大肠杆菌感受态细胞制备

大肠杆菌感受态细胞制备第1页，共13页，2023年，2月20日，星期一一、实验目的通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞的制备的方法和技术。第2页，共13页，2023年，2月20日，星期一二、实验原理感受态细胞制备:所谓感受态是指受体细胞处于容易吸收外源DNA的一种生理状态，可以通过物理与化学方法诱导形成，也可以自然形成，在基因工程技术中通常采用诱导的方法。用于转化的受体菌细胞一般是限制-修饰系统（Restriction-Modification）缺陷的变异株，以防止对导入的外源DNA的切割，用符号R-M-表示。第3页，共13页，2023年，2月20日，星期一二、实验原理其基本原理是：细菌处于0℃的CaCl2低渗溶液中，会膨胀成球形，细胞膜的通透性发生变化，转化混合物中的质粒DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经过42℃短时间的热激处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富的培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，在选择培养基上可获得所需的转化子。第4页，共13页，2023年，2月20日，星期一

三、实验材料与设备1、用品与与仪器：超净工作台、恒温培养箱、移液器、微型离心管等、台式冷冻高速离心机、冰箱、制冰机等；1.5mL与0.5mLEppendorf管、tip头、烧杯、量筒。

镊子、试管三角瓶、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、吸水纸，一次性塑料手套等；E.coliDH5α受体菌(R-M-)，pGEX-4T-2质粒(Ampr)。第5页，共13页，2023年，2月20日，星期一三、实验材料与设备2、试剂：LB培养基:蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，琼脂粉15g/L（固体培养基），用10mol/L的NaOH调节pH为7.0，高压灭菌；氨苄青霉素贮存液：浓度50-100mg／mL；含有抗菌素的LB平板培养基：将配置好的LB固体培养基高压灭菌后，冷却到60度左右，加入氨苄青霉素（终浓度为50µg／mL浓度50-100µg／mL）；第6页，共13页，2023年，2月20日，星期一超净工作台第7页，共13页，2023年，2月20日，星期一恒温培养箱第8页，共13页，2023年，2月20日，星期一制冰机第9页，共13页，2023年，2月20日，星期一高速冷冻离心机和超速离心机等第10页，共13页，2023年，2月20日，星期一四、实验操作1、从新活化的E.coliDH5α平板上挑取一单菌落，接种于3～5mlLB液体培养中，37℃振荡培养至对数生长期(12h左右)；

2、将该菌悬液以1:100～1:50转接于100mlLB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～30min测一次OD600，至OD600为0.3～0.5时停止培养，并转装到1.5mL离心管中；

3、培养物于冰上放置20min；

4、0～4℃，4000g离心10min，弃去上清液，加入1mL冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液，小心悬浮细胞,冰浴20分钟；第11页，共13页，2023年，2月20日，星期一四、实验操作

5、0～4℃，

4000g离心10min，倒净上清培养液，再用1.0mL冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴20min；

6、0～4℃，

4000g离心10min，弃去上清液，加入100µL冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液；

7、制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，如果在4℃放置12～24h，其转化效率可以增高4～6倍；也可加入占总体积15％左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置于-7