血红蛋白的提取与分离

血红蛋白的提取与分离第1页/共55页知识回顾--------有关蛋白质的几个问题：1、含量2、组成元素3、相对分子质量4、基本组成单位：结构简式：种类：5、氨基酸连接方式

占细胞干重的50％以上，细胞中含量最多的有机物C、H、O、N高分子化合物氨基酸RHCCOOHNH2脱水缩合第2页/共55页知识回顾--------有关蛋白质的几个问题：6、肽键7、分子结构8、蛋白质多样性的原因：

(多样性的根本原因)

9、蛋白质的鉴定方法氨基酸肽链蛋白质脱水缩合盘曲折叠（n条）细胞和生物体的结构物质，是一切生命活动的主要承担者。CONH

氨基酸的种类不同；数目成百上千；排列顺序变化多端；多肽链的空间结构千差万别10、生理功能

细胞和生物体的结构物质，是人体发育和组织更新的主要原料，具有运输、调节、免疫、催化等作用，是一切生命活动的主要承担者第3页/共55页①氨基酸间脱水缩合时，原来的氨基和羧基就不存在了，形成的化合物即多肽的一端只有一个氨基，另一端只有一个羧基（不计R基上的氨基和羧基）。所以对于一条多肽链说，至少应有的氨基和羧基都是一个②若有个n氨基酸分子缩和成m条肽链,则可形成n-m个肽键,脱去个n-m个水分子，至有氨基和羧基各m个11、相关计算③蛋白质可以含有一条或n条肽链、肽链通过化学键（如二硫键）互相连接，具有不同的空间结构④关于蛋白质相对分子量的计算：n个氨基酸形成m条肽链，每个氨基酸的平均相对质量为a，那么由此形成的蛋白质的相对分子量为n·a-(n-m)·18第4页/共55页关于血红蛋白1、元素组成2、分子结构3、颜色4、存在细胞5、生理功能6、获得方法、第5页/共55页

根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。问：依据什么来分离和提取蛋白质（原理P65T5－13）基础知识第6页/共55页阅读并回答（P64）

1、凝胶色谱法另一个名称；

2、凝胶色谱法分离蛋白质的依据；

3、凝胶的实质；

4、凝胶色谱法

5、凝胶色谱法的原理。基础知识（一）凝胶色谱法第7页/共55页1、凝胶色谱法的别名：分配色谱法

是根据相对分予质量的大小分离蛋白质的有效方法。4、凝胶

①性质：一些微小的多孔球体，球内含许多贯穿的通道；

②化学本质：多糖类化合物：③实例：葡聚糖、琼脂糖：2、凝胶色谱法的概念：根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。基础知识（一）凝胶色谱法3、依据的特性蛋白质分子量的大小。5、具体过程第8页/共55页

原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（），移动速度（），而（）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（）移动，路程（），移动速度（），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。相对分子质量较小较长较慢相对分子质量较大凝胶外部较短较快基础知识（一）凝胶色谱法第9页/共55页基础知识（一）凝胶色谱法5、具体过程第10页/共55页第11页/共55页基础知识（一）凝胶色谱法5、具体过程

在小球体内部有许多贯穿的通道，当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。

第12页/共55页1、我们在什么地方遇到过缓冲物质的？2、缓冲物质有哪些？3、缓冲溶液的作用是什么？4、怎样配制缓冲溶液？基础知识（二）缓冲溶液第13页/共55页1、缓冲溶液概念

在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。能够抵制外界的酸或碱的对溶液的PH值的影响，维持PH基本不变。2、缓冲溶液作用基础知识（二）缓冲溶液3、缓冲溶液配制

通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。第14页/共55页①弱酸和弱酸盐组合H2CO3/NaHCO3

CH3COOH/CH3COONa4、缓冲溶液的组分分类基础知识（二）缓冲溶液②弱碱和弱碱盐③多元弱酸的酸式盐和其他所对应的次级盐NH4OH/NH4CINaH2PO4/Na2HPO4KH2PO4/K2HPO4第15页/共55页思考：

你认为在血红蛋白整个实验中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？

使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究(活性)。基础知识（二）缓冲溶液

生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的，为了能够在实验室条件下准确模拟生物体内的过程，就必须保持体外的pH与体内的基本一致。因此，缓冲溶液的正确配制和pH的准确测定，在生物化学的研究工作中有着极其重要的意义。问：在生物化学的研究工作，为什么要正确配制缓冲溶液和准确测定缓冲溶液的pH？第16页/共55页阅读第65页的相关内容，回答以下问题：

1、电泳的概念；

2、电泳的原理；

3、电泳的种类；

4、SDS的作用。基础知识（三）电泳第17页/共55页1、概念带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2、原理①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。基础知识（三）电泳②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。3、电泳的类型琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。第18页/共55页基础知识（三）电泳第19页/共55页

原理：许多重要的生物大分子，如（）等都具有()在()下，这些基团会带上（）。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其（）移动。电泳利用了待分离样品中各种分子（）以及分子本身（）、（）的不同使带电分子产生不同的（），从而实现样品中各种分子的分离。多肽、核酸可解离的基团正电或负电所带电荷相反的电极带电性质的差异大小形状的迁移速度一定的PH基础知识（三）电泳第20页/共55页

十二烷基磺酸钠（SDS）—聚丙烯酰胺凝胶电泳由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。测定蛋白质分子量。①应用②聚丙烯酰胺凝胶蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。③原理基础知识（三）电泳4、实例

第21页/共55页SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种电荷间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。⑤SDS作用机理④SDS作用为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入SDS。基础知识（三）电泳第22页/共55页为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入()。SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是()。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于()。

蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。SDS单条肽链的分子量分子的大小第23页/共55页讨论：如何测定蛋白质的分子量？使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售第24页/共55页实验操作阅读课本相关内容，思考以下问题：

1、蛋白质的提取和分离一般分成几步？

2、样品怎样处理？

3、蛋白质怎样分离？第25页/共55页实验操作（一）样品处理样品处理——粗分离——纯化——纯度鉴定问：蛋白质提取和分离步骤？第26页/共55页血液血浆水分固体物质血浆蛋白无机盐磷脂葡萄糖等血细胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白（90％）2个a－肽链2个β一肽链4个亚铁红素基团①血液组成实验操作（一）样品处理第27页/共55页

血液由血浆和各种血细胞组成，其中红细胞最多。在红细胞的组成中，约90％是血红蛋白。血红蛋白由四个肽链组成(如图)，包括两个α-肽链和两个β-肽链。其中每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分了二氧化碳。血红蛋白因含有血红素而呈现红色。血红蛋白2个a－肽链2个β一肽链4个亚铁红素基团实验操作（一）样品处理第28页/共55页

每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色②血红蛋白组成及作用③选材

本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。实验操作（一）样品处理第29页/共55页1、红细胞的洗涤

阅读课本内容，回答以下问题：

1、洗涤的目的？

2、怎样洗涤？

3、洗涤干净的标志是什么？1除去其中的杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化。2采样分离－吸浆倒红－加液搅拌－重洗三次3直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。实验操作（一）样品处理第30页/共55页1、速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果。问：1、洗涤操作过程中，为什么要低速短时间离心？2、为了使红细胞洗涤干净，需如何处理？3、用质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤，能否用蒸馏水或浓度高的氯化钠溶液？为什么？1、红细胞的洗涤2、重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。实验操作（一）样品处理第31页/共55页

红细胞的洗涤洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。采集的血样要及时分离红细胞，分离时采用低速短时间离心，如500r／rain离心2min，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水(质量分数为0.9％的NaCl溶液)，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。1.红细胞的洗涤实验操作（一）样品处理第32页/共55页2.血红蛋白的释放

血红蛋白的释放将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加蒸馏水到原血液的体积，再加40％体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10min。在蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。说出：蒸馏水和甲苯的作用。实验操作（一）样品处理第33页/共55页3.分离血红蛋白溶液

分离血红蛋白溶液将搅拌好的混合液转移到离心管中，以2000r／min的速度离心10min后，可以明显看到试管中的溶液分为4层。从上往下数，第1层为无色透明的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。问：1、采用什么方法分离血红蛋白？2、离心分层后，各层的成分各是什么？3、用滤纸过滤，去掉什么成分？实验操作（一）样品处理第34页/共55页

取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12h。4.透析问：透析过程及透析目的？透析目的是：除去样品中分子量较小的杂质。说明：透析袋是一种半透膜，能使小分子自由进出，而大分子不能通过。思考：根据材料进行实验设计：现有烧杯一只、透析袋一个、碘液、淀粉溶液、铁架台一个、棉线若干。探究碘液、淀粉是否能通过透析袋。写出实验步骤和结果预测。实验操作（一）样品处理第35页/共55页4.透析实验操作（一）样品处理第36页/共55页

阅读课本相关内容，了解凝胶色谱的操作过程。实验操作（二）凝胶色谱操作第37页/共55页实验操作（二）凝胶色谱操作1.凝胶色谱柱的制作取长40cm，内径为l.6cm的玻璃管，两端磨平。柱底部的制作方法如下(图5-19)。首先选择适合封堵玻璃管口的橡皮塞，中间打孔，孔径大小要能够紧密插入0.5mL的移液管。将橡皮塞上部用刀切出锅底状的凹穴，将0.5mL的移液管头部切下5cm长的一段，插入橡皮塞孔内，插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面。将尼龙网剪成与橡皮塞上部一样大小的圆片，覆盖在橡皮塞的凹穴上，再用大小合适的l00目的尼龙纱将橡皮塞上部包好，插到玻璃管的一端。在色谱柱下端用移液管头部作出口部位，连接一细的尼龙管，并用螺旋夹控制尼龙管的打开与关闭，尼龙管的另一一端放人收集色谱流出液的收集器内。柱顶部的制作只需在色谱柱的另一端插入安装厂玻璃管的橡皮塞即可。打孔-挖穴-安管-覆网-纱包-插管注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。第38页/共55页2．凝胶色谱柱的装填装柱前要将色谱柱垂直固定在支架上。因为干的凝胶和用缓冲液平衡好的凝胶的体积差别很大，因此装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需要的凝胶量。本实验使用的是交联葡聚糖凝胶。“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围，75表示凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.59。凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，在与色谱柱下端连接的尼龙管打开的情况下，一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时可轻轻敲动色谱柱，使凝胶装填均匀。注意色谱柱内不能有气泡存在，一旦发现有气泡，必须重装。装填完后，立即连接缓冲液洗脱瓶，在约50cm高的操作压下，用300mL的物质的量浓度为20mmol／L的磷酸缓冲液(pH为7.0)充分洗涤平衡凝胶12h，使凝胶装填紧密。实验操作（二）凝胶色谱操作第39页/共55页2.凝胶色谱柱的装填问:1、凝胶的选择材料?G代表意义?2、简单步骤?3、注意点：实验操作（二）凝胶色谱操作选择交联葡聚糖凝胶（G-75）“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围,75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。固定色谱柱－－配凝胶悬液－－装填色谱柱－－洗涤平衡第40页/共55页3.凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙；装填凝胶柱时不得气泡存在。（因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。）2.凝胶色谱柱的装填实验操作（二）凝胶色谱操作问:1、凝胶的选择材料?G代表意义?2、简单步骤?3、注意点：第41页/共55页

装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300mL的20mmol/L的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12h。问：洗涤平衡的溶液？注意什么？1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果；2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。实验操作（二）凝胶色谱操作2.凝胶色谱柱的装填第42页/共55页3.样品的加入和洗脱加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。用吸管小心地将1mL透析后的样品加到色谱柱的顶端(图5-22)，注意不要破坏凝胶面。加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内。等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。小心加入物质的量浓度为20mmol／L的磷酸缓冲液(pH为7.0)到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱。待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5mL收集一管，连续收集(图5—21)。实验操作（二）凝胶色谱操作第43页/共55页3.样品加入与洗脱①调节缓冲液面②滴加透析样品

吸管吸1mL样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。

加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。实验操作（二）凝胶色谱操作③样品渗入凝胶床

加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内。等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。第44页/共55页⑤收集：

待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）。④洗脱

小心加入物质的量浓度为20mmol／L的磷酸缓冲液(pH为7.0)到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱。3.样品加入与洗脱实验操作（二）凝胶色谱操作问：正确的加样操作，注意什么？1、不要触及破坏凝胶面2、贴壁加样3、使吸管管口沿管壁环绕移动第45页/共55页答：让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能。讨论：

1、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？实验操作（二）凝胶色谱操作讨论：

2、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？答：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。第46页/共55页

血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。讨论：

3、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？实验操作（二）凝胶色谱操作第47页/共55页你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀吗？P70答：凝胶实际上是一些微小的多孔球体，小球体内部有许多贯穿的通道。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，从而使各种相对分子质量不同的分子得以分离。如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。第48页/共55页

观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。结果分析与评价1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？第49页/共55页

由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？结果分析与评价第50页/共55页

如果凝胶色谱柱装填得很成功