基因组分析和医学应用

基因组分析和医学应用第一节基因组学基础人类基因组人类基因组特点基因(Gene)是遗传的物质基础，是DNA或RNA分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列的总称，是控制遗传性状的基本遗传单位。1909年丹麦学者WL.约翰森提出了基因这一名词。基因组(Genome)泛指一个生命有机体、病毒或细胞器的全部遗传物质；在真核生物，基因组是指一套染色体(单倍体)DNA。基因组(genomes)一词是1920年Winkles从GENes和chromosOMEs组成的。基因组学(Genomics)是研究基因组结构和功能的科学。具体指发展和应用DNA制图、测序新技术以及计算机程序，分析生命体(包括人类)全部基因组结构和功能o1986年美国科学家ThomasRoderick提出了基因组学(Genomics)人类基因组特点•人类基因组单倍体约含有3x109个碱基对。•由线性DNA与蛋白质组成染色体结构。•含有大量重复顺序。基因组中大约只有2%-5%为编码序列，约含3万个基因。•单拷贝基因(占基因组50-80%)多数只在分化细胞中翻译为专一蛋白质，如胰岛素基因在胰岛p细胞表达。因为这些基因只在极少数细胞甚至只在生物发育的某个阶段才表达，所以它们在基因组上所占的份额只需单拷贝即能满足生理需要。•多拷贝基因(约1/3)是一些与生物的基本功能密切相关的基因，如组蛋白基因、tRNA基因等，只有多拷贝才能满足生理需要。基因家园垒基因组结构复杂，有多个复制原点，但每个复制子的长度较小。垒基因是不连续的。垒转录单位一般是单顺反子。即一个基因一种mRNA一种蛋白质，但蛋白质的最终产物可因剪接方式的不同而有差异(如Bcl-x：Bcl-x1；Bcl-xs)o垒存在重复序列。Kpnl家族：人和灵长类DNA经Kpnl酶解后，产生4个片段(1.2,1.5,1.8,1.9kb)，被命名为Kpnl家族。人类基因组中Kpnl序列约在3-6%，散在分布。Alu家族：有3万个成员，平均每6kb就有一个，长度约300bp，因在170bp处有一AluI位点(AG/CT)而得名，具有种的特异性。存在多基因家族(multigenefamily)：亦称基因家族，是指一组具有类似功能，核苷酸序列又有同源性的基因。些存在超基因家族(supergenefamily):由多基因家族及单基因组成的更大的基因家族。成员间有不同程度的同源，但功能并不相似。如Ig超家族。基因组学分类结构基因组学(structuralgenomics):通过基因作图、核苷酸序列分析确定基因组成、基因定位的科学。功能基因组学(functionalgenomics)：利用结构基因组学提供的信息，进行基因和非基因序列功能的研究。比较基因组学(comparativegenomics)：比较不同生物间基因和基因组结构的差异，以增进对基因功能的了解、阐明物种进化关系。第二节人类基因组计划人类基因组计划(humangenomeproject,HGP)一项多国合作的国际研究计划，旨在阐明人类基因组DNA3X109bp的序列，发掘所有人类基因，确定其在染色体上的位置，从而破译人类的全部遗传信息°HGP还对包括大肠杆菌、酵母、线虫、果蝇、拟南芥和小鼠等在内的一系列模式生物体基因组的测序。人类基因组计划目的•阐明人类基因组30亿个碱基对的序列，发现所有人类基因，并搞清其在染色体上的位置•破译人类全部遗传信息，使人类第一次在分子水平上全面地认识自我；•解码生命、了解生命的起源、了解生命体生长发育的规律；•认识种属之间和个体之间存在差异的起因、认识疾病产生的机制以及长寿与衰老等生命现象、为疾病的诊治提供科学依据。人类基因组计划的历程人类基因组计划的任务1）人类基因组的基因图构建与序列分析（遗传图谱、物理图谱、序列图谱、基因图谱）2）人类基因的鉴定3）基因组研究技术的建立4）人类基因组研究的模式生物（细菌、酵母菌、线虫、果蝇、小鼠、拟南介）的基因组5）生物信息学的建立6）有关的伦理、法律和社会问题研究HGP研究成果与医学人类基因组约有3.1Gbp，约有30000多个基因，目前已经发现和定位了26000多个功能基因，，其中尚有42%的基因尚不知道功能。基因数量比预期少很多。人与人之间基因组99.99%是相同的，差异仅万分之一，不存在优秀基因组之说。不存在白种人基因组、黄种人基因组。发现了大约一百四十万个单核苷酸多态性SNP，并进行了精确的定位，初步确定了30多种致病基因人类基因组中存在“热点”和大片“荒漠”。19号染色体是含基因最丰富的染色体，而13号染色体含基因量最少。男性的基因突变率是女性的两倍人类基因组中大约有200多个基因是来自于插入人类祖先基因组的细菌基因人类基因组编码的全套蛋白质（蛋白质组）比无脊椎动物编码的蛋白质组更复杂在染色体上有基因成簇密集分布的区域，也有大片的区域只有—无用DNA”——不包含或含有极少基因的成分。基因组上大约有1/4的区域没有基因的片段。35.3%的基因包含重复的序列。编码序列：仅占基因组的5%基因组重复序列：基因组的36%包含重复序列，19号染色体57%区为重复序列，重复序列占整个基因组的50%以上。插入重复、反转录后整合的假基因、简单重复、片段性重复、串联重复。人类基因组与黑猩猩的相似性达到96%，约有4000万碱基对差异，多位于非功能区，仅有300万对bp位于功能基因区。例如黑猩猩缺乏人类的50个基因，其中3个与炎症有关。人类缺乏黑猩猩的1个基因。人类基因组与黑猩猩的基因组核苷酸序列差异约在编码序列中差异小于1.5%，非编码区差异小于3%。个别非编码区差异较大，如着丝粒区。奇异的Y与X人类Y染色体的进化速度比其他染色体快。与黑猩猩的Y染色体有约30%的区别，远高于人类其它遗传密码与黑猩猩2%的区别。3亿年前，Y与X染色体一样。但是3亿年的进化使Y越来越小，基因越来越少（1500-78genes）。由于在男性性腺外露，易受外界环境影响，经历的减数分裂次数比X染色体多350倍，而每次都是有变异风险的，从父亲传到儿子，Y染色体要有600个碱基的变化，所以Y染色体受的遗传影响比任何染色体都多。占Y染色体在减数分裂时，只有其端部和X染色体可以配对重组，导致基因的变化、丢失机会增大。JY染色体上存在许多回文序列，占Y染色体的10%,睾丸发育基因、精子产生基因位于此处。其上的基因在回文序列两端存在2个拷贝，可以自身交换、重组，或内部基因转变，用此方式进行基因的修复。早女性多一条X染色体，失活的那条X染色体上的15%的基因仍在活动，还有10%为异质性失活逃逸。中国对人类基因组计划的贡献•1994年，我国HGP在吴旻、强伯勤、陈竺、杨焕明的倡导下启动，最初由国家自然科学基金会和863高科技计划的支持下，先后启动了“中华民族基因组中若干位点基因结构的研究'和“重大疾病相关基因的定位、克隆、结构和功能研究'；•1998年在上海成立了南方基因中心；•1999年在北京成立了北方人类基因组中心；•1999年7月在国际人类基因组注册，得到完成人类3号染色体短臂上一个约30Mb区域的测序任务，该区域约占人类整个基因组的1%。国际人类基因组测序任务分配情况承担人类3号染色体测序，仅占整个基因组的1%。识别出122个基因，在已知的86个基因中，55个基因功能明确，8个与肾细胞癌、肌肉萎缩贫血等疾病有关在31个基因中找到75种不同的剪接方式，其中一个基因可以产生8种蛋白质，发现最大的基因88万bp，两个最小的基因，仅编码21个氨基酸和110个氨基酸。•建立了肿瘤、心血管病、神经、免疫、遗传性疾病材料收集网络。高血压家系200个，糖尿病家系88个。•建立了较完整的基因组研究体系。我国北京华大基因组研究中心为世界上第六大基因测序中心。•疾病基因、功能基因研究。肝病相关基因、造血系统基因、肿瘤相关基因神经疾病相关基因等。•建立了生物信息和基因组信息库。•完成了一些模式生物的基因组计划。如：籼稻基因组4.66亿bp。人类基因组计划展望人类基因组计划完成之后，进入“后基因组时代”1）绘制基因组遗传整合图（单体型图），寻找不同人群之间、不同人之间的差异，建立“个人医学”。2）功能基因组学，对基因组进行功能研究，对非编码区进行基因调控功能的研究。3）比较基因组学，揭示生命起源，解决生物进化的重大问题。例如:比较人类与细菌的基因组，筛选出仅在细菌中存在的基因，成为新的抗菌素药靶。第三节基因组学研究范畴结构基因组学（structuralgenomics）：通过基因作图、核苷酸序列分析确定基因组成、基因定位的科学。功能基因组学（functionalgenomics）：利用结构基因组学提供的信息，进行基因和非基因序列功能的研究。比较基因组学（comparativegenomics）：比较不同生物间基因和基因组结构的差异，以增进对基因功能的了解、阐明物种进化关系。结构基因组学遗传图谱又称连锁图谱（linkagemap）通过遗传重组所得到的基因线性排列图。通过计算连锁遗传标志之间的重组频率，确定相对距离。它是以具有遗传多态性（在一个遗传位点上具有一个以上的等位基因，在群体中的出现频率皆高于1%）的遗传标记为“路标”，以遗传学距离（在减数分裂事件中两个位点之间进行交换、重组的百分率，1%的重组率称为1cM）为图距的基因组图。遗传连锁图:通过计算连锁的遗传标志之间的重组频率，确定它们的相对距离，一般用厘摩（cM，即每次减数分裂的重组频率为1%)表示。第1代标记：经典的遗传标记，•ABO血型位点标记，•HLA位点标记。•限制性片段长度多态性(RFLP)，用限制性内切酶特异性切割DNA链，由于DNA的一个“点”上的变异所造成的能切与不能切两种状况，可产生不同长度的片段(等位片段)可用凝胶电泳显示多态性，从片段多态性的信息与疾病表型间的关系进行连锁分析，找到致病基因。如Huntington症。•第2代标记1985年，小卫星中心(mini-satellitecore)、可变串联重复VNTR(variablenumberoftandemrepeats)可提供不同长度的片段，其重复单位长度为6~12个核苷酸，1989年微卫星标记(microsatellitemarker)系统被发现和建立，重复单位长度为2~6个核苷酸，又称简短串联重复(STR)。•第3代标记1996年Lander提出了SNP(singlenucleotidepolymorphysm)的遗传标记系统。对每一核苷酸突变率为10-9,双等位型标记，在人类基因组中可达到300万个，平均约每1250个碱基对就会有一个。3~4个相邻的标记构成的单倍型(haplotype)就可有8~16种。物理图谱-iaia路标与路轨物理图谱是指有关构成基因组的全部基因的排列和间距的信息，它是通过对构成基因组的DNA分子进行测定而绘制的。绘制物理图谱的目的是把有关基因的遗传信息及其在每条染色体上的相对位置线性而系统地排列出来。•把庞大的DNA先“敲碎”，再拼接。以Mb、kb、bp作为图距，以DNA探针的STS(sequencetagssite)序列为路标。构建物理图的一个主要内容是把含有STS对应序列的DNA的克隆片段连接成相互重叠的“片段重叠群(contig)”。用“酵母人工染色体(YAC)作为载体的载有人DNA片段的文库已包含了构建总体覆盖率为100%、具有高度代表性的片段重叠群”，近几年来又发展了可靠性更高的BAC、PAC库或cosmid库等。转录图谱iaja生命的乐谱•转录图谱是在识别基因组所包含的蛋白质编码序列的基础上绘制的结合有关基因序列、位置及表达模式等信息的图谱。在人类基因组中鉴别出占具2%~5%长度的全部基因的位置、结构与功能，最主要的方法是通过基因的表达产物mRNA反追到染色体的位置。•作图方法：连锁分析/关联分析：也叫等位基因关联、连锁不平衡。指同一染色体上位点间紧密连锁的基因，在同一配子中某些等位基因的组合频率增加。如红绿色盲基因。•其原理是：所有生物性状和疾病都是由结构或功能蛋白质决定的，而已知的所有蛋白质都是由mRNA编码的，这样可以把mRNA通过反转录酶合成cDNA或称作EST的部分的cDNA片段，也可根据mRNA的信息人工合成cDNA或cDNA片段，然后，再用这种稳定的cDNA或EST作为“探针”进行分子杂交，鉴别出与转录有关的基因。用PolyA互补的寡聚T或克隆载体的相关序列作为引物对mRNA双端尾侧的几百个bp进行测序得到EST(表达序列标签)。•转录图谱的意义：在于它能有效地反应在正常或受控条件中表达的全基因的时空图。通过这张图可以了解某一基因在不同时间不同组织、不同水平的表达；也可以了解一种组织中不同时间、不同基因中不同水平的表达，还可以了解某一特定时间、不同组织中的不同基因不同水平的表达。序列图谱随着遗传图谱和物理图谱的完成，测序就成为重中之重的工作。DNA序列分析技术是一个包括制备DNA片段化及碱基分析、DNA信息翻译的多阶段的过程。通过测序得到基因组的序列图谱。大规模测序基本策略运用计算机软件进行序列拼接功能基因组学(functionalgenomics)又称为后基因组学(postgenomics)，它利用结构基因组所提供的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使得生物学研究从对单一基因或蛋白质的研究转向多个基因或蛋白质同时进行系统的研究。-人类基因组DNA序列变异性研究-基因组表达调控的研究-模式生物体的研究-生物信息学功能基因组学J基因的识别、鉴定和克隆J基因的结构与功能及相互关系J基因的表达调控基因组表达及调控的研究-在全细胞的水平，识别所有基因组表达产物：-mRNA：cDNA阵歹U-蛋白质：二维电泳一质谱-研究生物大分子相互作用：阐明基因组表达在发育过程中的时、空的整体调控网络。-蛋白质组学：高通量解析蛋白质的高级结构，是连接基因组功能研究和新药开发的桥梁。比较基因组学(ComparativeGenomics)是基于基因组图谱和测序基础上，对已知的基因和基因组结构进行比较，来了解基因的功能、表达机理和物种进化的学科。比较基因组学的产生伴随着基因组的研究，相关信息出现了爆炸性增长，迫切需要对大量基因组数据进行处理，比较基因组学作为一门重要的工具学科应运而生。比较基因组学是通过对系统发育中的代表性物种之间的全方位基因和基因家族的比较分析，构建系统发育的遗传图谱，来揭示基因、基因家族的起源和功能及其在进化过程中复杂化和多样化的机制。比较基因组学研究内容•研究生命是从哪里起源的？•生命是如何进化的？•遗传密码是如何起源的？•估计最小独立生活的生物至少需要多少基因，这些基因是如何使它们活起来的？•鼠和人的基因组大小相似，都含有约三十亿碱基对，基因的数目也类似。可是鼠和人差异确如此之大，这是为什么？•不同人种间基因组的差别仅为0.1%；人猿间差别约为1%。但他们表型间的差异十分显著。这又为什么？比较基因组学的应用•揭示非编码功能序列•发现新基因•发现功能性SNP•阐述物种间的进化史•阐明人类疾病过程的分子机制第四节基因组学与医学研究基因与疾病关系主要目的确定致病基因或疾病易感基因；阐明这些基因的功能和在疾病发生发展中的作用机制；指导临床诊断、治疗和预后的实践。从遗传-环境-表型的复杂关系中归纳出一些有规律性和特征性的性质，如突变类型、修饰基因、表观遗传、多基因作用、基因组不稳定性等等，为临床诊断提供可靠指标，为疾病治疗特别是个体化治疗提供新靶点和新思路，为疾病预测、预防和预后提供依据。基因组学在医学中的应用一、发现新的致病基因二、复杂疾病的早期基因诊断方法，如肿瘤基因组解剖计划、遗传病诊断。三、基因治疗四、疾病易感基因的识别及对风险人群进行生活方式、环境因子的干预五、人类基因多样性与个体化医学疗“基因病”:»基因相关论：所有疾病都与人类基因有关；»基因修饰论：所有药物都是通过修饰基因本身结构、改变基因的表达调控、影响基因产物的功能而起作用的；»基因的外调性：基因的表达受外界因素的调节，如地理气候、食物、生活方式等环境影响；»基因的多态性：人类基因组的多样性、个体特异性，决定了人对疾病或病原的易感性或抵抗力。基因病分为三大类一、单基因病：由单个基因突变引起的一类疾病。如：血友病、地中海贫血等。二、多基因病：由多个基因突变综合作用引起的疾病。如：恶性肿瘤、高血压、动脉硬化、糖尿病、先天畸形等、三、获得性基因病：指外源基因（DNA）侵入，在机体产生疾病，一旦将其清除便可痊愈。如：艾滋病及各种微生物感染病。单基因病：是指某种疾病的发生主要由一对等位基因的一个或两个基因位点存在缺陷而引起，其遗传方式遵循孟德尔遗传规律。»囊性纤维化：常染色体隐性遗传»镰型红细胞贫血症：常染色体隐性遗传»亨廷顿舞蹈病：常染色体显性遗传»杜兴氏肌营养不良：X染色体连锁隐性遗传•相关治病基因的鉴定，需要确定家族性疾病并加以描述和检测。•定位克隆和定位候选克隆，导致了亨廷顿舞蹈病、遗传性结肠癌等一大批单基因遗传病致病基因的发现，为这些疾病的基因诊断和基因治疗奠定了基础。•多基因疾病这类疾病发病的基因机制涉及一个以上的等位基因以及基因与环境因素的相互作用。包括心血管疾病、肿瘤、糖尿病、神经精神类疾病（老年性痴呆、精神分裂症）自身免疫性疾病等。1997年相继提出了广肿瘤基因组解剖计划i土和i°环境基因组学计划i土。-获得性基因病：这类疾病由病原微生物感染引起，不符合孟德尔遗传规律。疾病相关基因的鉴定•染色体制图定位及疾病相关基因克隆•疾病相关基因表达谱筛选及疾病相关基因网络的确定•SNPs筛选二基因诊断•感染性疾病的基因诊断•遗传病的基因诊断•复杂性疾病的基因诊断（例如：肿瘤）基因诊断的基本策略1、检测已知的能产生某种特定功能蛋白的基因，这些基因根据其特定功能已被克隆，并被定位在染色体上，基因序列亦被测定，致病时的基因改变亦较清楚。如：已被克隆的病毒、细菌、霉菌和寄生虫的基因、与致病有关的癌基因、抗癌基因、地中海贫血、苯丙酮尿症等遗传病基因。2、检测与某种遗传标志连锁的致病基因遗传连锁一一同一染色体相邻的二个或二个以上的基因或限制性酶切位点，由于位置十分靠近，在遗传时分离几率很低，常一起遗传------称连锁。染色体遗传连锁图一一用限制性内切酶酶切位点作遗传标志，定位与之相连锁的正常基因与致病基因，建立相应的遗传连锁图谱。定位性克隆一一根据遗传连锁图进行定位性克隆。比较正常和异常基因的差别，可找出导致遗传病的分子缺陷。定位性克隆策略是当前基因诊断的重要基础。3、检测表型克隆基因该策略既不需预先知道基因的生化功能或图谱定位，也不受基因数目及其相互作用方式的影响。针对多基因病（如：重度肥胖、哮喘、高血压、癫痫、精神病、多种自身免疫性疾病）。表型克隆技术一一是将有关表型与基因结构结合，直接分离该表型的相关基因，并对疾病相关的一组基因进行克隆，然后用作多种探针，来诊断多基因遗传病。方法：1、DD-RT-PCR：分析正常和异常基因组寻找两者之间的差异序列2、基因组错配筛选技术：寻找两者的全同序列，分离、鉴定与疾病相关的基因，确定导致疾病的分子缺陷基因诊断的临床应用：1、在感染性疾病检测中应用1、病原微生物2、病毒如：HIV,非典型性肺炎（SARS）3、寄生虫4、不易体外培养的病原体（毒性大肠杆菌、麻风分枝杆菌）5、实验室培养的病原体（克立氏体）艾滋病与HIV病毒艾滋病由HIV通过接触、血液、血制品及母婴传播感染所致。HIV特异地侵犯辅助性T细胞（CD4），引起人体细胞免疫严重缺陷，导致顽固的机会性感染，恶性肿瘤和神经系统损伤°HIV感染后，95%感染者5个月可检出抗体（也有3-4年仍不能检出抗体）。有必要进行PCR技术检测。2、在遗传病检测中的应用产前诊断检测妊娠8-12周的绒毛DNA或羊水细胞PCR诊断一系列遗传疾病镰刀状细胞贫血的诊断方法：一RFLP诊断MstII酶切识别序列：CCTNAGG切割正常8链序列：CCTGAGG不切割突变序列：CCTGTGG-ASO探针诊断在肿瘤检测中的应用原癌基因生物正常细胞基因中编码关键性调控蛋白的癌基因，Ras,myc抑癌基因一类抑制细胞增殖的基因，其失活可引起细胞转化。P53,Rb……两类基因协同调控，使细胞生长处于平衡状态。法医学鉴定免疫组化筛选基因诊断的常用技术•核酸分子杂交•聚合酶链反应（PCR）•限制性片段长度多态性（RELP）•扩增片段长度多态性（AFLP）•等位基因特异的寡核苷酸（ASO）•单链构象多态性（SSCP）•基因芯片三、基因治疗（genetherapy）将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因缺陷和异常基因引起的疾病，达到治疗目的。导入的基因可以与缺陷基因对应、在体内表达具有特异功能的同源基因、也可以是与缺陷基因无关的治疗基因。概念的扩展：凡是采用分子生物学方法原理，将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，达到治疗目的的方法，都可称为基因治疗。基因治疗策略总原则：----直接补替缺陷基因一一抑制非正常基因产物表达一一间接调节机体本身免疫系统的抗病能力。一一利用外源基因对病变细胞造成特异性杀伤1、基因矫正：将致病基因的碱基进行纠正，而正常部分予以保留。2、基因置换：用正常基因通过体内基因同源重组，原位置换病变细胞内的致病基因，使细胞内的DNA完全恢复正常3、基因增补：将目的基因导入病变细胞或其它细胞，不去除异常基因，而是通过目的基因的非定点整合，使其表达产物补偿缺陷基因的功能或使原有功能得以加强。4、基因失活：利用反义技术特异封闭基因表达，抑制有害基因的表达。5、免疫调节：将抗体、抗原或细胞因子的基因导入病人体内，改变病人免疫状态，达到预防和治疗的目的。6、调节性基因治疗：导入编码调控蛋白的基因，治疗基因表答异常的疾病7、化疗保护性基因治疗：导入单相或多相细胞毒性药物的抗性基因，提高正常细胞耐受化疗药物的能力8、特异性细胞杀伤性基因治疗：利用DNA重组技术构建特异性杀伤靶细胞为目标的“导弹”，“弹头”部分是分子重组的各种生物细胞毒素，它们以酶催化方式发挥抑制蛋白合成作用，造成细胞杀伤。9、生殖细胞基因治疗：生殖细胞或胚胎干细胞补偿性治疗四易感基因与危险人群对环境因素损害敏感的那部分人群称为高危险人群，在同一污染环境中，高危险人群比正常人出现健康危害早而且程度也严重。在任何居民群体中都有高危险人群，而且所有的健康人，在其一生的不同年龄段，不同环境条件下，都有某一时间处于高危险状态的可能。不同个体对环境有害因素易感性存在差异。决定某个体对某种疾病易感性的基因称为易感基因(susceptibilitygene)。若遗传易感性程度达到100%，表明该基因型在发病过程中起主要作用，亦即遗传因素起决定性作用，单基因遗传病属于这种情况。若遗传易感性程度低于100%，大于50%，表明该基因型在发病过程中起重要作用，但环境因素也在其中起到重要作用。若遗传易感性程度低于50%，则表明环境因素在发病过程中起的作用比遗传因素(基因型)为大。多基因遗传病属后两种情况。疾病易感基因筛查、鉴定和克隆策略：-候选基因筛查策略(candidategenestrategy)阶段；-基因组定位扫描(genome-wildscanning)阶段；-基因组关联研究(genome-wildassociationstudy,GWAS)阶段。目前国际上对数十种人类最常见的多基因复杂性状疾病如冠心病、高血压、糖尿病、癌症、精神神经性疾病、骨质疏松症，肥胖…….进行了GWAS，鉴定出众多候选的疾病易感基因。例：肿瘤的易感基因基因组不稳定性会造成一些基因激活而另一些基因失活，呈现出各种基因表达谱的变化。所有参与癌发生发展过程的基因是构成细胞癌变和肿瘤发生发展的易感性要素，故称为癌易感基因。目前已知有2类癌易感基因：主效基因和微效基因。高外显率、高危险度的癌易感基因为主效基因这类易感基因多半是由对家族性癌胚系遗传突变的分析所得。目前发现的这类癌易感基因有视网膜母细胞瘤的RB1、乳腺癌的BRCA1和BRCA2、结肠癌的APC、8-联蛋白(8-catenin)、Cowden综合征的PTEN、VonHippelLindeu综合征的VHL以及50多种肿瘤的TP53等。这些基因数量少，外显率高，危险度高。相对而言，在家族性乳腺癌中，这类易感基因被研究的较多。家族性乳腺癌在所有乳腺癌中只占5%〜10%的比例，因此，即使找到了所有家族性乳腺癌易感基因，最多也只能发现乳腺癌(包括家族性癌和散发癌)全部易感基因中5%〜10%；其他大部分易感基因是由与环境因素相互作用所形成，通常表现为低外显率和低危险度，属于微效易感基因。低外显率、低危险度的癌易感基因为微效基因体细胞突变是散发癌发生的基础。体细胞突变的特点是发生可遗传的基因组不稳定性。结构(序列)异常改变，如单核苷酸突变、微卫星不稳定性、基因组拷贝数增加或减少，基因扩增、重排和缺失，染色体杂合性丢失(LOH)和纯合性丢失；表观遗传或表基因组效应。一般而言，体细胞突变所形成的癌易感基因属于低外显率、低危险度基因，与散发癌发生相关，它们与环境因素作用紧密相关，涉及不同的信号转导途径和不同类型的基因。五、基因多样性和个体医疗•基因多样性(基因多态性)代表生物种群之内和种群之间的遗传结构的变异。每一个物种包括由若干个体组成的若干种群。各个种群由于突变、自然选择或其他原因，往往造成遗传上的差异。这些遗传差别使得有机体能在局部环境中的特定条件下更加成功地繁殖和适应。不仅同一个种的不同种群遗传特征有所不同，即存在种群之间的基因多样性；在同一个种群之内也有基因多样性——在一个种群中某些个体常常具有基因突变。基因突变与基因多态性突变(mutation)DNA永久的结构改变。在大多数情况下，这样的DNA变化或者没有影响或者导致伤害，但是有时突变能改善生物体生存的机会，将有利的突变传给后代。基因的多态性(genepolymorphism)在人群中，个体间基因的核苷酸序列存在着差异性称为。这种多态性可以分为两类，即DNA位点多态性(sitepolymorphism)和长度多态性(lengthpolymorphism)0位点多态性•:・是由于等位基因之间在特定的位点上DNA序列存在差异，也就是基因组中散在的碱基的不同，包括点突变(转换和颠换)，单个碱基的置换、缺失和插入。突变是基因多态性的一种特殊形式，单个碱基的置换又称为单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)。♦:♦SNP的频率在1/1000-2/1000，数量巨大，分布频密，检测易于自动化和批量化，被认为是新一代的遗传标记。・♦・严格来说,只有当等位基因的频率大于或等于1%时才能称得上是SNP。长度多态性♦:♦一类为可变数目的重复序列(variablenumberoftandemrepeats,VNTRS)，它是由于相同的重复顺序重复次数不同所致，它决定了小卫星(minisatellite)DNA长度的多态性。小卫星是由15-65bp的基本单位而成，重复次数在人群中是高度变异的。・♦・另一类长度多态性是由于基因的某一片段的缺失或插入所致，如微卫星DNA(microsatellite)，它们是由重复序列构成，基本序列只有1-8bp,如(TA)n及(CGG)n等，通常重复10-60次。・♦・长度多态性是按照孟德尔方式遗传的，它们在基因定位、DNA指纹分析，遗传病的分析和诊断中被广泛地应用。基因多态性的生物学意义(1)遗传密码的改变：错义突变(missensemutation)、无义突变(nonsensemutation)、同义突变(samesensemutation)、移码突变(frame-shiftingmutation)对mRNA剪接的影响：如果点突变发生在内含子的剪切位点，可以产生两种影响：一是原有的剪接位点消失，二是产生新的剪切位点。导致mRNA的错误剪接，产生异常的mRNA，最终产生异常的表达产物。蛋白质肽链中的片段缺失：无义突变和DNA片段的缺失都可以导致肽链中的片段缺失，致使基因编码的蛋白质失去原有的功能。移码突变不仅翻译后的肽链中氨基酸序列发生改变，而且也导致肽链中的大片段缺失。启动子的突变及非转录区的突变：可以使基因的转录水平或活性增强或降低。基因多态性的医学意义＞在预防医学方面，基因多态性的研究涉及的范围广泛，包括基因多态性与病因未知的疾病关系的研究，也包括对已知特定环境因素致病易感基因的筛选。因此开展我国人群的基因多态性与环境的作用关系的研究具有重要的意义。＞在职业病医学中。对易感基因和易感性生物标志物的分析，将某些携带敏感基因型的人甄别开来，采取针对性预防措施，提高预防职业性危害工作的效率。对特定的污染物易感人群和耐受人群的基因多态性研究，有助于阐明环境因素的致病机制，也推动了遗传易感性标志物的研究。1应激蛋白及其基因多态性与疾病易感性的关系热休克蛋白(heatshockproteins,HSPs)的多态性与疾病或机体遭受应激的易感性或耐受性有关。2癌基因、抑癌基因多态性与疾病易感性的关系3代谢酶基因多态性与疾病易感性的关系P450家族中存在的基因多态性使不同基因型携带个体对特定的外源化合物代谢能力不同，由此造成个体在环境因素暴露引起的健康损害存在易感性的差异。4修复基因多态性与疾病易感性的关系在外来有害因素作用下会导致机体细胞内DNA出现碱基错配、插入、缺失等结构改变，而人体内的基因修复酶可通过不同机制帮助机体修复这些错误，保护人体健康，相反如果修复基因出现突变以致修复酶功能缺陷可与某些疾病的发生有关。如：MED1是一种碱基切除修复酶，能够直接或间接地帮助细胞修复癌症对基因的损害。因此对修复基因多态性进行研究有助于深入了解某些疾病的发生、发展机制并可采取有效措施如：对高危险人群进行筛选等对相关疾病进行预防。基因多态性的检测方法DNA水平遗传多态性标记物的研究已经历了三个阶段。1限制性片段长度多态性标记(RFLP)，这是第一代DNA遗传标记，是D.Botstein于1980年提出的。RFLP的原理：如果存在DNA的多态性，会使DNA分子的限制酶切位点及数目发生改变，用限制酶切割基因组时，所产生的片段数目和每个片段的长度就不同，即所谓的限制性片段长度多态性。最早是用SouthernBlot/RFLP方法检测，现在多采用PCR-RFLP法进行研究基因的限制性片段长度多态性。随机扩增多态性DNA(RAPD)2DNA重复序列的多态性标记重复序列的多态性有小卫星DNA多态性和微卫星的DNA多态性等多种。3第三代DNA遗传标记——SNP其分析的经典方法是采用PCR-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析、RFLP、温度梯度凝胶电泳(TGGE)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、变性高效液相色谱(dHPLC)和高通量基因芯片技术(HA)等。个体化医疗(PersonalizedMedicine)•个体化用药，就是药物治疗因人而异、量体裁衣，在充分考虑每个病人的遗传因素(即药物代谢基因类型)、性别、年龄、体重、生理病理特征以及正在服用的其它药物等综合情况的基础上制定安全、合理、有效、经济的药物治疗方案。根据患者的基因结构特别是发生变异的基因结构，有针对性地选择药物和给予适合患者的剂量，这种用药模式称为基因导向性用药模式。4候选基因的选择要有明确的病理生理学基础。5当确定某一候选基因多态性与疾病的发生、发展有肯定的联系后，应进行“复核验证”。即根据初步研究中所得出的结论在“散发”病例的观察中进行验证。•基因多样性是进化材料。具有较高基因多样性的种群，可能有某些个体能忍受环境的不利改变，并把它们的基因传递给后代。环境的加速改变，使得基因多样性的保护在生物多样性保护中占据着十分重要的地位。基因多样性提供了栽培植物和家养动物的育种材料，使人们能够选育具有符合人们要求的性状的个体和种群。•个体化医疗(PersonalizedMedicine)通过对基因多态分析，例如SNPs与疾病和药物治疗的关联性分析，使得医生不仅可以通过所检测出的遗传变异来预测、确定与疾病有关的基因，同时也将能够事先把握患者个体对于某种药物的反应特点，并根据这一特点选择治疗效果最好、不良反应等危险性最小的药物进行准确的治疗。对生物技术的影响♦基因工程药物：分泌蛋白(多肽激素，生长因子，趋化因子，凝血和抗凝血因子等)及其受体；♦诊断和研究试剂产业：基因和抗体试剂盒、诊断和研究用生物芯片、疾病和筛药模型；♦对细胞、胚胎、组织工程的推动：胚胎和成年期干细胞、克隆技术、器官再造。♦转基因食品和转基因药物.筛选新药和药物的靶点，分析药理过程。.进行药物设计，对基因蛋白产物的高级结构分析、预测、模拟药物作用i°口袋i土。.个体化的药物治疗：药物基因组学。根据基因的特性为某个群体或个人设计药物。第五节基因组学新技术基因组学技术进展测序新技术转录组学表观基因组学外显子组学经典方法包括Sanger双脱氧链终止法(Sanger和Coulson1977)Maxam-GilbertDNA化学降解法(Maxam和Gilbert,1977)新技术包括＞新技术方法杂交测序法＞质谱法＞单分子测序法»原子探针显微镜测序法＞流式细胞仪测序法＞大规模平行实测法、DNA芯片法转录组学转录组是转录后的所有mRNA的总称(mRNA,smallRNA,andNONcodingRNA.)。转录组学(transcriptomics)就是在基因组学后新兴的一门学科，即研究细胞在某一功能状态下所含mRNA的类型与拷贝数。-转录组谱可以提供什么条件下什么基因表达的信息，并据此推断相应未知基因的功能，揭示特定调节基因的作用机制。-通过这种基于基因表达谱的分子标签，不仅可以辨别细胞的表型归属，还可以用于疾病的诊断。表观基因组学表观遗传学现在成为了肿瘤研究中的热点问题。肿瘤的形成都伴随着DNA甲基化和组蛋白的修饰异常。全基因组的低甲基化(hypomethylation)，抑癌基因启动子CpG岛高度甲基化(hypermethylation)，众多关键基因的组蛋白密码被改变，以及组蛋白H4去已酰化和三甲基化，这些都是肿瘤细胞异常表观遗传谱的明显特征。外显子组学•外显子组是指全部外显子区域的集合，该区域包含合成蛋白质所需要的重要信息，涵盖了与个体表型相关的大部分功能性变异。•外显子组序列捕获及第二代测序是一种新型的基因组分析技术:外显子序列捕获芯片可在同一张芯片上以高特异性和高覆盖率捕获研究者感兴趣的目标外显子区域，后续利用Solexa/SOLiD/Roche454测序直接解析数据。与全基因组重测序相比，外显子组测序只需针对外显子区域的DNA即可，覆盖度更深、数据准确性更高，更加简便、经济、高效。可用于寻找复杂疾病如癌症、糖尿病、肥胖症的致病基因和易感基因等的研究。第六节人类基因组研究的伦理问题•基因组计划创建了一个科学环境，在一定程度上导致了医学思维模式的变化。P4医学(预测、预防、个性化和参