DNA重组技术的基本工具

第1节DNA重组技术的基本工具【本节重难点】重点：DNA重组技术所需的三种基本工具的作用难点：基因工程载体所需要具备的条件【知识精讲】教材梳理知识点一基因工程的概念：基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。注意：对本概念应从以下几个方面理解：蕉操作环境大生物体外欣操作对象根基因高操作水平蝴DNA分子看水平忆基本过程瓣剪切奏→稼拼接味→达导入识→蔑表达刺结果蓝人类需要的抄基因产物知识点二基因工程的基本工具1.限制性核酸内切酶——“分子手术刀”娇（1）限制武性内切酶的渡来源：主要碌是从原核生箩物中分离纯兰化来的。堵（2）限制学性内切酶的林功能：能够佣识别双链D刮NA分子的勿某种特定的园核苷酸序列惩，并能将每巨一条链上特幅定部位的两堆个核苷酸之式间的磷酸二怀酯键切开。斯（3）限制鞠性内切酶的轮切割方式：蜡①步在中心轴线亿两侧将DN封A切开，切脖口是黏性末尊端。疮②浮沿着中心轴姜线切开DN俩A，切口是脸平末端。顽注意：比较洲有关的DN巡A酶羞（1）DN讨A水解酶：新能够将DN缠A水解成四鼠种脱氧核苷蔑酸，彻底水砌解成膦酸、钳脱氧核糖和渡含氮碱基模饶（2）DN毛A解旋酶：父能够将DN凶A或DNA故的某一段解骑成两条长链罪，作用的部这位是碱基和台碱基之间的栗氢键。注意与：使DNA轮解成两条长狂链的方法除耽用解旋酶以萍外，在适当士的高温（如肝94央℃捉）、重金属容盐的作用下蹲，也可使D艺NA解旋。葵值（3）DN牺A聚合酶：筑能将单个的攻核苷酸通过短磷酸二酯键俗连接成DN垄A长链。帽饺（4）DN搁A连接酶：笨是皂通过磷酸二叔酯键恭连接双链D尸NA的缺口怕。注意比较撑DNA聚合州酶和DNA治连接酶的异续同点。刃2.DNA粪连接酶顽——“评分子缝合针嘱”狠（1）DN添A连接酶的晓分类：E.办coliD挎NA连接酶吊和T巾4浆DNA连接轰酶。波（2）作用迟及作用部位役：E.co晨liDNA部连接酶作用御于黏性末端漆被切开的磷狱酸二酯键，箭T号4字DNA连接方酶作用于黏冻性末端和平厉末端被切开现的磷酸二酯农键。胜3.基因进贺入受体细胞姜的载体删——“范分子运输车字”驶（1）分子档运载车的分窄类：辫①亩质粒：常存位在于原核细腊胞和酵母菌粱中，是一种纤分子质量较根小的环状的肾裸露的DN拖A分子，独竖立于拟核之恩外。亦②督病毒：常用暂的病毒有噬剥菌体、动植辜物病毒等。掏（2）运载踩体使用的目抓的：幸①象是用它做运吹载工具，将商目的基因转距运到宿主细刮胞中去。阅②的是利用它在个受体细胞内胶对目的基因棍进行大量复躁制。剧（3）作为观运载体必须百具备的条件牛：括①喉在宿主细胞封中保存下来李并大量复制桥讲②适有多个限制虽性内切酶切夕点并③钟有一定的标炊志基因，便洲于筛选。为思维探究：此知识点3、动4、5访主要是介绍雀DNA重组何技术的三种纵基本工具及附其作用。限塘制酶──“茶分子手术刀器”，主要是靠介绍限制酶寺的作用，切婚割后产生的桥结果。在这观部分内容学墨习时，龙应关心的问淋题之一是：肿限制酶从哪稿里寻找剂？我们可以扫联想从前学准过的内容─认─噬菌体侵仓染细菌的实唤验，进而认谊识细菌等单管细胞生物容裙易受到自然演界外源DN惹A的入侵。凶那么这类原烈核生物之所须以长期进化醉而不绝灭，捎有何保护机虹制？进而皇联想到跨可能是有什脱么酶来切割夹外源DNA撑，而使之失穗效，达到保作护自身的目航的”。这样本就痕对塑“鹅限制劫酶主要是从性原核生物中宵分离纯化出帆来悉”结的认识提高瓜了一个层次菌。羡DNA连接卖酶──DN戴A片段的“亭分子缝合针楼”，妻在这里同学奔们很容易想忠到碱基互补健配对或DN穗A聚合酶，钟这是很自然帽的。但只考失虑到碱基互眨补配对原则婆还是不够的物，乖我们可以从疫原有的知识妹出发，要想厌到限制酶事切开的DN亦A既中膦酸与脱槐氧核糖之间舰的磷酸二酯捕键夫，再这个地方还芽没有连接起稠来，又是怎乳样连接的呢星？这样自然筹而然地想到汁DNA连接压酶。家基因进入受驱体细胞的载搅体──“分惯子运输车”娱的学习内容饭，不能仅仅芒着眼于记住燕这几个条件芒，而应该忍深入思考每翅一个条件的非内涵，兔通过处深思熟虑脆，昂才能真正押明确为什么逝要有这晓些墓条件才能充间当载体。教材拓展碌拓展点一你剂限制酶所识赢别序列电的弓特点企限制酶所识中别的序列抚的特点是：搭呈现碱基互守补对称丙，无论是抓奇数昏个碱基还是复偶数描个碱基，都漠可以找到一茫条中心轴线票，如图侦，中轴线两丝侧的双链D久NA上的碱勿基是反向对趣称重复排列阔的。岛如：尺以中心线非为轴，两侧寿碱基互补对罪称；训以野为轴，两难侧碱基互补厨对称。心拓展点二庆敌DNA连接惹酶连接的是妥什么部位？堂DNA连接猎酶是将一段挥DNA片段搏3′端的羟摘基与另一D葛NA片段5饥′端磷酸基崖团上的羟基时连接起来形掠成酯键，而届不是连接互裕补碱基之间牲的氢键。宅【典题分类绿精析】脏考点拔一、基因工沙程的概念卖例1．（2亭005高考罢广东）以下载有关基因工虹程的叙述，提正确的是做（代）镰A、基因工超程是细胞水赤平上的生物保工程暂B、基因决工程的产物杂对人类都是谅有益的袋C、基因工莫程产生的变忙异属于人工抚诱变广D、基因橡工程育种的状优点之一是疫目的性强疗分认析：糕本题考查的级知识点是基三因工程的风概念死。慎解答本题的诞关键是理解妙基因工程的杯概念。摔基因工程是县在生物体外唯，通过对D僵NA分子进杠行人工“剪味切”和“拼执接”，对生桌物的基因进膀行改造(目仆的性强)和滔重新组合(兆基因重组)街，然后导入角受体细胞内亡进行无性繁忧殖，使重组威基因在受体音细胞内表达同，产生出人樱类所需要的辞基因产物.粥但并不是所挥有的基因产刊物对人类都树有益的舰。所以选D贩。虹坡答案：D坊丈点评：正确食理解基因工匙程的概念是忍解题的关键梳。齿富译勺果扣涝团纷属厌纤考点旺二、基因工保程的基本工饲具象例2.下列拳关于限制酶垦的说法不正瘦确的是扔A．限制酶亡广泛存在于连各种生物中拘，微生物中俱很少分布哨B．一种限循制酶只能识倍别一种特定奶的核苷酸序割列洲C．不同的下限制酶切割间DNA的切灵点不同缠D．限制酶旋的作用是用巾来提取目的浸基因裙分析：此题勤主要考察限上制酶的有关丙知识。解答腊本题的关键氏是理解限制招酶的来源和萝限制酶的特毫点。限制酶良主要是从原漂核生物中分秋离出来的，厚并不是广泛戴存在于各种北生物中；一徒种限制酶能那识别双链D惕NA的某种享特定核苷酸也序列，并且箩使每一条链绒中特定部位哥的两个核苷迅酸之间的磷粉酸二酯键断膀开；DNA钟分子经限制屠酶切割形成议黏性末端和歪平末端两种买。答案：B楼点评：考察倡有关限制酶关的题目，主态要是考察限艺制酶的特点鸦，这一点一轰定要牢记。姥例3别．在基因工歇程中用来完牧成基因的剪纷接的工具是愤丘A．限制酶既和连接酶形B．赔限制酶和水检解酶呆C．限制酶语和运载体陵D连栏接酶和运载金体赌分析：本题爷考查限制酶净和连接酶的航有关知识。缴解答本题的卵关键是裕“养剪接爆”刘二字，是既化剪又接。刊限制性内切场酶(即限制网酶)是剪切同基因的扯“大剪刀久”浅，DNA连秆接酶是将D陡NA末端之莲间的缝隙敏“猛缝合宇”哲起来的写“挂基因的针线艰”视。所以，剪猎接工具是限撇制酶和连接薄酶。答案：A驼点评：本题她注意审题，药剪接是既剪春又接，需要火限制酶和连志接酶。掠例4暑．有关基因级工程的叙述放正确的是送A．限制酶围只在获取目迫的基因时才归用早慨帐B．重组质台粒的形成是惰在细胞内完施成的缠C．质粒都丝可以作为运备载体湿D．蛋白质桌的氨基酸排嫌列顺序可以刷为合成目的眉基因提供线雾索据分析：本题晨综合考察了殊基因工程中高所用到的工语具。违在基因工程轮中，不仅要炮用限制酶切逼割目的基因挑，还要用同董一种限制酶耍在质粒上切损割出一个切阁口，使目的多基因与质粒阁切口的黏性算末端能进行画碱基互补配完对，所以A字错；重组质扣粒是在细胞观外进行的，供所以B错；赌并不是所有逆的质粒都可葡作运载体，福在科学研究盏中，人们通团常只是用大宁肠杆菌的质沸粒(其上有瓶抗药基因)年作运载体，串所以C错；群在人工合成过目的基因的才方法中，有龟一种方法是罪根据已知蛋枣白质的氨基疤酸序列，推往测出相应的范mRNA序聪列，然后按惜照碱基互补葵配对原则，黑推测出它的架结构基因的燕核苷酸序列现，最后通过披化学方法，惹以单核苷酸误为原料合成范目的基因。耗所以D项正破确。答案：D炊点评：解答众本题时要综壳合考虑基因图工程的基本滩工具的特点次、条件、适责用范围。热例5．下列撑哪项通常不财被用作基因木工程的运载涉体乌A．细菌质若粒兵臣B．噬菌体斧C．动植物踢病毒品D．细菌垄核区的DN恨A咏分析：本题敞考察基因工蝶程中的工具米——险运载体。解谨答本题的关放键是记住、中理解运载体适必须具备的资条件和课本妖上讲的常用惜运载体。召作为运载体沉必须具备的与条件：伍①刃在宿主细胞狂中保存下来涨并大量复制零港②扰有多个限制垦性内切酶切睡点裁③旺有一定的标匙志基因，便赠于筛选。服记住常用的久运载体有：锄质粒、噬菌奖体、动植物谅病毒等。违细菌的核区痰由一个大型李的环状DN检A分子反复抢折叠缠绕而倚成，控制着坦细菌的主要糊性状，所以碌一般不被用职作基因工程能的运载体。答案：D请点评：牢记拐作为运载体茶必须具备的笔3个条件是缠解答本题的族关键。芒考点独三、羊限制酶所识共别序列畜的珠特点稼例6用．摸［2005弹天津］蔑（1）限制速性内切酶Ⅰ喉的识别序列蛙和切点是—换G↓GAT尚CC—，限疮制性内切酶后Ⅱ的识别序扶列和切点是颗—↓GAT乐C—。在质唉粒上严有酶浓Ⅰ妇的一个切点欧，在目的基请因的两侧各冬有贝1个酶Ⅱ的趴切点。尾①蠢请画出质粒已被限制酶饶Ⅰ喷切割后形成珠的黏性未端穗。粉_____城_____竿_____聋_____循_____仆__燥②驳请画出目的喉基因两侧被沙限制酶沫Ⅱ穗切割后形成站的黏性未端随。耗_____该_____霜_____弄_____坚_较③绑在饮DNA连接具酶的作用下追，上述两种海不同限制酶宗切割后形成国的讯黏性未端能墨否连接起来殖？为什么？仇_____鬼_____送_____射_____轨_____谱_____舱_____佳_____致_____柴_____拉_____屡_遗分析：本题欺主要考察黏征性末端的知咳识。解答本捷题的关键是俱理解限制酶价的特点。在丑切割目的基备因和运载体尘时，一定要奸使用同一种慰限制性内切宰酶，这样，喘切出的切口茧才一样，才州能进行碱基煌互补配对连洽接起来。两症个黏性末端蹄只要一样就胡可以进行碱用基互补配对设，再通过D竿NA连接酶唤连接起来。狸答案：（浊1）向

③钟可以连接。烂因为由两种亦限制性内切主酶切割后所警形成的黏性馅末端是相同汽的（或移“踏是可以互补即的恋”燥）。衫点评：限制矛酶所识别的动是特定的碱蔽基序列，并赛在特定部位皮进行切割，社限制酶不同尼，所识别的独碱基序列不攻同，黏性末朋端不同。但按不同的粘性乓末端有时是枪可以进行拼蒜接的，如：罢黏性末端覆。两者不要霜混淆。旋克党滚烘卖蜡识膏【针对性练弯习】轰1晃．实施基因家工程第一步宇的一种方法执是把所需的搅基因从供体里细胞内分离叼出来，这要剖利用限封制施性内切酶。罩一种限制性萝内切酶能识桨别DNA子耀中的GAA埋TTC顺序槐，切点在G膝和A之间，处这是应用了赞酶的部A．酶的高晃效性B爱．上酶的专一性仙枪C．酶的多脾样性珠李D续．藏酶的催化活歇性受外界条焦件影响鸭2．以下说诉法正确的是负巾A．所有的胸限制酶只能红识别同一种边特定的核苷闪酸序列边B．质粒是合基因工程中列惟一的运载起体泳C．运载体敬必须具备的跨条件之一是处：具有多个惰限制酶切点流，以便与外糖源基因连接毙D．基因治步疗主要是对志有缺陷的细妨胞进行修复母3.下列黏悉性末端属于吵同一种限制祝性内切酶切幼割的是（泼）将哈A．熄①②蜜恐B．浪①③渣起C．蠢②④愉粮D．歇③④驴4.下列四厘条DNA分悉子，彼此间够具有粘性末莲端的一组是棒周桨较片知A．徒①②亿慧做B．候②③矿寸纲C．券③④映厚认D．柴②④戏5．依右图抛有关基因工返程的工具酶希功能的叙述浪，师不辅正确的是姿A．切断a亚处的酶为限流制核酸性内衰切酶览届B．连接a彩处的酶为D战NA连接酶亩C．切断b沟处的酶为解滑旋酶荐应欠叛D．切断b侨处的为限制慨性内切酶毯6．居不芒属于质粒被尼选为基因运县载体的理由柳是威A．能复锻制效著坐B．有薄多个限制酶比切点恼C．具有孝标记基因者杨消D．它阁是环状DN企A挂7.基因工赶程技术也称弊为DNA重库组技术，其裕实施必须具锤备的四个必轰要条件是外A.目的基再因趋限制性内切槐酶运付载体析争体细胞复屋B.重组D印NA对RNA聚定合酶因限制潜性内切酶捞连接渠酶冰C.工具酶础覆目的基因奥耳运载体棉水妈受体细胞寇D.模板D武NA侄信使RN捷A没质刘粒顽宜受体回细胞就8．下列关亦于各种酶作席用的叙述，蒜不正确的是爪棋劣A．DNA预连接酶能使笨不同脱氧核罗苷酸的磷酸暑与脱氧核糖愚连接资B．RNA英聚合酶能与吼基因的特定菠位点结合，口催化遗传信辩息的转录格C．一种D盾NA限制酶倡能识别多种拾核苷酸序列夺，切割出多时种目的基因程D．胰蛋白醉酶能作用于她离体的动物拼组织，使其慢分散成单个优细胞剂9.下列关涂于限制酶的那说法不正确双的是扶A.限制酶元广泛存在于慕各种生物中歼，尤其在微左生物细胞中高分布最多状B.不同的柄限制酶识别直不同的核苷境酸序列暗C.限制酶泻能识别不同朵的核苷酸序少列，体现了蔑酶的专一性西D.限制酶仆的作用只是踩用来提取目魄的基因舍10歼．有关基因胃工程的叙述犹中，室不份正确的是驱刘么A.倦DNA连接供酶将黏性未档端的碱基对矩连接起来响B.限浩制性内切酶院可用于目的裕基因的获得弱招C.见目的基因须提由运载体导地入受体细胞剥芽伙D出.声人工合成目互的基因不用倚限制性内切衫酶糊11．下图洒所示限制酶显切割基因分丘子的过程，星从图中可知幻，该限制酶王能识别的碱携基序列和切艺点是冠A．驻CTTAA舱G，切点在塞C和T之间牲步B．粪CTTAA棚G，切点在挂G和A之间哭C青．魔GAATT孙C，切点在瞎G和A之间冬承D．恢GAATT蔑C，切点在财C和T之间牛翅逢12.下列爽关于质粒的堡叙述，正确态的是奔是（些）仗A、质粒是滤广泛存在于科细菌细胞中己的一种颗粒诞状细胞器倍B、质粒是藏细菌细胞质欢中能够自主湿复制的小型燃环状DNA从分子齐C、质粒只真有在导入宿辰主细胞后才哭能在宿主细伯胞内复制虑D、细菌质规粒的复制过尼程一定是在布宿主细胞外蠢独立进行的奉13．科学叨家常选用的贩细菌质粒往赤往带有一个昨抗菌素抗性痰基因，该抗姿性基因的主艘要作用是甩A．提高受炼体细胞在自门然环境中的鹰耐热性纪B．有利于通检测目的基数因否导入受贴体细胞薯C．增加质慈粒分子的相原对分子质量垒雹D．伪便于与外源邪基因连接奋14．下图灾是基因工程揪主要技术环购节的一个基甜本步骤，这率一步需用到热的工具是捷A．DNA盟连接酶和解屈旋酶蚊段标B中．DNA聚爸合酶和限制啦性核酸内切免酶扭C．限制性氧核酸内切酶忆和DNA连撑接酶仗D．袋DNA聚合疤酶和RNA意聚合酶砍15．限制岸酶是一种核贱酸切割酶，违可辨识并切袋割贞DNA汇分子上特定推的核苷酸碱脑基序列。下锣图为四种限齐制酶丙BamH朗I忙，完Eco符RI重，瓦Hin绒d墨Ⅲ腔以及慰Bg徐l至Ⅱ乡的辨识序列表。箭头表示霸每一种限制律酶的特定切旋割部位，其规中哪两种限费制酶所切割功出来的万DNA婚片段末端可呈以互补黏合嘉？其正确的蒙末端互补序史列为何？六恐A.Ba俗mH耽I排和和Eco控RI灿；末端互补趣序列股—友AATT徐—竭B.Ba甩mH为I候和当Hin翅d乡Ⅲ袜；末端互补酒序列材—衡GATC殃—妇C.Ec叙oR你I浪和稀Hin眠d墓Ⅲ闸；末端互补为序列控—谊AATT愈—学D.Ba哭mH捉I叼和逃Bgl嗽II友；末端互补运序列失—肌GATC膀—剧16．在印DNA疤测序工作中环，需要将某讲些限制性内滨切核酸酶的斧限制位点在增DNA啊上定位，使切其成为乱DNA沃分子中的物岸理参照点。勺这项工作叫退做聋“发限制酶图谱径的构建遮”重。假设有以盘下一项实验比：用限制酶是纤Hind蜻Ⅲ勒，BamH糖Ⅰ鲁和二者的混劈合物分别降留解一个晒4kb饮（1kb即侮1千个碱基印对）大小的炸线性泳DNA添分子，降解刺产物分别进倍行凝胶电泳票，在电场的贵作用下，降荡解产物分开茧，如下图所浴示。稠据此分析，它这两种限制堆性内切核酸醋酶在该废DNA敌分子上的限策制位点数目陵是以下哪一温组？开A．Hin尤d蚕Ⅲ丰1个，Ba扰mH康Ⅰ疮2禁仅个花坚塔B．Hin避d馅Ⅲ诞2个，Ba闭mH坛Ⅰ掩3个魂C．Hin反d贿Ⅲ蚁2个，Ba群mH碰Ⅰ梁1做博个刑释遥D．Hin咏d依Ⅲ教和BamH铁Ⅰ促各有帅2赵个贵17.两个生核酸片段在槽适宜的条件夺下，经X酶刻的作用，发抓生下述变化关，则X酶是馒A.连接酶刮B.父RNA聚合赏酶要C.D冬NA聚合酶年D求.限制酶布18．基因肤工程中涉及太多种工具酶坚：焦（1）限制轮性内切酶是盒一类能识别坡特定核苷酸岸序列并在特辈定位点切割进双链DNA贞的形“疤基因剪刀退”凳。被限制酶仍识别的序列链往往正反读强顺序相同，符断裂的位置邀交错，但又钳是围绕着一秃个轴线（对透称轴）对称瓣排列，如下识左图。Ps狮tI和Ec眨oRI都是益限制酶。请伤补全下右图遍中的互补链丑，画出对称锅轴以及切割前后的产物。浊瓜遣途拜还依场爪迹思（2）DN价A连接酶是悼基因操作的抽“蛛针线匀”瑞，其作用是扇把基于坦姨慌叼收能力而粘贴扬在一起但存养在的切口封苦闭，进而才牌可能形成有摆意义的谣恰来产耻虾。剥（3）逆转慎录酶也常被太用于基因工熊程，其存在本于荣链始（生物）中偷，催化以屑柱平仰为模板合成旋DNA的过和程。萍猴京狡胞增租19.越利用基因工逢程生产蛋白饲质药物，经副历了三个发链展阶段。第悔一阶段，将昂人的基因转落入细菌细胞域；第二阶段喘，将人的基龄因转入小鼠雀等动物的细宜胞。前两个猪阶段都是进爷行细胞培养项，提取药物拦。第三阶段饮，将人的基径因转入活的奸动物体，饲磨养这些动物私，从乳汁或敞尿液中提取姓药物。但（1）将人匆的基因转入嫌异种生物的趟细胞或个体嫩内，能够产厦生药物蛋白枪的原理是基昆因能毯控牢制汇产绸牢。醉（2）人的典基因能和异术种生物的基天因拼接在一执起，是因为维它们的分子祸都具有双螺啦旋结构，都校是由四种肺_____棍___像____翠构成，基因序中碱基配对巧的规律都是筐山_____卷_____悦。秆（3）人的斗基因在异种凶生物细胞中种表达成蛋白亡质时，需要汇经过泼按和翻译两个懂步骤。在翻蜡译中需要的抢模板是锦轮，原料是氨娘基酸，直接虎能源是AT馅P，搬运工定兼装配工是惠嫁辉，将氨基酸拢的肽键连接候成蛋白质的浸场所是绞_____愤___纹，“翻译”猛可理解为将颜由叫____承个“字母”软组成的核酸太“语言”翻顾译成由呢制个“字母”处组成的蛋白堆质“语言”斯，从整体来塘看膀蔑且在翻译中充侦任着“译员岸”。吃（4）利用抖转基因牛甩、倾羊乳汁提取缠药物工艺简制单，甚至可怎直接饮用治件病。如果将冈药物蛋白基爆因移到动物马如牛章、朱羊的膀胱上猎皮细胞中，坐利用转基因雹牛羊尿液生互产提取药物拌比乳汁提取迷药物的更大枣优越性在于间：处于不同图发育时期的汁拾动物都可生究产药物。兔20.在某害一特定的植吹物基因工程晕中，用土壤奖农杆菌中的厕Ti质粒作灵为运载体。爹把目的基因娇重组入Ti疼质粒上的T栋-DNA片姑段中，再将剩重组的T-银DNA插入广植物细胞的菊染色体DN梁A中。部(1)科学特家在进行上贫述基因操作阶时，要用同黄一种料验驱用匠凳叮分别切割质沈粒和目的基培因，质粒的址黏性末端与攻目的基因D饿NA片段的俩黏性末端就班可通过硬泳巷叔器滤而黏合。虚(2)将携广带抗除草剂捐基因的重组良Ti质粒导肃入二倍体油戒菜细胞，经昌培养、筛选袄获得一株有返抗除草剂特瞒性的转基因吴植株。经分坛析，该植株冰含有一个携攻带目的基因挥的T-DN殿A片段，因枪此可以把它追看作是杂合乞子。理论上匆，在该转基圾因植株自交痒F半1律代中，仍具汉有抗除草剂世特性的植株仇占总数的罚佣股，机(3)种植第上述转基因扣油菜，它所黄携带的目的垂基因可以通负过花粉传递井给近缘物种显，造成防“搂基因污染薄”烈。如果把目芒的基因导入疏叶绿体DN墨A中，就可架以避免档“崖基因污染出”耗，原因是胡叶迷夫锐断辱虚梅谷胜居比仙敲筐烧渴。爬【课后答案青点拨】绵思考与探究垂（P7）洞1.鸟不能。连秩接如下：善电2和7能连狡接形成哥：崇…ACGT佳…侄定堵苍筋喝…TGCA拆…；倍4和8能连醋接形成稍：滨…GAAT幼TC…洋差秒落尾…CTTA榴AG…；京3和6能连涨接形成漠：蓬…GCGC杰…沸坦渡平泡崇…CGCG港…；拜1和5能连循接形成寄：倒…CTGC权AG…壶粮仔淋铺系…GACG协TC…。置解析：限制密酶具有特异蛛性，一种限票制酶只能识贞别特定的碱定基序列，并振在特定的部怜位切开。戴2.联系你河已有的知识被，想一想，馒为什么细菌志中限制酶不旨剪切细菌本乌身的DNA汤？画解析愈：迄今为止啊，基因工程谷中使用的限固制酶绝大部相分都是从细巧菌或霉菌中给提取出来的聪，它们各自捞可以识别和恶切断DNA屈上特定的碱氧基序列。细何菌中限制酶魄之所以不切何断自身DN背A，是因为容微生物在长宁期的进化过糟程中形成了恩一套完善的删防御机制，号对于外源入微侵的DNA赚可以降解掉葡。生物在长昌期演化过程惨中，含有某是种限制酶的泛细胞，其D灾NA分子中欲或者不具备腔这种限制酶腹的识别切割炸序列，或者垫通过甲基化旧酶将甲基转志移到所识别挠序列的碱基电上，使限制饮酶不能将其崇切开。这样载，尽管细菌宗中含有某种馋限制酶也不吴会使自身的者DNA被切膝断，并且可呀以防止外源掌DNA的入您侵（本题不赤要求学生回烧答的完全，稀教师可参考甩教师用书中雹的提示，根茎据学生的具掩体情况，给怎予指导。上蛛述原则也应恰适用于其他刺章节中有关免问题的回答亮。）。顶3.天然的终DNA分子锹可以直接用锻做基因工程辫载体吗？为纪什么？灿解析浸：基因工程诞中作为载体滥使用的DN掏A分子很多截都是质粒（或plasm领id），即光独立于细菌闸拟核处染色辛体DNA之肚外的一种可庭以自我复制街、双链闭环敢的裸露的D葱NA分子。膨是否任何质沃粒都可以作议为基因工程诉载体使用呢茎？其实不然漫，作为基因抽工程使用的冠载体必需满铅足以下条件段。贸（1）载体获DNA必需品有一个或多朝个限制酶的荒切割位点，酒以便目的基求因可以插入阅到载体上去汇。这些供目击的基因插入浙的限制酶的织切点所处的漫位置，还必贝须是在质粒着本身需要的决基因片段之干外，这样才郊不至于因目瘦的基因的插寻入而失活。稀（2）载体沸DNA必需瓜具备自我复阴制的能力，葵或整合到受速体染色体D锻NA上随染节色体DNA佳的复制而同棚步复制。圈（3）载体凯DNA必需迈带有标记基浩因，以便重读组后进行重扫组子的筛选患。俘（4）载体识DNA必需贡是安全的，候不会对受体另细胞有害，键或不能进入停到除受体细什胞外的其他遇生物细胞中汪去。信（5）载体光DNA分子寒大小应适合询，以便提取辟和在体外进柿行操作，太基大就不便操牲作。嫩实际上自然健存在的质粒前DNA分子熊并不完全具觉备上述条件郑，都要进行怕人工改造后显才能用于基榆因工程操作脾。断4.网上查沟询：DNA令连接酶有连蹦接单链DN垮A的本领吗谱？障解析醉：迄今为止浅，所发现的跃DNA连接序酶都不具有宏连接单链D累NA的能力带，至于原因灿，现在还不誉清楚，也许敞将来会发现举可以连接单授链DNA的科酶。音P4汪寻根问底忧：信根据你所掌夜握的知识，鄙你能分析出还限制酶存在泉于原核生物抹中的作用是肉什么吗？射解析追：原核生物厦容易受到自葡然界外源D富NA的入侵磁，但是，生浪物在长期的涉进化过程中符形成了一套捡完善的防御津机制，以防温止外来病原寺物的侵害。老限制酶就是堪细菌的一种怖防御性工具恢，当外源D紧NA侵入时些，会利用限层制酶将外源章DNA切割泼掉，以保证偶自身的安全闹。所以，限底制酶在原核胞生物中主要蒜起到切割外饭源DNA、球使之失效，耐从而达到保昆护自身的目葡的。长寻根问底（沉P6）：驼DNA连接搁酶与DNA循聚合酶是一诵回事吗？为之什么？谊答：不是一犯回事。基因坊工程中所用刺的连接酶有测两种：一种闻是从大肠杆转菌中分离得掘到的，称之英为E资.偿coli连欠接酶。另一枪种是从T4作噬菌体中分按离得到，称暂为T4连接攻酶。这两种秘连接酶催化俱反应基本相谅同，都是连演接双链DN候A的缺口（厅nick）悼，而不能连棒接单链DN坚A。DNA谁连接酶和D饭NA聚合酶惕都是形成磷哑酸二酯键（丘在相邻核苷葱酸的3位碳娇原子上的羟众基与5位碳蹈原子上所连姻磷酸基团的重羟基之间形李成），那么丈，二者的差纷别主要表现搂在什么地方奏呢？悬（1）DN也A聚合酶只狐能将单个核萍苷酸加到已汇有的核酸片贷段的3′末筒端的羟基上淡，形成磷酸可二酯键；而超DNA连接揉酶是在两个使DNA片段门之间形成磷鄙酸二酯键，历不是在单个爽核苷酸与D蠢NA片段之灿间形成磷酸悼二酯键。榴（2）DN候A聚合酶是念以一条DN守A链为模板樱，将单个核膀苷酸通过磷逆酸二酯键形垮成一条与模蛇板链互补的虫DNA链；魄而DNA连书接酶是将D师NA双链上某的两个缺口允同时连接起叙来。因此D湿NA连接酶脖不需要模板让。闲此外，二者耗虽然都是由躲蛋白质构成驼的酶，但组酷成和性质各汤不相同。庭模拟制作讨意论题兼（P6）：抱1.你模尘拟插入的D尊NA片段能呆称得上一个军基因吗？歌提示：不能骡。因为一般骤基因有上千亭个碱基对。叹2.如果剩你操作失误傻，碱基不能吩配对。可能漏是什么原因辜造成的？驱解析楼：可能是剪焦切位点或连语接位点选得择不对（也可巧能是其他原花因）。昨P6厉旁栏思考题售：邻想一想，具慨备什么条件娱才能充当“确分子运输车道”？素解析现：能自我复掀制、有一个睬或多个切割徐位点、有标姻记基因位点怪及对受体细护胞无害等。凡【拓展阅读孕】巾1.演磷酸二酯键薯磷酸二酯键传全称为分3′,5′舱－慎磷酸二酯键臭，冶是核酸中核健苷酸的连接滤方式，组成绑了核酸的一优级结构。在糠核酸中一个懂核苷酸核糖界上第3位的纸羟基与下一谷个核苷酸核援糖上第5位庄的磷酸羟基披脱水缩合成堵酯键，该酯烂键称3′,剩5′狗－圣磷酸二酯键内。若干个核塘苷酸间以3罪′,5′洗－找磷酸二酯键信连接成的多截核苷酸链为炎核酸。在链演的一端的一身个核苷酸核梯糖上第5位姜连接的磷酸柔只有一个酯烘键，称此核宁苷酸为DN抹A链的5′猎磷酸末端或重5′端。另课一端核苷酸蛋上第3位的美羟基是自由辞的，所以此浪核苷酸称为占3′羟基末半端或3′端瞎。链内的核保苷酸第5位宾上的磷酸已轰形成二酯键训，第3位上迟的羟基也已袍参与二酯键掩的形成，故峰称核苷酸残犹基。嚷2.惕骡影响限制性爷内切酶活性见的因素横（1）DN初A纯度孝在DNA样批品中若含有忧蛋白质，或跟没有去除干貌净制备过程燥中所用的乙欠醇、EDT膛A、SDS蓝、酚、氯仿图和某些高浓注度金属离子嫂，均会降低蛛限制酶的催阴化活性，甚赶至使限制酶清不起作用。失（2）核酸究内切限制酶纷的缓冲液请核酸内切限凝制酶的标准途缓冲液包括叉氯化镁、氯精化钠或氯化绘钾、Tri件s-HCL复、巯基乙醇短或二硫苏糖共醇(DTT赛)以及牛血盼清白蛋白(琴BSA)等兰。信使用所有限贼制酶均可发举挥活性的一盼种缓冲液。刃不同限制性再内切酶对N卧aCl浓度帮的要求不同隔，这是不同蜜限制酶缓冲担液组成上的岁一个主要的底不同。据此郊可分为高盐爽、中盐和低抗盐缓冲液，清在进行双酶寇解或多酶解骡时，若这些隆酶切割可在惜同种缓冲液镜中作用良好留，则几种酶材可同时酶切涌；若这些酶仆所要求的缓设冲液有所不惊同，可采用贞以下三种方兆法进行消化疗反应：先用清要求低盐缓迷冲液的限制揉性内切酶消姑化DNA，念然后补足适狮量的NaC种l，再用要富求高盐缓冲束液的限制酶去消化；泼先用一种酶瞒进行酶解，兵然后用乙醇吼沉淀酶解产套物，再重悬蚊于另一缓冲贤液中进行第园二次酶解。辰（3）酶切红消化反应的怖温度笑DNA消化等反应的温度是，是影响限蹲制内切酶活料性的一个重星要因素。不不同的核酸内菠切限制酶，州具有各自的无最适反应温书度。多数限泳制内切酶的啦最适反应温抵度是枕37℃刷，少数限制的性内切酶的欣最适反应温车度高于或低接于怀37℃惯。药（4）DN专A的分子结扫构价DNA分子宪构型对核酸掌内切限制酶哈的活性有很跟大影响，如夺消化超螺旋言的DNA比艇消化线性D抹NA用酶量也要高出许多律倍。眠有些限制酶坡在消化它们惕自己的处于津不同部位的犯限制位点，叼其效率也有闪明显差异。铸限制性内切蚊酶反应的终月止通常是朋采用欲65℃省条件下温浴需5min；呜加终止反应偏液（如0.裹5mol/慨L的EDT匹A使之在溶搂液中的终浓零度达到10青mol/即L）螯合M抄g2，以愤终止反应。径【五年高考瘦回放】纷1．［筐2006四坛川届高考］用基铁因工程技术嗽可使大肠杆大菌合成人的礼蛋白质。下挡列叙述不正耐确的是他()块第A醒．常用相同耍的限制性内即切酶处理目迈的基因和质式粒验B型．侧DNA格连接酶和流DNA女聚合酶是构梨建重组质粒敢必需的工具凯酶野C企．可用含抗软生素的培养挨基检测大肠舞杆菌中是否劫导入了重组闯质粒选D简．导入大肠汪杆菌的目的垫基因不一定歇能成功表达句答案：B俗命解析：率构建重组质坡粒必需的工恳具酶是限制扔性内切酶和锡DNA封连接酶，其巡作用部位是祥磷酸与脱氧庆核糖之间的仪磷酸二酯键驱，而肉DNA救聚合酶的作助用是在涂DNA凯复制过程中蚕用于连接碱垃基间的氢键击，故净B选项错误患。作2．［20翅06江苏高俯考］我国科下学家运用基宽因工程技术感，将苏云金把芽孢杆菌的四抗虫基因导次入棉花细胞携并成功表达返，培育出了怕抗虫棉。下师列叙述不正厚确的是恋(侮)搁A．基因非烂编码区对于察抗虫基因在扎棉花细胞中布的表达不可短缺少法B．重组D口NA分子中谁增加一个碱毛基对，不一覆定导致毒蛋估白的毒性丧肝失织C．抗虫棉滥的抗虫基因择可通过花粉典传递至近缘危作物，从而舒造成基因污集染未D．转基因亮棉花是否具周有抗虫特性朋是通过检测樱棉花对抗生承素抗性来确想定的芽答案：D由局解析：萍基因具有特炉异性，一种肠基因只能控斯制一种性状嫂的表达。抗晒虫基因能表侨达出致毒蛋回白，导致害约虫因食用抗凯虫棉后死亡脸，而不能填产生对抗生跑素的抗性。际因此，转基虑因棉花是否伯具有抗虫特俯性是不能通编过检测棉花样抗生素的抗请性对来确定疮的。旬3．趴[2005绘江苏高考龄]块在植物基因勇工程中，用惠土壤农杆菌伍中的叮Ti货质粒作为运显载体．把目屯的基因重组池入跃Ti么质粒上的孩T-DNA病片段中，再巩将重组的贪T-DNA盲插入植物细乓胞的染色体假DNA预中。窜(1)足科学家在进袖行上述基因冒操作时，要跟用同一种抖菊碍繁分别切割质抓粒和目的基派因，质粒的理黏性末端与量目的基因淋DNA宪片段的黏性殖末端就可通挽过卵涌去而黏合。哪(2)触将携带抗除先草剂基因的座重组玩Ti级质粒导入二惊倍体油菜细描胞，经培养耗、筛选获得殃一株有抗除赤草剂特性的服转基因植株利。经分析，保该植株含有胞一个携带目摔的基因的肝T-DNA勺片段，因此编可以把