体内药物分析

体内药物分析体内药物分析第1页生物样品特点1、被测定药品和代谢物浓度低；2、样品大多需要分离和净化；3、样品量少，连续测定时，极难再度取得完全相同样品。4、工作量较大，5、要求很快地提供结果(毒物检测)体内药物分析第2页样品制备：去除蛋白质、缀合物水解、化学衍生化、分离浓集（液液萃取、固相萃取等）；样品测定：光谱分析法、色谱分析法、免疫分析法、生物学方法方法验证：特异性、标准曲线和定量范围、定量下限、精密度与准确度、稳定性、提取回收率体内药品分析：体内药物分析第3页第一节、常见体内样品制备与贮藏一、体内样品种类、采集与制备（一）血样：血浆、血清血浆：选取最多。因血浆中药浓可反应药品在体内情况。而且血浆中药品浓度数据报道较多，可供借鉴。血浆是全血在加肝素、枸橼酸、草酸盐等抗凝剂全血经离心后分取，量约为全血二分之一。体内药物分析第4页血浆制备：采集静脉血液置含有抗凝剂试管中，混合后，以25003000r/min离心510min使与血球分离，所得淡黄色上清液即为血浆。抗凝剂—最常见是肝素（heparin），肝素是体内正常成份，所以不会改变血样化学组成或引发药品改变，普通不会干扰药品测定。通常1ml血液需用肝素0.10.2mg或20IU(1mg126IU)。可无须准确控制

其它抗凝剂EDTA、枸橼酸盐、草酸盐等，是与血液中钙离子结合试剂，它们可能引发被测组分发生改变或干扰一些药品测定，不常使用。体内药物分析第5页血清制备：采集静脉血液置试管中，于37℃或室温放置30min1h。血液凝固后，用细竹棒或玻璃棒轻轻剥去试管壁上血饼，再在25003000r/min离心510min，上层淡黄色液体即为血清。现文件所指血药浓度为血浆或血清中药品总浓度（游离和血浆蛋白结合总浓度）。体内药物分析第6页血浆与血清区分

血清比血浆只是少一个纤维蛋白原普通血浆中药品浓度与血清中药品浓度相当血浆比血清分离快，而且制取量约为全血50%~60%（血清为全血50%左右），多数用血浆进行分析。若血浆中含有抗凝剂对药品浓度测定有影响时，则应使用血清样品。体内药物分析第7页（二）尿样：尿样测定主要用于药品剂量回收研究、药品肾去除率和生物利用度等研究，以及测定代谢物类型等。体内药品去除主要是经过尿液排出，药品能够原型（母体药品）或代谢物及其缀合物形式排出。尿样常需加入防腐剂。

体内药物分析第8页成人一日排尿量为15L。尿样包含随时尿、晨尿、白天尿、夜间尿及时间尿几个。因尿液浓度改变较大，所以应测定一定时间内排入尿中药品总量。普通采集时间尿（要求时间内采集尿液体积和排入尿中药品总量）。尿液中药品浓度改变不能直接反应血药浓度，即与血药浓度相关性较差、尿液量较大不易保留等。体内药物分析第9页（三）、唾液：

唾液中药品浓度通常与血浆浓度相关。样品易得，取样无损害，尤易为儿童接收。有些可从药品唾液浓度推定血浆中游离药品浓度。

唾液由腮腺、颌下腺和舌下腺三个主要唾液腺分泌聚集而成前二者分泌量占总量90%。二者中浓度大致相当。取样：在潄口后15min，平静状态下采集口腔内然流出唾液；也可在刺激下快速采样(需注意干扰)。如口嚼石腊片或将柠檬酸、维生素C等置于舌尖，弃去初始个别后采集。刺激后采集为混合唾液。体内药物分析第10页药品在脏器组织中分布情况，常见胃、肝、肾、肺、心等。制备：测定之前普通需制成匀浆组织样品处理：沉淀蛋白法、酸水解法、酶水解法

（蛋白水解酶）（四）组织：体内药物分析第11页（五）头发：应用—

体内微量元素含量测定

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用药史预计

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临床用药和药品非法滥用区分

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毒性药品检测体内药物分析第12页头发样品采集：采集枕部发样(带根部），微量元素在前额部位头发中含量最低，枕部含量最高。头发样品洗涤：除去外源性污染物，推荐使用丙酮-水-丙酮；丙酮浸泡搅拌10min，自来水漂洗3次，再用丙酮浸泡搅拌，自来水、蒸馏水各洗3次。头发样品处理：直接甲醇提取、酸水解、碱水解、酶水解（葡萄糖醛酸酶）

体内药物分析第13页三、体内样品贮存与处理（一）冷藏与冷冻血浆和血清需采集后及时分离，普通最迟不超出2h，分离后再置冰箱或冷冻柜中保留（-20~-80℃）。尿样应马上测定，若搜集24h尿液不能马上测定时，可加入甲苯、氯仿、醋酸等防腐剂，普通可保留24~36h，也可加入叠氮化钠较长时间保留。唾液在保留过程中会放出二氧化碳使pH值升高。另唾液中含有粘蛋白，须离心后冷藏或冷冻（二）去活性终止酶活性方法：快速冷冻、微波照射、加入酶活性阻断剂等。体内药物分析第14页分析方法与样品处理步骤选择第二节、体内样品前处理体内药物分析第15页一、体内样品预处理目标1、使药品从缀合物及结合物中释放出来，以测定药品总浓度。2、介质复杂，干扰物多，待测物浓度低，须分离干扰物质、富集待测药毒物3、为了适应和符合测定方法所要求灵敏度4、为了预防分析仪器污染、劣化，提升检测准确度、精密度和选择性等。

体内药物分析第16页二、常见体内样品预处理方法要考虑：药品理化性质（极性、酸碱性、光谱特征、挥发性、稳定性），药品测定目标，选取生物体液和组织类型，待测物浓度范围，样品制备与分析技术关系。

体内药物分析第17页（一）、去除蛋白质

是测定血浆、血清、全血及组织匀浆等样品中药品时最先处理步骤。1、加入可与水混溶有机溶剂（体积比、pH值）破坏蛋白质分子内及分子间氢键。常加入乙腈、甲醇、乙醇等，能使与蛋白结合状态药品释放，将混合物超速离心，取上清液作为样品。

体内药物分析第18页2、加入中性盐使蛋白脱水而沉淀，硫酸铵最常见3、加入强酸与蛋白形成沉淀，阴离子型沉淀剂。如三氯醋酸、高氯酸、偏磷酸等，在酸性下分解药品不宜用本法去蛋白。4、热凝固法加热至90℃蛋白热变性后离心或过滤除去体内药物分析第19页体内药物分析第20页

（二）分离、纯化与浓集当药品浓度较低或分析方法特异性或灵敏度不够高时，生物样品需分离、纯化与浓集。体内药物分析第21页1、液相萃取法溶剂选择—适当溶剂是成功主要条件①了解药品与溶剂化学结构及其性质②对药品未电离分子可溶，对电离形式分子不溶③沸点低、易挥发，毒性小与水不相混溶④不影响紫外检测⑤含有较高化学稳定性和惰性⑥不易乳化体内药物分析第22页23化合物名称极性粘度沸点吸收波长Hexane(正己烷)0.060.3369210Cyclohexane(环己烷)0.1181210Toluene(甲苯)2.40.59111285Ethylether(乙醚)2.90.2335220Methylenechloride(二氯甲烷)3.40.4440245Ethylacetate（乙酸乙酯）4.300.4577260Chloroform(氯仿)4.40.5761245体内药物分析第23页提取溶剂：极性相同相溶溶剂用量：普通有机相与水相之比为1：1~5：1溶液pH调整：最正确pH选择主要与药品pKa值相关。酸性药品pH应低于药品pKa值1~2个单位；碱性药品：pH应高于药品pKa值1~2个单位。提取：进行一次（至多二次）提取，浓集：常见吹氮气使溶剂挥散，或减压蒸发（注意暴沸）。体内药物分析第24页生物样品宜在碱性或近中性提取，生物基质中内源性物质多为酸性，在碱性下不易被萃取出来。空白血清在pH2、pH7和pH13三种缓冲液中用乙醚提取，提取液HPLC(220nm)测定，在pH13下提取液中杂质峰最少。体内药物分析第25页液液萃取特点：优点：可将大个别内源性杂质去除；经济实用、可使样品富集、可一次进行多个样品萃取缺点：乳化、污染环境、乳化去除：加少许固体氯化钠到水相中可减轻乳化；轻微乳化离心；严重乳化低温冰箱快速冷冻破坏乳化层后融化离心。体内药物分析第26页2、固相萃取法：

以固相分离方法进行样品预处理，从水相中分离出所需测定组份，通常以柱分离方式进行操作，故有时这种方法又称为固相提取活化上样淋洗洗脱洗脱液浓集体内药物分析第27页28体内药物分析第28页固相萃取模式及原理反相固相萃取正相固相萃取离子交换固相萃取①阴离子交换②阳离子交换体内药物分析第29页试验步骤

第一步：用甲醇润湿小柱，活化填料第二步：用水或适当缓冲液冲洗小柱—除去大个别甲醇第三步：加样，使样品经过小柱，弃去废液第四步：用水或适当缓冲液冲洗小柱，去除内源性杂质第五步：选择适当洗脱溶剂洗脱被分析物，搜集洗脱液，挥干溶剂，备用或直接进行在线分析

血浆样品可直接上柱，样品量0.1~2ml，流速1~2ml/min体内药物分析第30页31本法特点：少溶剂、少污染、降低液液萃取乳化。适合各种液体检材如血、尿、洗胃液、现场水、饮料等，对于肝、肾、胃以及其它固体检材，均需制成水液方可进行固相萃取。

体内药物分析第31页

柱切换高效液相色谱技术是指由阀来改变流动相走向与流动相系统，从而使洗脱液在一特定时间内从预处理柱进入分析柱技术。用两个或两个以上柱子连接组成色谱网络系统，使不一样柱子到达不一样分离目标，柱子间用切换阀联结，这就是柱切换技术。基础原理是首先在预柱上实现生物体液中干扰大分子与待测药品分离，然后用柱切换将待测药品从预柱转移至分析柱上完成色谱分析。自动化固相萃取-柱切换高效液相色谱法体内药物分析第32页体内药物分析第33页3.超滤法膜分离技术，可用于测定生物样品中游离药品浓度按照分子截留量大小，可分离301000kD可溶性生物大分子物质。可加压过滤或高速离心。体内药物分析第34页（三）、辍合物水解：酸水解法：强酸、加热酶解：常见葡萄糖醛酸酶，普通控制pH4.5~5.5，37℃孵育数小时。溶剂解：体内药物分析第35页（四）、化学衍生化1、使药品变成能被分析性质2、提升检测灵敏度3、增强药品稳定性4、提升对光学异构体分离能力气相色谱衍生化液相色谱衍生化体内药物分析第36页衍生化方法：柱前衍生，柱后衍生气相色谱衍生化方法：硅烷化、酰化、烷基化、不对称衍生化液相色谱衍生化方法：紫外衍生化、荧光衍生化、电化学衍生化、手性衍生化

体内药物分析第37页第三节、体内样品分析方法与方法验证一、分析方法建立（一）、分析方法选择1、色谱分析法2、免疫分析法3、生物学方法体内药物分析第38页

常见分析方法特点分析方法检测程度/10-8g/ml特异性/分离能力紫外分光光度法（UV）100－荧光分光光度法（Fluor）0.1+原子吸收光度法（AA）0.1+

气相色谱法（GC）

氢火焰离子化检测器（FID）1～10++

氮磷检测器（N-PD）0.1～0.01+++

电子捕捉检测器（ECD）0.01+++

质谱检测（MS）0.001++++高效液相色谱法（HPLC）

紫外检测器（UV）10++

荧光检测器（Fluor）0.1+++

电化学检测器（ECD）0.01～0.001+++

质谱检测

++++免疫法（RIA）

酶免疫法（EIA）0.001++

0.001++放射免疫0.001体内药物分析第39页（二）、分析方法建立普通程序1、色谱条件筛选：确定最正确分析检测条件；色谱柱(型号、牌号、填料性质、柱长度)；流动相组分及配比、流速、柱温、进样量、内标物质浓度及其加入量等；使各物质含有足够方法灵敏度(LOQ)；良好色谱参数(n、R、T)和适当保留时间(tR)。体内药物分析第40页2、色谱条件优化：

在进行分离条件筛选时，应考查生物基质中内源性物质及代谢产物对分离与检测干扰，步骤以下：

空白溶剂试验

——溶剂(方法特异性)

空白生物基质试验

——内源性物质干扰(方法特异性)

模拟生物样品试验

——方法验证（效能指标）3、实际生物样品测试体内药物分析第41页二、分析方法验证 1．特异性——防止干扰

2．标准曲线与线性范围

3．定量限——灵敏度

4．精密度与准确度——结果可重现

5．样品稳定性

6．提取回收率

7．分析过程质量控制

准确度精密度专属性检测限定量限线性范围耐用性体外药品分析体内药物分析第42页（一）、方法特异性(专属性或选择性)

方法特异性(specificity)

——又称专属性或专一性，通常与选择性(selectivity)互用

——系指当有内源性物质存在时，方法准确测定待测物质能力 专属性——表示所检测信号(响应)系属于待测药品所特有 选择性——系指将待测物质与其代谢物及同服其它药品加以区分(分离)能力

体内药物分析第43页

考查一个分析方法是否含有特异性，应着重考虑以下几点：1.内源性物质干扰比较——待测药品或其活性代谢产物检测信号；2.代谢产物干扰比较——模拟生物样品和用药后实际生物样品检测信号；3.伍用药品干扰还要考虑患者可能同时服用药品(通常为数有限)干扰。提供三张色谱图，空白生物样品图、空白加对照、实际生物样品图；4.与参比喻法相关性体内药物分析第44页（二）、标准曲线与线性范围

标准曲线（standardcurve）

——生物样品中所测定药品浓度与响应相关性

——除少数方法（免疫分析法）外，标准曲线通常为线性模式，最小二乘法或加权最小二乘法回归。线性范围：标准曲线最高Cmax与最低浓度Cmax/20区间

——模拟生物样品测定结果应到达试验要求精密度和准确度体内药物分析第45页标准曲线要求

标准曲线——用模拟生物样品（与待测含药生物样品相同生物基质）建立

——线性范围(不包含零点)应能覆盖全部生物样品药品浓度

——不能使用外推方法求算未知生物样品中药品浓度

体内药物分析第46页标准曲线绘制

以待测药品检测响应(如色谱峰面积或峰高)或与内标物质检测响应比值(内标法)(因变量，

y)对模拟血药浓度(自变量，x)

——求得回归方程(y＝a＋bx)及其相关系数，()≥0.99(色谱法)或≥0.98(生物学方法)

要求最低浓度点偏差在±20%以内、其余各浓度点偏差在±15%以内。

体内药物分析第47页（三）、定量下限

——系指在确保含有一定可靠性(准确度与精密度符合要求)前提下，能测定出生物样品中药品最低浓度，又称为方法灵敏度

——标准曲线上最低浓度点(最低浓度点≥LOQ)

要求——应能满足测定3～5个消除半衰期后生物样品中药品浓度；准确度在80%～120%；RSD＜20%体内药物分析第48页（四）、精密度与准确度

方法准确度

——系指用该方法测得生物样品中待测药品浓度与其真实浓度靠近程度

——应使用实际生物样品测定，但实际生物样品浓度是未知，所以通常使用模拟生物样品测定

——普通用相对回收率表示体内药物分析第49页

测定：

取高(靠近上限)、中、低（定量下限3倍以内）3个浓度，每一浓度最少5个样本，与随行标准曲线同法测定、计算方法回收率

程度要求：

——相对回收率应在85%～115%(LOQ附近80%～120%)

——RE在±15%(LOQ附近为±20%)体内药物分析第50页

方法精密度(precision)

——系指每次测定结果与屡次测定平均值偏离程度

——表示该分析方法可重复性

——反应分析方法可操作性，是方法验证基础关键点 实际生物样品量有限(如血浆，普通为0.5～2ml)

——使用模拟生物样品测定

体内药物分析第51页测定法

照准确度项下方法，取空白生物基质(如血浆)数份，分别在同一批内和不一样批间制备高、中、低3个浓度QC样品，并分析测定

批内RSD

——每一浓度5个样品，每个样品测定1次，用随行标准曲线分别计算3个浓度及RSD

批间RSD

——每1分析批内每一浓度制备1个样品，每个样品测定1次；在不一样天连续制备并测定3个合格分析批，最少45个样品。体内药物分析第52页程度要求

在药代动力学和生物利用度研究中 对g/ml级水平RSD普通应≤10% ng/ml级水平RS