基因知识点整理

重组DNA技术指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。基因工程指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。基因工程的两个基本特点：分子水平上的操作和细胞水平上的表达。基因工程的意义：⑴大规模生产生物活性物质⑵设计、构建生物的新性状甚至新物种⑶分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源。基因工程的基本条件：A核酸操作的工具酶：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、核酸酶、核酸修饰酶。B用于基因克隆的载体：载体的功能及特征、质粒、噬菌体或病毒DNA、考斯质粒与噬菌粒、人造染色体载体C用于基因转移的受体菌或细胞：受体细胞应具备的条件、各种基因工程受体的特性、实验室常用的基因工程受体限制性核酸内切酶的生物功能：识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链。主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵细菌的限制与修饰作用。限制性核酸内切酶的类型：主要特性I型II型III型限制修饰多功能单功能双功能蛋白结构异源三聚体同源二聚体异源二聚体辅助因子ATPMg2+SAMMg2+ATPMg2+SAM识别序列TGAN8TGCT旋转对称序列GAGCCAACN6GTGCCAGCAG切割位点距识别序列1kb处识别序列内或附近距识别序列下游随机性切割特异性切割24-26bp处II型限制性核酸内切酶的基本特性:识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列，大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧，识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构。II型限制性核酸内切酶的切割方式：平头末端5’粘性末端3’粘性末端II型核酸内切酶的多酶联合酶解：对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：（1）使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解（2）低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切（3）一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切影响限制性核酸内切酶活性的因素：（A）DNA样品的纯度（B）DNA样品甲基化程度（C）限制性核算内切酶缓冲液性质（D）酶的纯度（E）DNA分子的构型（F）酶的反应温度和时间载体：基因工程中携带外源基因进入受体细胞的“运载工具”，本质是DNA复制子。载体的功能：运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件载体应具备的条件（特征）：具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点具有较高的外源DNA的载装能力具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有合适的筛选标记质粒：生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。质粒常见于原核细菌和真菌中，绝大多数的质粒是DNA型的，绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA。质粒DNA的分子量范围：1T00kb质粒的基本特征：（1）质粒的自主复制性：质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系。根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严紧型复制控制的质粒1-3拷贝，松弛型复制控制的质粒10-60拷贝（2）质粒的不相容性：任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质粒组成不相容性群质粒的不相容性：分子机制⑴两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内。⑵两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。（3）质粒的可转移性：革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：⑴接合型质粒。能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等。⑵非接合型质粒。不能在天然条件下独立地发生接合作用，如Col、R的其它成员（4）携带特殊的遗传标记：野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：⑴物质抗性一抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物⑵物质合成一抗生素、细菌毒素、有机碱。这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义理想质粒载体的必备条件（1）较小的分子质量和较高的拷贝数（2）若干限制性核酸内切酶的单一酶切位点：多克隆位点（multiplecloningsite,MCS）:载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制性内切酶的酶切位点的DNA片段（3）具有两种以上的选择性标记基因（4）缺失mob基因（5）插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：高拷贝质粒、低拷贝质粒、温敏质粒、测序质粒、整合质粒、穿梭质粒、表达质粒、探针质粒质粒DNA的分离（提取）纯化方法：氯化艳密度梯度离心法：质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、漠乙锭污染沸水浴法：质粒DNA纯度底、快速、操作简便碱溶法：质粒DNA纯度、操作周期介于氯化艳法和沸水浴法之间核酸的提取纯化可分为三大步骤：⑴细胞的破碎⑵除去与核酸结合的蛋白质及多糖脂等杂质⑶除去其它杂质核酸，获得均一的样品提取纯化核酸方法：（一）化学试剂提取法1、CTAB法CTAB（十六烷基三乙基漠化铵）是一种去污剂，可溶解细胞膜，能与核酸形成复合物，在高盐溶液（0.7mol/L）中是可溶的，降低盐浓度（0.3mol/L），核酸析出。优点：（1）能很好的去除糖类杂质，适用于含糖量的材料（2）能同时得到高质量DNA和RNA2、SDS法SDS法：利用高浓度的SDS（十二烷基磺酸钠）在较高温度（55〜65°C）下裂解细胞，使染色体离析、蛋白质变性、释放出核酸，提高盐浓度和降低温度沉淀蛋白质和多糖。（二）离心分离法1、超速离心2、凝胶电泳核酸的检测（一）核酸的浓度检测1、紫外分光光度法：测定DNA在A260nm的光吸收值A260X稀释倍数x50=gg/ml（A值等于1时，相当于50gg/ml双链DNA，40gg/ml单链DNA或RNA，33gg/ml单链寡核苷酸）紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25ug/ml的核酸溶液。2、荧光光度法：荧光染料漠化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。适用于低浓度核酸溶液的定量分析（1-5ng）（二）核酸的纯度检测紫外分光光度法：在260nm和280nm处测定DAN溶液的光吸收，纯的DNA，低于此值表明制备物中留有蛋白质成份，高于此值表明有RNA的残留量。A260与A280之比应在1.80；纯的RNAA260与A280之比应在2.0。A260/A280比值是纯度检测的重要指标！（三）完整性检测1凝胶电泳法基因组DNA电泳，在电场中泳动慢，如果发生降解，可出现电泳图谱脱尾现象总RNA电泳，观测各条带的含量提示是否存在RNA降解；如加样槽中存在条带，可能是DNA污染。☆琼脂糖凝胶电泳原理琼脂糖是一种天然聚合长链状分子可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳的参数1、缓冲液：TAE（40mol/LTris-乙酸、1mmol/LEDTA）TBE（90mol/LTris硼酸、1mmol/LEDTA）2、凝胶的含量：根据检测的DNA大小3、加DNA样品：＜1gg，指示剂4、电泳条件：大片断低电压长时间，小片段高电压短时间5、染色和观察：EB染色，在300nm波长的紫外下观察能看到0.05m的微量DNA琼脂糖凝胶电泳作用：检测纯度、浓度、完整性核酸的保存（一）DNA的保存1、短期保存4°C或-20°C存放于TE（Tris和EDTA）缓冲液中。TE缓冲液的PH与DNA贮存有关，PH为8时，可减少DNA脱氨反应，PH低于7.0时DNA容易变性。2、长期保存TE缓冲液中-70C保存数年（在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染）（二）RNA的保存RNA可溶于0.3mol/L的醋酸钠溶液或双蒸水，在-70C保存。RNA可溶于70%的乙醇溶液或去离子的甲酰胺溶液中，可在-20C保存。RNA如果以DEPC（焦碳酸二乙酯）可以抑制RNA酶对RNA的降解2、核酸操作的基本技术有哪些？①核酸提取与纯化②核酸的检测与保存③核酸的凝胶电泳④核酸分子杂交3、影响核酸保存的关键因素是什么？怎样保存核酸制品？关键因素：①保存液的酸碱度②保存温度保存方法：①一般保存可用浓盐液，NaCL-柠檬酸缓冲液或0.1mol/L醋酸缓冲液。②对DNA来说，在pH4〜11的范围分子的碱基较稳定，超出此范围DNA易变性或降解，低温、稀碱下保存DNA及低温下保存RNA均较稳定。③固态核酸通常在0C以上低温干燥保存即可。4、合成cDNA第二链的主要策略有哪些？①自身引导合成法②置换合成法③PCR合成法④快速扩增cDNA末端法⑤双链cDNA末端的处理⑥cDNA与载体的连接5、基因工程诞生的理论基础是什么？是现代分子生物学领域理论上的三大发现和技术上的三大发明。理论上的三大发现:①证实了DNA是遗传物质②揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理③遗传密码的破译和遗传信息传递方式的确定技术上的三大发明:①限制核酸内切酶的发现与DNA切割②DNA连接酶的发现与DNA片段的连接③基因工程载体的研究与应用什么是a-互补筛选？质粒载体具有8-半乳糖苷酶基因（lacZ），当外源DNA插入到它的lacZ，可造成表达后的8-半乳糖苷酶失活，利用这一点就可以通过大肠杆菌转化子菌落在添加有X-gal-IPTG培养基中的颜色变化鉴别出重组子和非重组子。有些大肠杆菌上带有lacZ基因的部分编码序列，质粒载体中含有别一部分编码序列，当质粒转入载体后，可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ基因上缺失了一部分编码序列的突变体与带有这一部分编码序列的突变体之间实现互补的现象叫a互补。目的基因的克隆方法：鸟枪法、cDNA法、PCR法、化学合成法、基因文库的构建PCR法（获得外源基因的方法一）：PCR（PolymeraseChainReaction）法，又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物PCR反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。PCR技术的原理变性：在加热或碱性条件下可使成单链DNA，称之为变性退火：是模板与引物的复性，引物是与模板某区序列互补的一小段DNA片段。延伸：从结合在特定DNA模板上的引物为出发点，将四种脱氧核苷酸以碱基配对形式按5’—3’的方向沿着模板顺序合成新的DNA链。引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一条引物与目的区域一端的一条DNA模板链互补，另一条引物与目的区域另一端的另一条DNA模板链互补。引物的重要性在整个PCR体系中，引物占有十分重要的地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA特异性结合，不与其他非目的DNA结合；PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸，可见引物设计好坏与PCR结果密切相关。引物设计的原则引物长度引物3’端、引物5’端碱基分布的均衡性引物的内部稳定性Tm值引物的保守性与特异性引物二级结构扩增区域的二级结构基因文库：通过克隆方法保存在适当宿主中的某种生物、组织、器官或细胞类型的所有DNA片段而构成的克隆集合体根据构建方法的不同，基因文库分为：（1）基因组文库（含有全部基因）（2）cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）^目前首选的构建方式获得具有功能性的蛋白用鸟枪法构建基因组文库，材料来自染色体DNA用cDNA法构建cDNA文库，材料来自mRNA基因文库的完备性是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概率基因文库构建的基本程序1提取研究对象基因组DNADNA，制备合适大小的DNA片段，或提取组织或器官的mRNA并反转录成cDNA2DNA片段或cDNA与经特殊处理的载体连接形成重组DNA3重组DNA转化宿主细胞或体外包装后侵染受体菌阳性重组菌落或噬菌班的选择载体和受体的选择材料的基因信息的多少来选择?出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的l-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用YAC或BAC载体由于绝大多数真核生物的mRNA小于10kb，因此用于cDNA文库构建的载体通常选质粒载体和受体的选择材料的基因信息的多少来选择?出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的l-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用YAC或BAC载体由于绝大多数真核生物的mRNA小于10kb，因此用于cDNA文库构建的载体通常选质粒基因工程的操作过程：⑴DNA的体外重组（切、接）⑵重组DNA分子的转化和扩增（转、增）⑶转化子的筛选和鉴定（检）DNA的体外重组（切与接）：⑴同种内切酶生产的粘性末端的连接⑵同尾酶生产的粘性末端的连接⑶不同粘性末端的连接⑷粘性末端的更换⑸人工粘性末端的连接（5’突出末端；3’突出末端；平头末端）重组率的定义:重组率=含有外源DNA的重组分子数/载体分子总数。在常规实验条件下，重组率一般为25-75%。重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化DNA重组的后续操作。提高重组率的方法：1.提高外源DNA片段与载体的分子比：5:1-10:1。2.载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团。3.加装同聚尾末端。电穿孔转化：将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内。电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大转化率的定义：转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体DNA转化后，受体细胞接纳DNA的个数，即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长）转化率的用途：利用转化率和重组率等参数可以帮助设计DNA重组实验规模转化率的影响因素：⑴载体及DNA重组分子方面：①载体本身的性质：不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同②载体的空间构象：质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的超螺旋质粒低两个数量级③插入片段的大小：对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低⑵受体细胞方面：受体细胞必须与载体相匹配，例如：PBR322转化大肠杆菌JM83株，转化率很低；但对大肠杆菌ED8767株的转化率则较高⑶转化方法方面：①受体细胞的预处理：影响最大②供受体的比例：Ca2+诱导转化，0.1ml感受态细胞，50ngDNA；原生质体转化，109个原生质体，50ngDNA③转化方法：Ca2+诱导转化106-107/mgDNA，原生质体转化105-106/mgDNA，久DNA转染107-108/mgDNA，电穿孔转化106-109/mgDNA转化细胞的扩增：转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。扩增操作的目的：⑴增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序⑵扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选⑶表达外源基因，便于筛选和鉴定转化子的筛选和鉴定（检）：由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子。⑴直接筛选：DNA鉴定，载体筛选⑵间接筛选：翻译产物，转录产物，其他方法限制性酶切图谱法：所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因此利用这种方法不仅能区分重组子与非重组子，而且还能鉴定目的重组子。但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工作量极大，实验成本也高。克隆DNA序列检测1.菌落噬菌斑原位杂交法2.DNA序列分析法外源基因产物检测蛋白质生物功能测定法2.蛋白质生物结构鉴定法大肠杆菌基因工程菌的构建策略1、包涵体型异源蛋白的表达2、分泌型异源蛋白的表达3、融合型异源蛋白的表达4、寡聚型异源蛋白的表达5、整合型异源蛋白的表达6、蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建包涵体：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地聚集在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体

以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点包涵体表达形式的优点：1）能简化外源基因表达产物的分离操作：包涵体的水难溶性及其密度远大于其他细胞碎片和细胞成分，菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来2）能在一定程度上保持表达产物的结构稳定：在形成包涵体之后，大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本上对异源重组蛋白的稳定性已构不成威胁包涵体表达形式的缺点：以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构想（因而具有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标产物的收率至关重要。然而，这也是一个技术难题，游戏当目标蛋白分子中的半胱氨酸残基数目较高时，体外复性蛋白的成功率相当低，一般不超过30%以分泌形式表达目的蛋白的优缺点分泌表达形式的优点：1）目的蛋白稳定性高重组人胰岛素原若分泌到细胞周质中，其稳定性大约是在细胞质中的10倍2）目的蛋白易于分离3）目的蛋白末端完整相当多的真核生物成熟蛋白N端并不含有甲硫氨酸残基。当这些真核基因在大肠杆菌中表达时，蛋白质N端的甲硫氨酸残基往往不能被切除。如若将外源基因与大肠杆菌的信号肽编码序列重组在一起，一旦分泌型表达，其N端的甲硫氨酸残基便可在信号肽的剪切过程中被有效除去分泌表达形式的缺点：相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全。外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少数外源基因即便能分泌表达，但其表达率通常要比包涵体方式低很多，因此目前用于产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆菌尽管有，但并不普遍蛋白质的分泌机制原核细菌周质中含有多种分子伴侣可阻止分泌蛋白的随机折叠，分泌在细胞周质或培养基中的重组蛋白很少形成分子间的二硫键交联，因此与包涵体相比，分泌型重组蛋白具有较高比例的正确构象，生物活性的回收率增加，且对蛋白酶不敏感以融合形式表达目的蛋白的优缺点目的蛋白稳定性高目的蛋白易于分离度较高的融合蛋白目的蛋白表达率高目的蛋白溶解性好大多具有水溶性目的蛋白需要回收尤其对分子量较小的多肽效果更佳利用受体蛋白成熟的抗体、配体、底物进行亲和层析，可以快速获得纯与受体蛋白共用一套完善的表达元件由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞内形成良好的空间构象，且融合蛋白需要裂解和进一步分离，才能获目的蛋白。在实际生产中，产例的正确构象，生物活性的回收率增加，且对蛋白酶不敏感以融合形式表达目的蛋白的优缺点目的蛋白稳定性高目的蛋白易于分离度较高的融合蛋白目的蛋白表达率高目的蛋白溶解性好大多具有水溶性目的蛋白需要回收尤其对分子量较小的多肽效果更佳利用受体蛋白成熟的抗体、配体、底物进行亲和层析，可以快速获得纯与受体蛋白共用一套完善的表达元件由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞内形成良好的空间构象，且融合蛋白需要裂解和进一步分离，才能获目的蛋白。在实际生产中，产1）受体细胞的结构基因能高效表达，且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化2）外源基因应装在受体蛋白编码基因的下游，为融合蛋白提供终止密码子。在某些情况下，并不需要完整的受体结构基因，目的是尽可能避免融合蛋白分子中两种组份的分子量过于接近，为目的蛋白分离回收创造条件3）两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要，它直接决定着融合蛋白的裂解工艺4）两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架以寡聚形式表达目的蛋白的优缺点1目的蛋白高效表达：在不提高质粒拷贝数的前提下，增加目的基因的拷贝数，可以在一定程度上改善表达量。2稳定表达小分子短肽：短肽由于缺乏有效的空间结构，在细菌细胞中的半衰期较短。串联短肽具有与蛋白质相似的长度及空间结构，因而抗蛋白酶降解的能力大幅度提高。3目的产物回收困难：寡聚短肽需要裂解和进一步分离，才能获最终分子，但裂解后的短肽分子容易出现序列不均一性。以整合形式表达目的蛋白的优缺点1目的基因稳定表达：整合型的目的基因随受体细胞染色体DNA的复制而复制，在大多数情况下相当稳定，工程菌在没有选择压力存在下可以连续培养而不丢失目的基因表达盒，这对以改良物种遗传性状为目的的基因工程案例特别有意义。2目的基因表达率低：单拷贝整合的目的基因表达率受到限制，此时可通过强化表达元件而加以补偿。DNA体内重组的基本原理在生物体细胞尤其是原核细菌细胞内，广泛存在着DNA的遗传重组机制，其可能的生物学功效是促进生物种群的进化。细胞内的遗传重组可分为两大类：1转位因子依赖型2同源序列依赖型：基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制工程菌遗传不稳定性的产生机制1、受体细胞中的限制修饰系统对外源重组DNA分子降解2、外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞产生应激反应：关闭合成途径，启动降解程序产生应激反应：关闭合成途径3、重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配这是重组质粒逃逸的基本原因4、受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排重组质粒的逃逸率当含有重组质粒的工程菌在非选择性条件下生长时，培养系统中一部分细胞不再携带重组质粒，这些空载细胞数与总细胞数之比称为称为重组质粒的“宏观逃逸率”。重组质粒逃逸的原因有：1、高温培养、表面活性剂（SDS）、药物（利福平）、染料（吖啶）促使重组质粒渗漏2、受体细胞中的核酸酶降解重组质粒重组质粒在受体细胞分裂时不均匀分配，细胞所含重组质粒3、拷贝数的差异随着细胞分裂次数的增多而加剧改善基因工程菌不稳定性的策略，改进载体受体系统以增大质粒稳定性为目的的构建方法包括：1、将R1质粒上的parB基因引入表达型载体中，其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞2、正确设置载体上的多克隆位点，禁止DNA片段插在稳定区内3、将受体细胞的致死性基因安装在载体上，同时构建条件致死性的相应受体系统，如大肠杆菌的ssb基因（DNA单链结合蛋白编码基因控制目的基因的过量表达1、使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表达程度2、使用可控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数优化基因工程菌的培养工艺培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定培养温度：较低的培养温度有利于重组质粒的稳定4大肠杆菌作为基因工程受体菌具有哪些特点？真核基因在大肠杆菌中表达存在哪些障碍？特点：大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，基础生物学、分子遗传学等方面的背景知识清楚，对其基因表达调控的分子机理也比较了解，而且历经二十年的基因工程实践，大肠杆菌已发展成为一种安全的基因工程实验体系，有多种适用的寄主菌株和载体系列，大肠杆菌易于进行工业化批量生产。存在的障碍：第一，在大肠杆菌的mRNA的核糖体结合位点上，含有一个起始密码子及16S核糖体RNA3’末端碱基互补序列，即S-D序列，而真核上缺泛这个序列。第二，许多真核基因的蛋白质产物需要经过翻译后的加工修饰，如正确的折叠和组装，而细菌中通常并没有这样的修饰机制，从而可能导致真核基因在大肠杆菌中的翻译产物无法产生有活性的蛋白。第三、外源真核基因所表达的蛋白质分子往往能够被细菌的蛋白酶识别，并被当做“异已分子”降解掉。1如何有效地提高外源基因的表达效率？⑴提高启动子强度⑵缩短启动子同克隆基因间距离⑶高效的翻译起始序列⑷高效的转录终止区⑸提高质粒拷贝数及稳定性⑹用以下方法提高翻译水平：①调整SD序列与AUG间的距离②用点突变的方法改变某些碱基③增加mRNA的稳定性的⑺减轻细胞的代谢负荷：①诱导表达②表达载体的诱导复制⑻提高表达蛋白的稳定性，防止其降解：①克隆一段原核序列，表达融合蛋白②采用某种突变菌株③表达分泌蛋白质试述载体构建一般方法A目的基因分析（1）ORF分析（2）酶切位点分析B载体选择与分析（1）多克隆位点分析（2）抗性标记分析（3）启动子与其他筛选标记分析C连接体系与连接时间确定试述5’RACE技术原理和方法PCR用于扩增代表mRNA转录物某一单位点与其3’或5’末端之间区域的部分cDNA称为快速扩增cDNA末端技术（RACE）。如果已知mRNA的一片段链内短序列，据此或设计基因特异引物，用原先存在的poly（A）尾（3’末端）或附加的同聚尾（5’末端）互补的序列做末端引物，就可以获得从未知末端直到已知区域的部分cDNA序列。为获得5’末端部分cDNA克隆需用基因特异引物，产物第一链产物，可用末端脱氧核苷酸转移酶及dATP加poly（A）尾。通过QT引物