUS基因表达产物具有检测方法简单、灵敏度高、易于定量及定位分析、可以与其他蛋白质基因融合等优点，使得GUS基因成为近年来在动植物基因工程研究中应用最为广泛的报道基因之一。用不同的β-葡萄糖苷类物质作底物，发展了不同的分析GUS活性方法，如组织化学定位法、分光光度法、荧光法、聚丙烯酰胺凝胶原位分析法等。目前三十九页\总数六十五页\编于二十二点组织化学定位法GUS组织化学定位的酶作用底物是5-溴4-氯-3-吲哚葡萄糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolylglucuronide，简称X-Gluc)。这一底物能够在酶活性位点形成蓝色沉淀物。GUS作用于X-Gluc的初始产物为无色的吲哚衍生物，经过氧化二聚化作用形成不溶解的5，5’-二溴-4，4’-二氯的靛蓝色物质，使得具有GUS活性的部位呈现蓝色。X-Gluc目前四十页\总数六十五页\编于二十二点GUS染色方法GUS染色液：0.1MPBS0.5mMK3[Fe(CN)6]0.5mMK4[Fe(CN)6]10mMEDTA0.1%(v/v)TritonX-10010%(v/v)MeOH0.1%(w/v)X-Gluc(v/v)(溶于DMSO中)1.材料90%丙酮中，冰浴15-20min；2.在不含X-gluc的染色液中漂洗3次，每次5min；3.加入GUS染色液，抽真空5-10min4.37℃，染色12-16h；5.70%EtOH脱色30min，absoluteEtOH脱色；6.观察，拍照。169a目前四十一页\总数六十五页\编于二十二点

组织化学定位法能够一目了然地观察到GUS在植物具体的细胞和组织部位中的活性，这就为GUS基因用于研究基因在植物中表达的具体部位提供了很好的研究手段。由于GUS酶和产物非常稳定，在植物中可以积累，而且通常GUS在翻译后不会被修饰，因而不能真实地反映出GUS替代的那个蛋白质在稳定状态下的丰度。组织化学定位方法是基因表达的定性检测，不能够定量检测。目前四十二页\总数六十五页\编于二十二点GUS活性测定GUS荧光分析法分析时以4-甲基伞形酮酰-β-D-葡萄糖苷酸(4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide，简称4-MUG)为底物，GUS酶催化其水解为4-甲基伞形酮(4-methylumbelliferone,简称4-MU)及β-D-葡萄糖醛酸。4-MU分子中的羟基解离后在365nm的光激发下产生455nm的荧光。荧光分光光度计需依据不同浓度的标准物4-MU绘制的标准曲线进行定量。4-MUG4-MUGUS目前四十三页\总数六十五页\编于二十二点步骤：1.蛋白质提取：

0.1-0.5g材料，液氮研磨，加入3X体积的提取液，研成匀浆；匀浆转移入离心管中，4000g，离心10min，取上清。2.酶反应：

100ul蛋白提取液加入900ul37℃预热的GUS反应液中，混匀立即取出100ul，加入到含有900ul反应终止液(0.2M/LNaCO3)的离心管中，作为空白对照，反应管37℃反应15min后，取出100ul加入终止管中(900ul)，进行荧光测定。蛋白质提取液：50mMPBS10mMEDTA10mMβ-ME(BME)0.1%TritonX-1000.1%sarcosyl(肌氨酸)1mM/L4-MUGGUS反应液目前四十四页\总数六十五页\编于二十二点3.蛋白质含量测定：考马斯亮蓝G-250法或者利用核酸蛋白测定仪测定。4.酶活力计算：

利用样品的荧光信号强度，根据标准曲线，计算出15min内生成的4-MU的量(nM或者uM)，从而计算出单位蛋白质溶液中(mg)GUS活性。反应时间生成的4-MU的量×GUS活性=蛋白质含量×稀释倍数目前四十五页\总数六十五页\编于二十二点1962年Shimomura等首先从多管水母中分离出一种分子量为20kD的蛋白。由于水母整体荧光及提取的蛋白质颗粒荧光都呈绿色，因此，人们将这种蛋白命名绿色荧光蛋白。

GFP的发光中心是由Ser65-Tyr66-Gly67三个氨基酸残基经过环化、脱氢后形成的咪唑环。GFP这种坚实的结构保证了其稳定和抗热、抗变性的特点。GFP的真正的发光部位为咪唑环上的阴离子酚,Tyr66的脱质子(酚盐)和质子化状态(羟酚基)的转换决定荧光发射。目前四十六页\总数六十五页\编于二十二点GFP在分子生物学上的应用1

基因表达水平差异

GFP基因连接到目的基因的启动子之后，通过测定GFP的荧光强度就可以对该基因的表达水平进行检测。目前，此方法无论在农杆菌介导或基因枪介导的植物遗传转化中还是在活细胞、转基因胚胎和动物中都已得到非常广泛的应用，特别是在活细胞基因表达的时空成像方面。

CK8℃，12h8℃，24hGhDREB1pro::GFP目前四十七页\总数六十五页\编于二十二点

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GFP作为融合标签

GFP最成功的一类应用就是把GFP作为标签融合到主体蛋白中来检测蛋白质分子的定位、迁移以及分子间的相互作用;其表达产物既保持了外源蛋白的生物活性，又表现出与天然GFP相似的荧光特性。目前四十八页\总数六十五页\编于二十二点Luciferase(荧光素酶)荧光素酶是自然界中能够产生生物荧光的酶的统称，目前研究得最透彻的荧光素酶是来自Photinini族萤火虫中的北美萤火虫(Photinuspyralis)，其分子量为62KD，由551个氨基酸组成的单链特异蛋白质(clonedin1985)。

luciferin目前四十九页\总数六十五页\编于二十二点荧光素+ATP荧光素化腺苷酸（luciferyladenylate）+PPi

荧光素化腺苷酸+O2

氧荧光素+AMP+荧光

luciferin

自1986-1987年首次被当作报告基因使用以来，荧光素酶基因已成为目前运用最广泛的报告基因之一。目前五十页\总数六十五页\编于二十二点LUC用途:1.组织表达模式研究Promoter::LUC2.诱导表达模式研究在正向遗传学筛选突变体的过程中常用到LUC作为筛选的报告基因。目前五十一页\总数六十五页\编于二十二点1.荧光素酶易被蛋白酶降解，半衰期约为3h;2.发光反应衰减迅速，将细胞裂解液加入反应液后5S内必须读取吸光值；3.荧光素见光易氧化，已稀释未用的荧光素应丢弃。LUC检测注意事项目前五十二页\总数六十五页\编于二十二点4.2.2启动子中的顺式作用元件分析：

生物信息学预测在启动子顺式作用元件分析中有重要作用；但是并不是所用的预测都是准确的，相应顺式作用元件的作用还应通过实验验证。目前五十三页\总数六十五页\编于二十二点目前五十四页\总数六十五页\编于二十二点如何验证预测得到的順式作用元件真正的发挥作用？

缺失分析：对启动子中的关键区域进行缺失，并进行组合，从而分析不同组合之间的启动子活性的关系，以此来确定真正发挥作用的顺式作用元件的方法。目前五十五页\总数六十五页\编于二十二点凝胶迁移实验（EMSA）：Invitro这些順式作用元件是如何发挥作用的？

通过特定反式作用因子与对应的顺式作用元件相结合，调节启动子的活性。怎样验证反式作用因子与順式作用元件的结合？

酵母单杂交（Y1H）：Invitro染色质免疫共沉淀（ChIP）：Invivo目前五十六页\总数六十五页\编于二十二点酵母单杂交（Y1H）：Invitro1993年，由Wang和Reed等创立发展出的一种研究蛋白质和DNA互相作用的实验体系。该体系也可用来钓取反式作用因子的目标靶序列。目前五十七页\总数六十五页\编于二十二点靶序列整合到酵母基因组中目前五十八页\总数六十五页\编于二十二点FalsePositive目前五十九页\总数六十五页\编于二十二点ElectroMobilityShiftAssay

凝胶迁移实验（gel-shiftexperiment）又叫凝胶阻滞实验（gelretardationassay）或DNA迁移率变动分析（DNAmobilityshiftassay），它是在80年代初期出现的用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术，它具有简单、快捷等特点，也是当前被选作检