基因与基因工程

基因与基因工程第1页，共73页，2023年，2月20日，星期一生物工程主要有基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程等4个部分。其中基因工程就是人们对生物基因进行改造，利用生物生产人们想要的特殊产品。随着DNA的内部结构和遗传机制的秘密一点一点呈现在人们眼前，生物学家不再仅仅满足于探索、提示生物遗传的秘密，而是开始跃跃欲试，设想在分子的水平上去干预生物的遗传特性。第2页，共73页，2023年，2月20日，星期一基因工程诞生于70年代。自1977年成功地用大肠杆菌生产生长激素释放抑制因子以来，人胰岛素、人生长激素、胸腺素、干扰素、尿激酶、肝火病毒疫菌、口蹄疫疫菌、腹泻疫菌和肿瘤坏死因子等数十种基因工程产品相继问世；1982年开始进入商品市场，在医疗保健和家畜疾病防治中获得广泛应用，并已取得或正在取得巨大的效果和收益。第3页，共73页，2023年，2月20日，星期一第一节基因研究的发展一、基因学说的创立1、Gene的染色体遗传学阶段（50年代前）2、Gene的分子生物学阶段（50年代以后）3、反向生物学第4页，共73页，2023年，2月20日，星期一1、Gene的染色体遗传学阶段(细胞的染色体水平上)孟德尔遗传学规律（1）（G.Mendel）（1857-1864）豌豆杂交试验第5页，共73页，2023年，2月20日，星期一孟德尔曾做过杂交实验的园地第6页，共73页，2023年，2月20日，星期一孟德尔在杂交试验中主要以豌豆作为试验材料，这是因为豌豆是自花传粉植物，而且是闭花受粉，也就是豌豆花在花未开时已经完成了受粉。两性花的花粉，落到同一朵花的雌蕊柱头上的过程叫做自花传粉。豌豆花的结构很适合自花传粉，这是因为花在未受粉前，雄蕊和雌蕊都紧紧地被花瓣包裹着。第7页，共73页，2023年，2月20日，星期一▲每种性状由遗传因子控制，提出遗传因子（Hereditaryfactor）概念第8页，共73页，2023年，2月20日，星期一（2）约翰逊(W.Johannsen丹麦植物学家）（1909）▲首次用基因代替上述“遗传因子”，但仅是遗传性状之符号，无物质概念。第9页，共73页，2023年，2月20日，星期一（3）摩尔根（T.H.Morgan，USA）（1910-1915）果蝇遗传学试验▲将代表某一性状的gene与染色体联系起来，创立了遗传的染色体理论。第10页，共73页，2023年，2月20日，星期一2、Gene的分子生物学阶段（1）确定遗传物质DNA①Avery等(1944)细菌（肺炎球菌）转化试验（从DNA大分子水平上）Watson-Crick：DNA双螺旋模型致病力强的光滑型（S型）肺炎链球菌DNA导致致病力弱的粗糙型（R型）细菌发生遗传转化的实验；第11页，共73页，2023年，2月20日，星期一第12页，共73页，2023年，2月20日，星期一②Hershey及Chase等人（1952）：噬菌体侵染细菌实验第13页，共73页，2023年，2月20日，星期一SummaryoftheHershey-Chaseexperiment.Twobatchesofisotopicallylabeledbacteriophageparticleswereprepared.Onewaslabeledwith32PinthephosphategroupsoftheDNAandtheotherwith35Sinthesulfur-containingaminoacidsoftheproteincoats(capsids).(NotethatDNAcontainsnosulfur,andviralproteinnophosphorus.)Thetwobatchesoflabeledphagewerethenaddedtoseparatesuspensionsofunlabeledbacteria.Eachsuspensionofphage-infectedcellswasagitatedinablendertosheartheviralcapsidsfromthebacteria.Thebacteriaandemptyviralcoats(ghosts)werethenseparatedbycentrifugation.Thecellsinfectedwiththe32P-labeledphagewerefoundtocontain32P,indicatingthatthelabeledviralDNAhadenteredthecells,andtheviralghostscontainednoradioactivity.Thecellsinfectedwith35S-labeledphagewerefoundtohavenoradioactivityafterblendertreatment,buttheviralghostscontained35S.Progenyvirusparticleswereproducedinbothbatchesofbacteriasometimeaftertheviralcoatswereremoved,thusthegeneticmessagefortheirreplicationhadbeenintroducedbyviralDNA,notbyviralprotein.第14页，共73页，2023年，2月20日，星期一（2）将核酸和蛋白质联系在一起的是著名的中心法则第15页，共73页，2023年，2月20日，星期一原核细胞基因编码区（编码序列）：能指导有关蛋白质的合成，即能够编码蛋白质非编码区（调控序列）：位于编码区上游和编码区下游的DNA序列，虽不能指导有关蛋白质的合成，但有调控遗传信息表达的核苷酸序列，如启动子、终止子等（3）基因的结构①原核生物基因结构第16页，共73页，2023年，2月20日，星期一②真核细胞的基因结构真核细胞基因编码区（间隔、不连续）外显子：能编码蛋白质的DNA序列内含子：不能编码蛋白质的DNA序列非编码区：与原核生物具有相似功能的启动子、终止子第17页，共73页，2023年，2月20日，星期一（4）基因表达调控①原核生物中许多基因以操纵子为基础进行调节细菌中许多基因按照功能相关性串联在一起，组成转录单位，受同一个启动子驱动形成多顺反子mRNA。操纵子（operon）——若干个结构基因，共同的启动子及行使一定功能的附加序列（如操纵基因）第18页，共73页，2023年，2月20日，星期一例如：乳糖操纵子结构lacI——调节基因lacO——操纵基因lacZ——

β-半乳糖苷酶基因lacY——透过酶基因lacA——乙酰转移酶基因第19页，共73页，2023年，2月20日，星期一lacIlacPlacOlacZlacYlacA阻遏诱导lacIlacPlacOlacZlacYlacA乳糖第20页，共73页，2023年，2月20日，星期一②真核生物主要是转录水平上的调控，顺式作用元件与反式作用因子之间的相互作用第21页，共73页，2023年，2月20日，星期一3、反向生物学由于基因工程的出现，在生命科学研究中的许多难题，由基因操作下手，往往更为简捷方便。与传统生物学的由表及里不同，而是由生命的核心——基因物质出发，反向而行，这就是反向生物学。例：①研究胰岛素分子的结构功能，可以由基因设计开始，利用基因工程技术做出各种各样结构的胰岛素来，从中可以很快地得到速效胰岛素分子。②把功能还不太清楚的基因引入小鼠，做成特殊的转基因鼠，来研究此基因的功能，或者相反的敲除这个基因来研究其功能。第22页，共73页，2023年，2月20日，星期一第二节基因的现代概念一、转座子1、基本概念：DNA的转座，或称移位（transposition），是由可移位因子（transposableelement）介导的遗传物质重排现象。转座过程中，可移位因子的一个拷贝常常留在原来位置上，在新位点上出现的仅仅是拷贝。因此，转座有别于同源重组，它依赖于DNA的复制，发生的频率低。第23页，共73页，2023年，2月20日，星期一2、分类（1）插入序列（insertionalsequence,IS）表示方法如λ::IS1，是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分，IS序列都是可以独立存在的单元，带有介导自身移动的蛋白。第24页，共73页，2023年，2月20日，星期一特点：①长700-2000bp②末端有倒置重复序列，转座时往往复制宿主靶位点一小段DNA（4-15bp），形成位于IS两端的正向重复③只有一个开放读码框，产生功能型转座酶第25页，共73页，2023年，2月20日，星期一第26页，共73页，2023年，2月20日，星期一（2）复合式转座子（compositetransposon）是一类带有某些抗药性基因（或其他宿主基因）的转座子，其两翼往往是两个相同或高度同源的IS序列，表明IS序列插入到某个功能基因两端时就可能产生复合转座子。一旦形成复合转座子，IS序列就不能再单独移动，因为它们的功能被修饰了，只能作为复合体移动。第27页，共73页，2023年，2月20日，星期一第28页，共73页，2023年，2月20日，星期一3、转座作用机制特点：受体分子中有一段很短的（3-12bp）、被称为靶序列的DNA会被复制，使插入的转座子位于两个重复的靶序列之间。不同转座子的靶序列长度不同，但对于一个特定的转座子来说，它所复制的靶序列长度都是一样的，如IS1两翼总有9个碱基对的靶序列，而Tn3两端总有5bp的靶序列。分类：转座可被分为复制性和非复制性两大类

第29页，共73页，2023年，2月20日，星期一非复制性转座第30页，共73页，2023年，2月20日，星期一复制性转座解离酶在两个转座子拷贝间将转座共整和体分开转座酶在靶位点处切成一个错开的切口，并把转座子末端切开oldnew第31页，共73页，2023年，2月20日，星期一二、断裂基因（interruptedgene）1、概念1977年，Broker和Sharp等发现了不连续基因，现已知道绝大多数真核生物基因都是不连续的，为不编码的序列隔开。2、真核基因必需切除基因中的内含子形成mRNA成熟体，翻译成蛋白质，所以在原核细胞中表达真核基因时，必需构建不含内含子的重组基因。第32页，共73页，2023年，2月20日，星期一提取细胞RNA反转录mRNAcDNAP1P2PCR扩增在E.coil或酵母中表达第33页，共73页，2023年，2月20日，星期一三、假基因（Pseudogene）

G.Jacq（1977）非洲爪蟾5SrRNA基因系统研究提出的功能失活的特殊DNA序列。同正常的gene相比，绝大部分是同源的，但因存在许多突变（插入、缺失等）而阻碍了自身的表达。第34页，共73页，2023年，2月20日，星期一例：重复的假基因特点：与亲本基因连锁，同其编码区及侧翼序列的DNA有很高的同源性。产生的原因可能是由含有亲本基因的染色体区段串联重复形成。第35页，共73页，2023年，2月20日，星期一第36页，共73页，2023年，2月20日，星期一四、重复序列①不重复序列（singlecopysequence,1-3copies）copy数：在单倍体基因组里，这些序列一般只有一个或几个拷贝；含量：占DNA总量的40%－80%；长度：约750－2000bp，相当于一个结构基因的长度；特点：单拷贝基因通过基因扩增仍可合成大量的蛋白质；第37页，共73页，2023年，2月20日，星期一②中度重复序列

（middlerepetitivesequence）copy数：在单倍体基因组里，这些序列一般只有10-104拷贝；含量：占DNA总量的10%－40%；特点：基因拷贝重复，多量

序列相同或相似排列成串

功能相同举例：rDNA,tDNA,Alufamily等第38页，共73页，2023年，2月20日，星期一非洲爪蟾的18S、5.8S及28SrRNA基因是连在一起的，中间隔着不转录的间隔区，这些单位在DNA链上串联重复约5000次。在卵细胞形成过程中这些基因可进行几千次不同比例的复制，产生2×106个拷贝，使rDNA占卵细胞DNA的75%，从而使该细胞能积累1012个核糖体。第39页，共73页，2023年，2月20日，星期一

由于碱基组成的不同，各物种的DNA在CsCl梯度离心中，平衡时的浮力密度决定于G+C的含量，G+C含量高，浮力密度大。故对某一物种来说，其浮力密度曲线是覆盖一定浮力密度范围的一条宽带,高度重复序列中，有一些简单高度重复序列，G+C特别的低或高，故形成比主带略重或略轻的卫星带，叫卫星DNA卫星DNA③高度重复序列（highrepetitivesequence）——卫星DNA第40页，共73页，2023年，2月20日，星期一copy数：在单倍体基因组里，这些序列一般只有105-106拷贝；含量：占DNA总量的10%－60%；特点：基因拷贝多串联重复排列，分布于着丝粒，端粒，结构基因两侧，异染色质的成分，与染色体的稳定有关长度：约6－100bp第41页，共73页，2023年，2月20日，星期一酵母Telomeres一般以100bp左右不精确重复序列所组成。

5’(TxGy)n

3’(AxCy)n

其中X、Y一般为1－4单细胞真核生物中n常为20－100，高等真核生物中>1500。真核生物端粒Telomeres第42页，共73页，2023年，2月20日，星期一散在序列

——重复单位散布在整个基因组的各个地方，中间被编码的DNA间断SINE（短散在序列）：长度小于500bpLINE（长散在序列）：长度在5～7kb第43页，共73页，2023年，2月20日，星期一F.Sanger(1977)ΦX174噬菌体DNA研究中提出的概念同一部分DNA能编码两种不同的蛋白质，不同gene的核苷酸序列有时可以共用，即其核苷酸序列是彼此重叠。修正了关于各个gene的多核苷酸链是彼此分立，互不重叠的观念。五、重叠基因第44页，共73页，2023年，2月20日，星期一第45页，共73页，2023年，2月20日，星期一第三节基因工程的诞生及其主要研究内容一、1973年是基因工程诞生的元年E.coli第46页，共73页，2023年，2月20日，星期一第47页，共73页，2023年，2月20日，星期一1985第一批转基因家畜(兔、猪和羊)诞生1986基因工程生物（genetically-engineeredorganisms）首次在控制的情况下实验性地释放到环境中1988J.D.Watson出任“人类基因组计划”首席科学家，协调举世瞩目的人类基因组测序工作1989美国联邦专利局宣布将接受基因工程植物和动物方面的专利申请。第一个用于医药研究具有专利权的动物-杜邦肿瘤鼠（Dupout's"Oncomouse"）诞生第48页，共73页，2023年，2月20日，星期一美国国家卫生研究院（NIH）重组DNA咨询委员会批准进行第一个转基因植物实验90-92第一个转基因玉米及转基因小麦植株诞生，谷物基因工程开始变为现实；欧洲共同体各国35个实验室首发表第一个真核生物染色体（酵母染色体III）DNA全序列（共315000bp）1994基因工程西红柿在美国上市1995英国Nature杂志发表了人基因组全物理图，以及3号、16号和22号人染色体的高密度物理图第49页，共73页，2023年，2月20日，星期一1996完成酵母基因组DNA全序列测定工作1997英国爱丁堡罗斯林研究所的科学家宣称应用转基因技术首次育成克隆羊，引起世界轰动（体细胞克隆，而非基因克隆）1998第一批用成年的动物体细胞克隆的克隆牛和第一次用克隆动物克隆的克隆鼠相继诞生；美国PE公司发现新的DNA测序技术，比现有技术快10倍，它最终使人类基因组计划在二年后完成第50页，共73页，2023年，2月20日，星期一2000年6月22日，人类基因组研究组织（政府，6个国家参与）和塞莱拉基因组公司（私人）共同宣布人类基因组计划DNA测序草图完成；后基因组计划（结构基因组）启动2001J-M．Claverie提出“人类结构基因可能仅有30000个（2.5-3.0万）”的推论。但8月马里兰人类基因科学研究机构的专家威廉﹒哈泽尔泰姆把该数字提高到12万，因他的研究组已经鉴定有9万个基因第51页，共73页，2023年，2月20日，星期一

2003年，美国国家人类基因组研究项目负责人弗朗西斯·柯林斯博士４月１４日中午在华盛顿隆重宣布，人类基因组序列图绘制成功，人类基因组计划的所有目标全部实现。

第52页，共73页，2023年，2月20日，星期一二、基因工程研究的内容基因工程(geneticengineering)、基因克隆、DNA重组、DNA克隆、分子克隆1、研究内容

应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子（复制子、重组体），继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子拷贝，或其表达产物。第53页，共73页，2023年，2月20日，星期一2、重组DNA技术的基本过程目的基因的制备载体的选择和制备DNA分子的体外连接将外源DNA导入宿主细胞目的基因的筛选和鉴定第54页，共73页，2023年，2月20日，星期一基因克隆示意图第55页，共73页，2023年，2月20日，星期一第56页，共73页，2023年，2月20日，星期一3、转基因动植物在1982转基因小鼠成功之后，1983年转基因烟草问世，随后转基因植物迅速发展，目前至少有120种转基因植物问世。自从1994年转基因延熟西红柿获准上市以来，目前至少有51种转基因植物上市，2001年转基因种植面积达到10亿亩，其中美国占68％、阿根廷占22％、加拿大占7％、中国占3％。第57页，共73页，2023年，2月20日，星期一（1）转基因植物的类型抗病转基因植物：抗病毒转基因烟草抗虫转基因植物：抗虫棉抗逆转基因植物：抗旱、抗盐碱抗除草剂转基因植物：抗除草剂转基因玉米、大豆、棉花、油菜改良品质转基因植物：转VA水稻转基因药品植物：生产霍乱疫苗的胡萝卜第58页，共73页，2023年，2月20日，星期一第59页，共73页，2023年，2月20日，星期一（2）转基因食品的优点

把具有价值的目的基因，如高产、优质、抗病毒、抗虫、抗除草剂、抗寒、抗旱、抗涝、抗盐碱、改变花色和花形、延长保鲜期等基因分别转入到烟草、马铃薯、棉、番茄、大豆、苜蓿、矮牵牛等植物中，取得了可喜的成就。转基因植物转基因玉米在田间生长虫试（右为转基因玉米）第60页，共73页，2023年，2月20日，星期一（3）转基因食品的缺点转基因食品主要缺点有：①含有抗虫害基因的食品会威胁人类健康；

②转基因产品可能对环境的影响；③转基因产品可能会破坏生物多样性。第61页，共73页，2023年，2月20日，星期一应用转基因技术生产的食品，因为使用的特殊的现代分子生物学技术，从而产生了转入遗传物质后的食品是否安全的问题。转基因过程的各个环节都有可能对食品的安全性产生影响。由于插入基因后所产生的终产物或许是迄今为止人类没有充分认识到的新的产物，如：致癌物、激素、过敏原等。另外，由于新的基因的转入或基因重组，对固有生物的性质，如：保水性、储藏、硬度以及营养成分的含量和比例等都有影响。

转基因食品使用安全性问题第62页，共73页，2023年，2月20日，星期一环境安全性的核心问题是转基因作物释放到田间后，是否会将插入的基因漂移到野生植物中或传统植物中，是否会破坏自然生态环境，打破原有生物种群的动态平衡①转基因作物演变成农田杂草的可能性；②基因漂流到近缘野生种的可能性；③对生物类群的影响（抗除莠剂的作物一旦有机会与野生植物杂交就可能使杂草获得除莠剂耐受性，从而产生“超级杂草”，这必将严重影响农业生产，造成巨大损失。同样，抗虫作物也存在抗性基因扩散的可能性）。转基因作物环境安全性问题第63页，共73页，2023年，2月20日，星期一农业基因工程：强调提高农作物产量和改善农作物的抗虫性、抗病性、抗除草剂和抗旱能力食品基因工程：强调改善食品的营养价值和食用风味，如营养素含量、风味品质、延长食品储藏和保存时间，以及用食品工程菌生产食品添加剂和功能因子等安全性环境安全：如插入基因的漂移、抗虫性、抗除草性

食用安全：如插入基因后的终产物的致癌性、致病性、过敏性、毒性（4）转基因食品的安全性及营养问题第64页，共73页，2023年，2月20日，星期一1、国际组织

——实质等同原则（5）国外对转基因食品管理的现状表型性状等同成分等同第65页，共73页，2023年，2月20日，星期一实质等同性原则是指转基因食品及食品成分是否与传统食品具有实质等同性。实质等同性原则包括二方面的内容：①表型性状等同，如植物的形态、生长、产量、抗病性及育种的农艺性状；②成分等同，包括主要营养成分、有害物质、抗营养因子、毒物和变应性蛋白等方面。第66页，共73页，2023年，2月20日，星期一2000年《卡塔赫纳生物安全协定书》，62个国家签署2001年《生物安全议定书》，130多个国家签署2003年《生物技术食品的风险评估草案》，226个国家表示欢迎。第67页，共73页，2023年，2月20日，星期一4、我国对转基因食品的对策

◆1993年12月24日，国家科委颁布实施了《基因工程安全管理办法》◆1996年7月10日，国家农业部颁布实