基因工程综合性教学实验

基因工程综合性教学实验大肠杆菌碱性磷酸单酯酶基因克隆表达纯化吴海珍王善利赵健俞建瑛张惠展华东理工大学应用生物学系二○○五年一月第一部分写碱性磷酸单回酯酶基因的蒜定位、克隆饭与表达艰实验流镜程图慨碱性磷酸单辣脂酶基因在括染色体DN疮A上的杂交透定位愿――代South拖ernB享lotti承ng浑偿绿碱性磷酸单配脂酶基因的向体外扩增尝――圣PCR扩增饺生拜PCR体外座扩增片段的议克隆连接于边T-载体菜――竿连接已闪址连接产物转江化大肠杆菌浮受体菌狭――寨转化愿串牛转化子质粒钉DNA的抽震提期――掏快速法制备的质粒好便姨转化子的鉴幸定兆――残限制性内切增酶酶切然隶望目的转化子品DNA的大窗量制备贺――卖碱法抽提质绘粒DNA救确亿酶切回收克陪隆的目的基露因片段土――尊回收目的基随因表筛虽重组表达型用质粒的构建暮――治连接、转化舰、鉴定婆剖似重组大肠杆感菌目的蛋白足的表达雕――耐蛋白电泳鹅仿实验路背线刷1DN洞A的酶切执摘要飞本单元刮主要介绍限瞒制性核酸内歪切酶的各种倦特性、酶的例保存方法和脏使用注意点纹，多种酶联聪合酶切的常助用策略等。牛1.1实验吧原理别DNA重组纠技术中的第胃一步是从不办同来源的D组NA（染色挽体DNA或临质粒DNA课）上将待克怀隆的DNA陷片段特异性私切下，同时鄙在载体DN极A分子（一槐般为质粒D白NA）上打洞开相对应的深缺口，然后抓将两者连接券成重组DN疲A分子。这聚一特异性的客切割过程常偿由特定的限件制性核酸内牌切酶来完成都。姓限制性核酸膊内切酶几乎浇存在于任何屯一种原核细赵菌中，它能挤在特定位置秧上催化双链锯DNA分子萝的断裂，产集生相应的限拖制性片段。售早在20世既纪50年代专初微生物体霜内的限制核漠修饰作用就族已发现，1障0年后细菌驰的限制和修水饰作用的分帜子机制被阐慧明。以大肠垫杆菌为例，替在K株和B蛮株中都含有索各自不同的宵限制遮――吧修饰系统，酿两种不同来绪源的－噬菌跃体（场K狼和者B顶）长期寄生牢于各自的宿炸主细胞中，虽宿主细胞内细的甲基化酶材已将其染色功体DNA和宗噬菌体DN括A特异性的赖保护，封闭炒了自身所产清生的限制性挨核酸内切酶救的识别位点勤，故它们在法感染相应的姨宿主细胞（换K株和B株视）时DNA贩不被降解，惧因此感染频吼率很高。当腔它们分别感绘染其他宿主嗽细胞时，由遣于没有特异强性的保护作槽用，入侵的写DNA分子伶被宿主细胞州的限制性内巩切酶切割降牢解，从而感晕染频率急剧推下降，普遍屠能低一或几劣个数量极。咸这一现象普棋遍存在与原南核细菌中。够但由于宿主梢细胞内的降桶解作用的不栗完全，入侵肥的DNA分勉子总有极少恰数能完整保敬留下来并得羽以在细胞体木内复制，而开且在复制过痰程中被宿主串细胞的甲基赚化酶所修饰蝇。这修饰过万的DNA分氏子再重新制弱备后导入该赛宿主细胞时批，感染频率探又能恢复到晶原来的高位民，即限制毕――荣修饰作用被雅解除。掌碌限制性核酸灾内切酶的分麻类坑目前在细菌究中发现有6吧00多种限奴制性核酸内构切酶，根据添其性质不同胳可分为三大奖类（见表1奖-1）。其村中II类限量制性核酸内吓切酶与其所址对应的甲基押化酶是分离牧的，不属同苍一酶分子，翠而且由于这胀类酶的识别浅切割位点比号较专一，因译此广泛用于析DNA的重饰组实验。I辈类和III捐类酶严格地却说应该称为异限制睁――省修饰酶，因嚷为它们的限务制性核酸内捡切活性及甲竹基化活性都榨作为亚基的斑功能单位，钱包含在同一骨酶分子中。吐表1-1各享类限制性内讨切酶的特性膜I类酶昨II类酶爬III类酶轮酶分子孕三亚基双功贡能酶准内切酶和甲睡基化酶分开喊二亚基双功危能酶殿识别位点快二分非对称亩序列甘4～6bp夸短序列，晋大多数为回戒文结构调5～7bp鹿非对称序列棍切割位点考距离识别位部点至少亿1000狸bp，无特珠异性医在识别位点搏中萝或靠近识别贿位点懒在识别位点巧下游24～娘26bp处拦限制性反应甚与甲基化反粱应热互斥匪分开的反应黄同时竞争运限制作用所雾需的辅因子眨ATP、M水g电2+铜、源S-腺苷甲递硫氨酸胶Mg趴2+思ATP、M碍g厉2+邻、S-腺苷络甲硫氨酸（屡非必需）锅DNA重组盏中的用途璃无婆有丧无诚齐II类限投制性核酸内惩切酶的基本抗特性举II类限制要性核酸内切傻酶是Smi茫th等人于龙1968年题在流感嗜血哗杆菌d型菌碰株中发现的落。该类酶是个一种分子量堂较小的单体挑蛋白，其双还DNA的识估别与切割活瑞性仅需要M咽g2+，且催识别与切割涛位点的序列再大都具有严烈格的特异性邪，因而在D步NA重组实雷验中广泛使抗用。尚目前已分离败出400余贫种II类限炕制性核酸内散切酶，鉴定方识别及切割镰位点的有3佣00多种，摊商品化的酶搬NEB（N凝ewEn肺gland蜻Biol瓜abs）公娇司品种最多言，达220警余种，其中滨在DNA重宇组实验中常乞用的有20老多种。这些行酶的统一命作名由酶来源据的生物体名许称缩写构成发（见图1-饥1）德图1-1宁限制性内切近酶的命名原述则与示例袭泊.1识别位直点搅II类限制声性内切酶的毫识别位点具累有180宪°风旋转对称的吩回文结构，象常用的识别武序列往往为爹6个碱基对篇，例如Hi滴ndIII蚁的识别序列气：为其中一部分携的识别序列雷某一或某两宵位碱基并非漆严格专一，史但都在两种添碱基中具有棵可替代性，筐这种不专一意性并不影响忌内切酶和甲硬基化酶的作构用位点，只分是增加了D误NA分子上防的酶识别与巨作用频率，虑例如Ava令I的识别序栽列就是典型绑的结构：概 月有的酶识别罢位点为4或摩5碱基对，盆如AluI缩、HaeI鬼II和Sa凑u3AI（宽见图1-2回）等，在D至NA上的出鞭现频率则较网高，而象S远au3AI张切割DNA知后产生的是久粘性末端，梯且与Bam葱HI切割后莲的粘性末端毕相同，为大酒规模克隆提梦供了可能。杨实际应用中寸利用Sau清3AI高频测现象，结合突DNA的部苍分酶切策略子进行研究也挖是常用的实拴验手段。考图1-2孕限制性内切偶酶的命名原秆则与示例歼另外一些不役常见的酶识边别位点相对旺较长，在D对NA链上出扁现频率也相捐对较低，如至FseI（尝5或’使-GGCC戴GGCC-想3按’哑），出现频巾率为1/4捕8占=1/6挥5kb。实愚际上由于不假同生物体的猾DNA碱基税含量不同，涨酶的识别位被点的分布和约频率也不同勒。大肠杆菌少基因组中A痰T含量较丰要富，所以富慢含AT的识岔别序列（如赞DraI：个5心’午-TTTA撤AA-3转’窃；PshB策I：5嚼’-ATT豪ATT哲-3诸’蓄；SspI插：5厦’粉-AATT胸AA-3见’束）较为频繁栗的出现，而什链霉菌基因便组因GC含国量高，相应识的富含GC陆碱基对的识书别序列（N雀aeI：5害’典-GCCG起GC-3右’凶；SmaI大：5村’祸-CCCG递GG-3乎’汇；SacI斤I：5黑’袜-CCGC钥GG-3秆’帅）较常见。揪疯.2粘性末垄端丘限制性内切吐酶切割DN要A产生的末宿端根据被切赢开的DNA晓末端性质的塑不同（不考覆虑碱基序列同）可分两大氧类：平端和绞粘端，而后察者又可分为敬3殃’图-OH突出圾或5抚’惭-P突出两摸种，分布情买况见图1-汇3，故DN桂A分子的连踢接通常发生顿在同种限制尖性内切酶酶揉切后的DN烧A间。核图1-3祖DNA酶切突产生的三种驴末端氏实际上DN暖A重组应用首中，由于不如同限内酶酶胸切能产生相堂同粘性末端旨，因此DN哲A分子的连烛接可发生在齐不同限内酶革之间，常见鲜的DNA分假子连接情况钞见图1-4兆。而在重组错工作中如没冷有合适的酶怎切口产生相蛾同的粘性末楼端，则可对晴酶切后的突姑出粘性末端预进行补平，尚采用平头连侨接策略。稀图1-4匠DNA粘性昏末端的连接棕效果宵辈.3甲基化秋影响项大多数大肠蜜杆菌菌株中哭含有篮Dam害甲基化酶和简Dcm骡甲基化酶，悦前者可以在麦GATC序砌列中腺嘌呤宏N-6位上方引入甲基，忆后者在CC强A/TGC扩序列的第一顽个胞嘧啶C迹-5位置上旗引入甲基。虫部分限制性定内切酶对甲范基化的DN独A不能切割飞，如Fba句I和Mbo翅I等，一般造生物公司提拜供的内切酶球说明中均有用说明。而要垒解除这种限衣制修饰作用胜通常有两种仗方法：（1惠）选用上述球酶的同功酶添，如Sau哑3AI，D乞NA识别切往割位点与M帽boI相同馋；但不受甲色基化影响；踢（2）利用裤甲基化酶缺刮失的受体细族胞进行DN持A的制备，膛如及E.col禽i希JM11加0和链霉菌脱等，前者民Dam碎和式Dcm教甲基化酶已占敲出，而后鞠者细胞内本气就没有甲基基化酶，从这喜些细胞中抽湾提的DNA伙就能被上述忍酶切割。投开.4近末端申切割习基因工程的群操作中经常花要对和DNA辉片段进行精慨细切割，在毯PCR产物才中有些甚至稳只切割一个京碱基对。不吼同的内切酶可对裸露的酶北切位点不能种切断，因此积必需在酶切槽位点外侧加唤上一个或几庸个保护碱基春，表1-2肯中列举了常符用的十五种攻内切酶在不内同保护碱基馅下的切割效渣果，一般保倘护碱基大于嫌三个碱基对拜时能完全切挺割。但是在烫有些PCR泻产物中即使裙保护碱基大垫于五时也不猾一定能被有角效切断，这因可能是PC痛R产物纯化畏中残留的杂苗质影响酶切脱或是PCR蛇产物末端聚膏合不完整。活表1-2傲DNA末端骑酶切位点的疼切断情况蛾Enzym帖e役末端碱基数撕0贷1馆2蜡3凭BamHI窜-鹅+选+资+腹BglII碑-柱-丙±绘+叼ClaI斥-燃±永+的+贼EcoRI松-倒±智+样+列EcoRV卧-锤+庭+袍+叔HindI惩II逃-苹-拼-灰+恰KpnI断-脖-养+高+循NcoI葬-细-蹄+租+肿PstI看-小-得±堡+搭SacI劳-霜±犹+貌+幸SalI掘+吐+惠+少+嘱SmaI宋-猾±御+宣+呼SphI芝-舱-弦+祖+齿XbaI钉-格±粒+棉+结XhoI池-滑-嘴±惕+到-：不能切贿断；拆±检不能完全切钞断；攻+严：完全切断易1.1.攻3限制性核寸酸内切酶的霜使用厚限制性核酸装内切酶在基功因工程属常堵用工具酶，挎主要用于基馆因物理图谱弓的绘制、基础因片段的鉴侧定或获得、渗用于杂交的葱DNA探针洽的制备等，跪而酶切的条睡件控制则是致非常重要的牢。收1.1.臣3.1作用待条件场在DNA的康酶切反应中凭酶切条件是她酶切成功的倡关键，主要配影响因素有业：师反应温度顺常规酶切店反应均屑在37提℃轨进行，但有销些酶的最佳搬反应温度并强不是此温度劣，如段SmaI，翁最适反应温锄度为30联℃顺，故最好根疮据所选用的声酶确定反应朋温度。当采腰用联合酶切歼进行实验时季尤其要注意非选择的反应顺温度是否都异满足两者的误要求，如果茧有一个酶的惑最适温度不嗽符，建议分沿步酶切（见滚1面.1.3.密3喊）。染缓冲体系界厂商提供数的私限制性核酸稿内切酶有其形相对应的缓三冲液，一般喝的缓冲液种暗类堆为4兼-台10险种左右，按户盐离子浓度者可分为三大估类：高盐、企中盐和低盐坦。缓冲液配蝴制为10路×捷的母液，酶店切时稀羽释10倍。江常规酶切中蝴均选用最佳颈缓冲液进行丢酶切反应，膛但联合酶切脏时，根据厂疤商提供的联芳合酶切的缓海冲液选择表智（宝生物工钱程公司）选著择缓冲液或碧采用万能缓蹲冲液（Pr激omega注）。揭反应时间蓬常规酶切鸽反应时间为完1辅.5跌小时，但可趣根据酶切对膝象和酶的用羡量将保温时羞间延长2～扁3小时，有小时甚至可以萍过夜。一般火来说，在D皱NA量固定速的前提下，章长时间酶切等所需的酶量代可适当减少并，所以在大候剂量酶切D银NA时，可冻以考虑酶切素过夜。另对飘特殊实验，隙如对基因组印DNA进行菜部分酶切，庆则在酶量投感入一定的前训提下，减少挨反应时间降老低对DNA掘切割的程度誓。细加入酶量凳在底物（房DNA）一窗定的条件下宴，酶量投入曲越多则酶切诊效果越好。渔但实验中常扰常出现酶量内加入过多酶厘切效果反差瓦的现象，这台主要是酶的瓣储存液中含蓝有50％的滨甘油，但酶微量加入过多延，超过酶反拴应体系的1鉴0％时，过云多的甘油抑彼制了限制性生内切酶活性紧。因此，在矛酶切反应时梅，酶量的加含入原则：不栋超过反应总败体积的10当％，在能切饰开的条件下予加入越少越粒好（可减少渡酶的Sta宇r活性）。罢DNA纯度销在满足捎上述条件下低影响酶切效饿果的主要因指素是DNA傲的纯度，D萄NA样品中施蛋白含量过能高、有机溶撤剂（苯酚或当氯仿）的残决留、高浓度迎的RNA等日。另外DN执A浓度过高延也会导致酶倘切失败，一裹般DNA的昌质量浓度在紧1跃g/偶l访体系中能取嘉得好的酶切踪效果。当发湾生不明原因协的酶切失败每时，常用的僚解决方法是嗽采用稀释酶校切，即将酶剪切体系放大分（如从15姓l-->纵30屈l柴），将杂质妥相对浓度稀拾释，这样不码需多增加酶惯量就能取得轮较好的酶切转效果禽1.1.拿3证.2宗酶切方式口酶切方式可剃分为部分酶躲切与完全和酶切：屋部分酶切茧指的是同炸一肝DNA片段猾上的位点有戴些被切开而豪另一些未被阔切开，此法恒主锣要用于基因分的克隆。在患某些基因内出部可能有此偏酶的切点，妥用完全酶切盾进行克隆时李难以得到完雄整基因。部晶分酶切实施附方书法：闭a汁）在摔不同的时间臭从同一个酶烧反应管中取势样终止反应鱼，利用时间武控制酶切程珠度，该方法沫比较繁琐，吨不易掌握得症恰到好处监；b）固定碍酶切的反应朱温度和反应言时间，局控制酶的投珍入量，一般烧是在反应管贸中加入不等蹈量稀释的酶先，利用不同唐酶浓度控制脆酶切程度，否该方法因易切控制而被广柿泛应用。薯完全酶切浓适用于除笨目的基因克笑隆以外的绝受大多数DN夸A操作，例笋如坝载体的切割拘，酶切图谱艘的制作，基热因的鉴定与辫DNA片段梳的分离等。扒1.1.料3填.形3双酶切的锹解决方法蚕在DNA重奔组实验中，苗经常会用双丛酶切（甚至脱是3个酶切核鉴定）鉴定酒重组子或获沟得不同粘性墙末端的DN猴A片段，而均在厂商提供现的图联合酶切缓逢冲液表中并酒不包括所有贪类型的酶，虎即使提供了脾“或万柏能缓冲液贱”不，有些酶的阁联合酶切也奸不一定能取僚得比较好的贴效果，这里早介绍两种通愁用的解决方裁法：恶分步酶切法要对将进交行的两种酶碗的酶切采用湿分步的方法蛋，即先选择垒一个酶，采村用此酶的最炭佳反应条件乒进行酶切，艇酶切完全的恋DNA进行腾沉淀后再溶绑解，然后选枕用第二个酶筹进行最佳反苹应。在酶切身时，一般选结择便宜的酶喷进行酶切沉伍淀，而后在猎进行第二个识酶的酶切反政应。此方法迫通用性较强劝，联合酶切扶也比较完全浅，但较耗时蚕，而且DN敢A在沉淀时欢后有部分损刘失，要求开协始时DNA盒的投入量要塞比较高。普同步酶切法合取两种暂酶的最佳缓秋冲液各50柔％加入到酶称切反应体系贪中，并同时窗加入两种酶告进行反应。乔特别是对不芹同厂商提供叫的酶进行联爱合酶切时，屿即可节约时瓶间也可取得戒比较好的酶痒切效果。港1.1.奋3芬.柱4酶切反应三设计因在进行酶切游反应时，首你先要确定需勉切割的DN芬A量，根据茶DNA的疏量确定总反茎应体系和酶狂量（最多占从1/10）明，一般体系贷如下：溪total两(杏l)您 碰ddH寸2翅O(超l)率 算10穿×毒Buffe紫r(脊l)炒 出Enzym蛙e(匙l)发 聚DNA(5根0ng/承l)英20厅 晨14.5所 惨2昆 汁0.5沟 崇3哭一般较好的宫酶切体系D剖NA的投入块量不高于1禁.5归g/50较l，当DN态A的投入量追为1.5愿g/20眯l时酶切将尽发生困难。谱加样顺序：对水-->缓悔冲液-->诉DNA--笨>酶。各组钉分加完后要买混合均匀，世并用离心机泳低转速将溶葛液离心至管托底。转1.1.及3途.照4酶切失败阁的原因及处摧理办法爽酶切失败主馅要表现为两月方面：喉不完全酶切窗甚至是DN张A基本未发伟生酶切；主勺要原因有：鸭a）缓冲体牧系不合适，巾可进行重新野酶切；b）证酶量加入过矛多而导致甘劝油抑制酶活起，可将反应没体系适当稀杯释；c）D泰NA样品杂谈质含量高，奖可采用稀释替酶切或将D责NA样品重树新抽提后酶牺切特DNA被降聪解（不成带晨状）；主要颂原因是DN披A样品中含袄有痕量的D促NA酶，建争议重新抽提莫除去DNA勒酶。助1.2试剂贫与器材羡1.试剂旋 罢（1）常用呆的限制性内桥切酶精 类（2）酶切饶缓冲液，购舞酶时附贴 虽（3）无菌丙双蒸水雷 集（4）DN值A样品始2.器材腿 构（1）ep泥pendo估rf管锋 蒜（2）枪头翅 庸（3）恒温插水浴医 扩（4）移液也器 株1.3实验距步骤凑2草DNA倦的凝胶电泳碑摘要青本单元确主要介绍D杆NA电泳的产基本原理及楚各种影响因绸素，学习制维胶，电泳等扣基本分析技匀术。包2.1实倚验原理言DNA电泳喝是基因工程税中最基本的吸技术，DN雹A制备及浓哑度测定、目散的DNA片肺段的分离，影重组子的酶做切鉴定等均乘需要电泳完灾成。根据分和离的DNA柿大小及类型脱的不同，D锣NA电泳主基要分两类：衰（1）聚丙网烯酰胺凝胶蜜电泳适宪合分离1唐kb宴以下的片段乒，最高分辨诵率可达1复bp它，也用于分梯离寡核苷酸素，在引物的密纯化中也常尤用此中凝胶巷进行纯化，些也称PAG储E纯化。男（2）琼脂杨糖凝胶电泳拍可分离滑的DNA片裙段大小因胶青浓度的不同认而异，胶浓故度为混0.5暗～0.贤6%牙的凝胶可以青分离的DN竭A片段范围可为20会bp饺～50段kb狱。电泳结果艰用溴化乙锭物（EB）染梨色后可直接痰在紫外下观沈察，并且可奔观察的DN扇A条带浓度欺为纳克级，麻而且整个过久程一般1小完时即可完成构。由于该方葛法操作的简府便和快速，夺在基因工程滔中较常用。保2沫.1.1难琼脂糖凝胶怕琼脂糖是从踏琼脂中分离期得到，由1脸，3连接的荣吡喃型尸-D-门半乳糖和1木，4连接的萄3，6脱水残吡喃型阿悦-L-毅半乳糖组成脉，形成相对舒分子量为1要0预4架～10祖5厘的长链。琼承脂糖加热溶贩解后分子呈循随机线团状膛分布，当温耗度降低时链擦间糖分子上限的羟基通过今氢键作用相朴连接，形成杆孔径结构，确而随着琼脂渴糖浓度不同晌形成不同大堡小的孔径。虎表2溪-1膨给出了不同初浓度凝胶对垮DNA片段允的线性分离骂范围。然表2扇-1撇不同类型琼条脂糖分离D济NA片段大球小的范围缘琼脂糖/％跨标准喇高强度缓低熔点吉低粘度低熔为点姿0.3巴0.5鹅700bp度～25kb瑞0.8察500bp柴～15kb预800bp看～10kb醋800bp炮～10kb造1.0岗250bp驻～12kb赖400bp何～8kb壮400bp恶～8kb牵1.2畜150bp狱～6kb钟300bp园～7kb搏3划00bp~刮7kb伞1.5羊80bp~冈4kb重200bp由~4kb搭200bp赠~4kb该2.0甘100bp慨~3kb秘100bp让~3kb梢3.0纽500bp谎~1kb末500bp甩~1kb乱4.0郑100bp换~500b钱p偏6.0霜10bp～选100bp牧由于琼脂糖谱凝胶是通过骗氢键的作用裕，因此过酸旦或过碱等破亮坏氢键形成倒的方法常用辞于凝胶的再饼溶化，象N刃aC布l长O携4冶能用于凝胶谊的裂解，一析般的凝胶回泊收试剂盒利喊用的也是这江一原理。善随着实验技米术的发展，尚也针对不同挪用途开发了条各种类型的锤琼脂糖凝胶且：（1）低贯熔点琼脂糖堪凝胶，用于可DNA片段倡的回收，且捕由于该种凝突胶中无抑制苹酶，可在胶掏中进行酶切滋、连接等；林（2）高熔项点凝胶，可传分离小于1谢kb滴的DNA片耀段，专用于漏PCR产物藏的分析；（溉3）快速凝并胶，电泳速辫度比普通凝胶胶中快一倍市，可节省实扎验时间；（卵4）瑞？？？腰，适用于D衰NA大片段守的分离。（躲5）其它类掠型。各生产沾商还开发很川多类型的凝确胶，可根据每实验要求选融择不同类型屯的，选择原孕则是考虑合驰适的机械强句度和熔点。助2趋.1.2翻DNA电泳罪影响因素狸DNA为碱服性物质，在墙电泳（缓冲写液pH眉=袍8）时带负体电荷，在一欢定的电场力杆作用下向正拍极泳动。而他DNA链上蒜的负电荷伴买随着DNA缓分子量的增厉加而增加，捕荷质比是一狸常数，故电性泳中DNA日的分离类似冈分子筛效应争。电泳中影投响DNA分但子泳动的因并素很多，主醉要分两方面抛：DNA分断子特性和电斗泳条件。纲DNA分子典大小D征NA分子越牵大在胶中的甩摩擦阻力就应越大，泳动孙也越慢，迁胁移速率与线骗状DNA分孔子质量的对全数值成反比谎。督DNA分子条构型对疏于质粒DN课A分子即使灭具有相同分晶子质量，因什构型不同也浑会造成电泳剧时受到的阻厨力不同，最薯终造成泳动糕速率的不同律。常规电泳佩中质粒DN睁A分子的3吹种构型泳动袜速率：超螺闹旋最快、线猛状分子次之粮，开环分子刻最慢。丰不同的胶浓咬度对于伟同种DNA肆分子胶浓度刘越高，电泳狂速率越慢。异不同胶浓度搅对于DNA亚片段呈线性亡关系有所区巡别，浓度较搞稀的胶线性简范围较宽，役而浓的胶对首小分子DN忍A片段呈现曾较好的线性夕关系。所以痕常规实验中思对于小片段商DNA分子密的分离采用辉高浓度的胶使分离（有时吴甚至用2％绞的凝胶），器而对于分离碗大片段则用详低浓度的凝逗胶。度电场强度孝电泳时为晨了尽快得到烂实验结果，的所用的电场艰强度约为5盟V/cm，嫂这样的场强椒下虽能得到富结果，但分诸辨率不高。曾在精确测定乡DNA分子埋大小时，应烦降低电压至播1V/cm演。电场强度痒偏高时电泳纱分离的线性攻范围会变窄兔，电压过高念时也会由于常电泳中产生展的大量热量益导致DNA威片段的降解蒜。实验中要扒根据需要选燥择合适电压棒，如对于D短NA大片段妥的分离可适痒当选择较低悬电压进行（家在Sout方her选n县杂交中的D惧NA电泳）桂，避免托尾苗现象的产生千；而对于小兰分子DNA孤，由于其在槐凝胶中的快星速扩散会导程致条带模糊持，可选用相叼对较高的电洒泳以缩短电践泳时间。延溴化乙锭报简称EB咐，电泳中的伟染色剂，具隐有扁平结构杠，能嵌入到打DNA碱基幼对间，对线盼状分子与开寸环分子影响谊较小而对超燥螺旋态的分脑子影响较大泄。当DNA蜻分子中嵌入帝的EB分子丛逐渐增多时掌，原来为负里超螺旋状态碑的分子开始炭向共价闭合毅环状转变，纠电泳迁移速央度由快变慢姑；当嵌入的设EB分子进师一步增加时籍，DNA分潜子由共价闭啊合环状向正滚超螺旋状态掏转变，这时禾电泳迁移速炉率又由慢变冠快。这个临阻界点的游离卫EB质量浓条度为0.1孕借g/ml~袋0.5得论g/ml，童即电泳时所非加的浓度。恶因此一般电女泳可以忽略室此因素，而子对于特殊电技泳，消除此抄因素影响可居采用电泳后团染色。搁电泳缓冲液夹目前有斧3种缓冲液复适用于天然次双链DNA者的电泳：T版AE、TB魂E和TPE辰，其组成及声特点见表崭2.2彻。一般常用丢的DNA电鲁泳选用TA刻E较多，其刃电泳时间较吴快，而且成造本比较低，姿但是其缓冲威容量较低，参需经常更换筛电泳液。满表2.2常弓用DNA电犯泳缓冲液证缓冲液受存储液组成候成份/L突特点及用途趴TAE捎50饮×辟双链DNA陕分子的泳动嚷速率比另两谊者快10吸%殊242gT忍ris亡超螺旋在其谦中电泳时更篮符合实际分中子质量安57.1m怖l冰乙酸崖回收DNA骂片段时首选颜，大片段分随离效果好统100ml维0.5m材ol/L产EDTA退(pH8.防0)窃缓冲容量小甚，过夜电泳茶不可选用收TBE歇5雁×凳小片段（<扭1kb）分原离效果好贷54gTr统is桶回收效率差缩而不宜用于嘱回收电泳沾27.5硼抬酸坟缓冲容量大竖，过夜电泳硬适合苍20ml局0.5mo驱l/LE股DTA(馅pH8.0胳)坡TPE厕1屑0邪×肢磷酸盐在乙丧醇作用下析甩出，也不适僚合回收电泳袄108g写Tris记缓冲容量大帖，过夜电泳赞适合古15.5m倍l磷酸念(85%，件1.679铸g/ml)斧40ml棵0.5mo天l/LE跑DTA(萍pH8.0编)撇2膏.1.3缘DNA电泳西上样缓冲液谊电泳中DN锈A点样前必腾须加入一定鸽量的上样缓免冲液，主要绍作用如下：炉螯合Mg滋2＋锁，防止电泳小过程中DN塞A被降解，库一般上样缓咬冲液中含1角0mmol森/l的ED玻TA。兔增加样品密卸度以保证D叫NA沉入加备样孔内，一思般上样缓冲臭液中加入一挣定浓度的甘英油或蔗糖，仆这样可以增井加样品的比裤重。而在大赖片段电泳中赞采用Fic毒oll（聚鹊蔗糖），可扯减少DNA罩条带的弯曲困和托尾现象牢。厌指示剂监测虹电泳的行进贡过程，一般梳加入泳动速氏率较快的溴辱酚蓝指示电怪泳的前沿，盏它的速率约房与300b奥p的线状双觉链DNA相锦同。递目前厂商提板供的限制性汉内切酶中都脂有赠送的上惠样缓冲液，月一般为10蓬×补上样缓冲液躁，DNA样文品中仅需加悠入1/10慰的量即可，矮加入过多的贿上样缓冲液牺会造成电泳伶轻微的托尾颜现象。宗2亮.1.4傍DNA电泳舅上样量的控大制塑在分析性电推泳中，一般坛样品投入量尸达50～1铃00ng/棍带即可观察酸到清晰结果涨，而对于珍文贵DNA样而品则上样量淡达电泳的最忍低分辨率5费～10ng透/带也可。悦而对于一定其量的DNA萄，当电泳时净采用较薄的财梳子制胶，纲则电泳时D漂NA条带相胶对较窄，观插察较清晰；描而随着电泳索时间的延长变，由于DN珍A分子本身制有一定的扩隶散，电泳条顿带也会变浅己。对于染色渡体DNA的可酶切片段包龙含各种大小微的条带，上贩样量即使超烦过10冷g条带也不肥会托尾，而谷单一条带（遗>10k纽b）当上样道量超过20盼0ng就有楼可能产生托霉尾现象。沿2浆.1.5皇DNA电泳止的标准分子姻量琴目前各厂商阁开发了各种岛类型的标准野分子量，有押广泛用于P速CR产物鉴糠定的小分子尸Marke缸r，也有常侨规用的大分妇子Mark辆er，图2闯-1为TA制KARA公夫司提供的D甲NA标准分茶子量电泳（面示意）图。款图2-1穿常用的DN锣A标准分子付量电泳图酒2.2试按剂与器材采1.试剂痕 四（1）50临×捉TAE电泳棚缓冲液绿242.0惯gTr言is碱炼100ml活0.5m麦ol/ED赖TA（pH间=8.0）织57.1m统l冰醋寨酸博 参（2）EB辛母液（1m摸g/ml）臭称取一定量邀的EB溶于腾无菌水中，限室温避光保倾存泼凝胶中浓度岔为0.5屯g/ml大EB为强诱爽变剂，实验感中要防止污宿染甜 掌（3）DN丽A标准分子始量（自制）保片段大小依南次为：0.阻5，1.1芽，1.6，住2.7，3找.1，4.覆1，5.4牵，9.4和秘17送单次电泳电腊样量3～4颤l即可，回粗收电泳加倍壶 虫（4）10全×键Loadi女ngbu咳ffer（萌pH7.0甚）巾EDTA些 辽50记mM衬甘油久 画60%肿Xylen集eCya编nolF团F（牢W/V穴）欢 似0.25%锤Bromo思pheno玻lBlu托e（狗W/V食）赤 怀0.25%简 挣（5）无菌水双蒸水抄 争（6）琼脂阿糖夺2.器材烤 古（1）ep祖pendo瞧rf管旺 很（2）枪头蜻 巡（3）移液唐器沉 舅（4）电泳贡槽堂 衰（5）电泳初仪脑 能（6）微波预炉喝 那（7）电泳阿板和梳子专 期（8）紫外货投射分析仪绘 青（9）数码克相机（带紫脏外滤色镜和至近射镜）晚2.3实验故步骤茄(1)吨用1并×因TAE更–B色uffer株按照被分离久DNA分子烧的大小配制切一定浓度纽(0.7%甜)保的琼脂糖凝护胶绒50ml攻，在微波炉横中加热至琼时脂糖溶解。羞(2)拉待溶液冷却扩至50盟℃瓣左右，加入徐溴化乙锭（启贮存液爷:州用水配制为丰1mg/m鉴l）至终浓屑为0.5扶g/ml充堤分混匀。雁(3)眠用透明胶封悲固玻璃板两暂头，在距底袄板0.5龟~拣1.0mm箱的位置上放亦置梳子，将品温热的琼脂卡糖凝胶倒入且胶模中，凝杰胶厚度在3阅~脉5mm之间战。封(4)悠在凝胶完全盟凝固后，撕魄去透明胶，胁小心地将玻巨璃板移至装膀有1委×日TAE缓冲里液的电泳槽紫中，轻轻地燃拔去梳子，避且使缓冲液拼没过胶面约镰1mm。征(5)店DNA样品星与鸭10旺×困L唇oadin填g-buf伞fer汉(含有溴酚毯蓝和甘油等唇物质)混合袍后，用微量孕取样器慢慢购将混合物加拘至样品槽中缝。星(6)把盖上电泳槽填并通电，使码DNA向阳毕极（红线）妹移动，采用土电压为80湾～100V梦。置(7)县溴酚蓝在凝陈胶中移出适除当距离后切控断电流，取月出玻璃板，沿在紫外灯下条观查凝胶。妈（注：对于朴DNA片段等回收的电泳雨一般建议采闯用0.6%阶低浓度的凝膏胶，而且采难用的电泳液承需第一次使抖用，电泳槽帖要洗净）捧3DN壤A的制备腰摘要贸本单元辨主要介绍质超粒DNA和及细菌染色体笛DNA的常气规制备方法极，要求学会凡根据不同实高验需求选择南不同实验方插法。抹3.1实验许原理咬户质粒DNA闹的基本特性按质粒（Pl筛asmid府）是一种染宾色体外的稳蒙定遗传因子替，大小从1挎-200k算b不等，为塑双链、闭环券的DNA分削子，并以超纯螺旋状态存扇在于宿主细戏胞中。质粒洞主要发现于纪细菌、放线鞭菌和真菌细慕胞中，具有就自主复制和其转录能力，沙能在子代细棋胞中保持恒锡定的拷贝数粒，并表达所惠携带的遗传誓信息。质粒呈的复制和转轿录要依赖于碌宿主细胞编前码的某些酶近和蛋白质，担如离开宿主难细胞则不能治存活，而宿震主即使没有追它们也可以最正常存活。芳质粒的存在涝使宿主具有抄一些额外的披特性，如对叼抗生素的抗奥性等。F质脊粒（又称F绳因子或性质虚粒）、R质慰粒（抗药性财因子）和C励ol质粒(映产大肠杆菌大素因子)等汽都是常见的迟天然质粒。隔质粒在细胞伍内的复制一而般有两种类项型：紧密控数制型（St检ringe谣ntco锄ntrol承）和松驰控圾制型(Re迫laxed赵cont芒rol)。蓬前者只在细拳胞周期的一巷定阶段进行饰复制，当染铁色体不复制安时，它也不愈能复制，通晒常每个细胞饺内只含有1酱个或几个质强粒分子，如施F因子。后竞者的质粒在林整个细胞周扒期中随时可奔以复制，在扩每个细胞中凤有许多拷贝贵，一般在2丢0个以上，谱如ColE脏1质粒。在槐使用蛋白质絮合成抑制剂垂-氯霉素时婆，细胞内蛋惯白质合成、慰染色体DN翅A复制和细医胞分裂均受竟到抑制，紧朋密型质粒复籍制停止，而跑松驰型质粒午继续复制，逮质粒拷贝数王可由原来2模0多个扩增尺至1000及-3000部个，此时质贿粒DNA占贵总DNA的井含量可由原澡来的2%增锅加至40-旁50%。搅利用同一复晃制系统的不哨同质粒不能浪在同一宿主闹细胞中共同竭存在，当两祥种质粒同时康导入同一细崇胞时，它们田在复制及随淡后分配到子疼细胞的过程壳中彼此竞争津，在一些细聋胞中，一种鼻质粒占优势务，而在另一圈些细胞中另答一种质粒却喜占上风。当抓细胞生长几剂代后，占少器数的质粒将邪会丢失，因给而在细胞后叶代中只有两燥种质粒的一衔种，这种现谢象称质粒的宫不相容性（畏Incom伟patib雀ility基）。但利用难不同复制系紫统的质粒则上可以稳定地活共存于同一卸宿主细胞中朗。寨质粒通常含竟有编码某些面酶的基因，屠其表型包括而对抗生素的绿抗性，产生傲某些抗生素虚，降解复杂应有机物，产渡生大肠杆菌摩素和肠毒素燕及某些限制乓性内切酶与踩修饰酶等。佩质粒载体是黎在天然质粒叔的基础上为贵适应实验室估操作而进行危人工构建的忘。与天然质迹粒相比，质博粒载体通常繁带有一个或碍一个以上的么选择性标记堆基因（如抗计生素抗性基劈因）和一个砍人工合成的环含有多个限搬制性内切酶揉识别位点的诞多克隆位点绑序列，并去小掉了大部分诚非必需序列甩，使分子量驾尽可能减少伞，以便于基屯因工程操作与。大多质粒砌载体带有一捧些多用途的召辅助序列，仙这些用途包抛括通过组织芦化学方法肉只眼鉴定重组绩克隆、产生料用于序列测肌定的单链D万NA、体外捆转录外源D给NA序列、丛鉴定片段的怎插入方向、浆外源基因的胜大量表达等美。一个理想坊的克隆载体息大致应有下叫列一些特性夏：（1）分暑子量小、多蹄拷贝、松驰倾控制型；（糠2）具有多律种常用的限柿制性内切酶偏的单切点；嚼（3）能插烘入较大的外身源DNA片淘段；（4）谣具有容易操租作的检测表伯型。常用的息质粒载体大侦小一般在1浑kb至10福kb之间，理如计p忆BR322议、普p饱UC系列、注p刊GEM系列牵和pBlu轨escri斥pt（简称旧pBS）等经。表3-1惹列举了不同缓复制子类型北的质粒。蒸表3-1首常见质粒特喜性及复制子饭类型紫质粒绪复制子类型患拷贝数夕用途港pBR32厌2末pMB1至15～20懂早期克隆载呈体歪pUC系列磁pMB1（庸改良）已500～7罪00休常规克隆载皆体埋pET系列慌pMB1刚15～20爪常规表达载虏体（T7）袜pGEM系继列旷pMB1（以改良）拔300～7永00始克隆与表达铃载体（T7柳）阻pSP系列快pMB1（果改良）舟300～7孩00针克隆与表达披载体（T7肤）原叶质粒DNA芒抽提的基本边原理创在细菌细胞杀内，共价闭候环质粒以超必螺旋形式存侦在。在提取毕质粒过程中壁，除了超螺灶旋DNA外揪，还会产生荡其它形式的榨质粒DNA逢。如果质粒砌DNA两条遥链中有一条枪链发生一处如或多处断裂蹲，分子就能邮旋转而消除烧链的张力，闷形成松驰型胶的环状分子柄，称开环D渐NA(Op飘enci截rcula蓝rDNA衔，简称o撒cDNA)墙；如果质粒地DNA的两声条链在同一弄处断裂，则祖形成线状D犬NA(Li雄near问DNA)。塘当提取的质岁粒DNA电践泳时，同一师质粒DNA染其超螺旋形峡式的泳动速抓度要比开环治和线状分子甩的泳动速度匀快。章陆.1绞碱裂解法质猜粒DNA的转抽提尖主要包括3轨个基本步骤痒：裂解细胞明、分离和纯充化质粒DN纤A。绪（1）裂解谁细胞馅基本上先加线入溶菌酶作久用一段时间棚，破壁后再揉加入非离子种型去污剂或猎直接加入碱浊性伟SDS爆等以及作煮兵沸处理，以凳便破壁与膜另，处理的同姨时也能去除忘细胞碎片、汪染色体热DNA英等杂质。非赔离子去污剂炭法较温和，真适用于抽提篇10般kb尚左右的质粒揪；而煮沸法忧与碱性摔SDS耗法相对较剧滤烈，只能抽屡提小于10涨kb乔的质粒。本陡实验采用碱香性吼SDS塌法。（2）分离僻细菌基因组伍均比较大，咽如大肠杆菌弹的染色体约漆有4700诚kb暗长，在处理沸细胞过程中筐断裂成不同望长度的双链侮DNA尸片段。当溶钉液的乖pH瑞值调节到大宾于12时，竭双链杠DNA迅中的氢键被矿破坏，于是霜染色体弯DNA询双链分离成温单链；而超知螺旋状态的著质粒宴D煤NA钻仅仅部分氢泪键被破坏，救只是部分双盐链解离成单映链。再将溶仪液的剩pH枝值调回中性串时，单链期DNA抢互相缠绕并耻且与蛋白质采结合生成网浊络状大分子删，而超螺旋筝的质粒发生椒复性反应后龟仍然是小分拆子，通过离僵心很容易将醋两者分开。禽达到分离的兼目的。（3）纯化尤细胞裂解液索中的杂质除柿了染色体萍DNA喂外，还有各运种细胞壁、汤膜的碎片、苗各种酶与其恨他蛋白质、笑脂质类杂质闻以及软RNA贡等。纯化步侨骤应有针对据性地将它们此去除。离心曲去除各种细裂胞碎片；用公酚处理去除材蛋白质，包我括各种酶；寿用存RNA柴酶处理去除证RNA锤等。酚是一丑种作用非常互强烈的蛋白习质变性剂，瓶能非常有效轧地是蛋白质厨变性进而去轧除。氯仿有摊强烈的溶脂帝性，可去除陪脂质类杂质痰。酚/氯仿榜可节约重蒸蔬酚。氯仿能少将微量的溶湾于概DNA斗水溶液中的卖酚抽提掉，退否则微量的尼酚对于以后俯的酶切、转正化等过程都晶会产生不利挤影响。抽提梦完成后的水阳溶液中仍有柜痕量的酚、锈氯仿等，可宏用乙醇沉淀陡的方法将它佣们除去。乙肾醇沉淀的特氧点是能在浓惨缩里DNA天的同时更换孙整个缓冲系轿统，但嘱DNA左会有一定的树损失。由于溉杂质不易在赴乙醇中沉下哪，沉淀过程索可在0富℃蹈进行。乙醇受较异丙醇易长挥发，沉淀祝得到的蛋DNA夜比较干净。蕉盐等杂质易誉在异丙醇中皱沉下。沉淀张DNA忆时加入盐类抄的目的是中步和链上的电少荷，使墓DNA济易于形成沉械淀。远该方法抽提醋质粒主要的牌试剂为溶液率I乞、琴II妹和氏III托，其在抽提诵质粒DNA凑中的作用如经下：扭溶液株I得：萄由葡萄糖、沾EDTA赶、浊Tris胃•知Cl蜘组成。葡萄甜糖的作用是匆增加溶液的课粘度，减少侮抽提过程中俘的机械剪切惩作用，防止庆破坏质粒祝DNA列；晌EDTA叶的作用是络嫂和掉属Mg控2+它等二价金属柿离子，防止皂DNA领酶对质粒分资子的降解作同用；瞧Tris寄•揪Cl件能使溶菌液霞维持溶菌作恩用的最适氧PH絮范围。钞溶液半II殖：谊由窄SDS筋与贡NaOH悔组成。延SDS酿的作用是解粘聚核蛋白并熊与蛋白质分宰子结合使之判变性；万NaOH(赏pH>12锦)晃的作用是破晚坏氢键，使嗽DNA资分子变性。均溶液洽III悄：期由炮KAc特与辱HAc稀组成，是脂pH兰值为5津.课5的高盐溶吵液。能中和因溶液竟II骂的碱性，使膏染色体夫DNA渐复性而发生谎缠绕并使质规粒焦DNA麦复性。丈K醒+先离子会与与SDS抄形成溶解度重很低的盐并不与蛋白质形补成沉淀而除趣去。溶液中线的染色体继DNA项也会与蛋白舰质-伯SDS艘形成相互缠性绕的大分子文物质，很容械易与小分子寻的质粒伪DNA葱分离，此外幻，高盐溶液气也有利于各陷种沉淀的形秒成。维凭.2笛煮沸法质粒贫DNA的抽浑提窄煮沸裂解法魄是将细菌悬延浮在含有能虚消化细胞壁胶的溶菌酶的届缓冲液中，辟然后加热到献100渐℃库使其裂解。捕加热除了能犯破坏细菌外深壁，还有助滤于解开DN崇A链的碱基碰配对，并使粮蛋白质和染瓜色体DNA益变性。但是锻闭环质粒D败NA链彼此闭不会分离，鸡这是因为它臭们的磷酸二讨酯骨架具有魄互相缠绕的益拓扑结构。嗓当温度下降淋后闭环DN成A的碱基又忌各就各位，浙形成超螺旋瘦分子。离心间除去变性的剃染色体DN虽A和蛋白质哭，就可以从象上清中回收宽质粒DNA面。煮沸裂解鄙法对于小于伞15kb的益小质粒抽提历非常有效。和但对于那些葱经变性剂，晒溶菌酶及加屑热处理后能垄释放大量碳阶水化合物的徐大肠杆菌菌享株，则不推舰荐使用该法堆。这是因为郊碳水化合物农很难除去，泊会抑制限制维酶和聚合酶线的活性。大宋肠杆菌菌株傻HB101葱及其衍生菌互株（其中包忽括TG1）鸡能产生大量演的碳水化合跟物，不适用欧于煮沸法裂埋解。该方法引的优点是可击以快速省时疫获得一定量钢的质粒DN狂A，用于酶铁切鉴定。他餐基因组DN惜A抽提的基边本原理皮基因组DN耍A的提取通作常用于构建泼基因组文库要、Sout敢hern杂差交（包括R拥FLP）及届PCR分离素基因等。利当用基因组D搜NA较长的娇特性，可以缩将其与细胞刺器或质粒等灿小分子DN含A分离。加侄入一定量的喘异丙醇或乙复醇，基因组捆的大分子D斥NA即沉淀甘形成纤维状腿絮团飘浮其誓中，可用玻壶棒将其取出牙，而小分子延DNA则只弦形成颗粒状雾沉淀附于壁示上及底部，圆从而达到提嘱取的目的。计在提取过程应中，染色体柔会发生机械舒断裂，产生弦大小不同的卡片段，因此盟分离基因组里DNA时应治尽量在温和注的条件下操干作，如尽量陶减少酚/氯壮仿抽提、混吹匀过程要轻疤缓，以保证爬得到较长的砖DNA。一炉般来说，构诊建基因组文扭库，初始D颠NA长度必锣须在100饲kb以上,元否则酶切后电两边都带合滋适末端的有洲效片段很少胶。而进行R超FLP和P庸CR分析，湖DNA长度顽可短至50堡kb，在该撞长度以上，链可保证酶切耐后产生RF停LP片段（婆20kb以陵下），并可剥保证包含P木CR所扩增鸦的片段（一南般2kb以贴下）。锦不同生物（标植物、动物老、微生物）邮的基因组D痕NA的提取至方法有所不并同，不同种骂类或同一种婆类的不同组磨织因其细胞唤结构及所含狼的成分不同信，分离方法纠也有差异。迎在提取某种高特殊组织的立DNA时必挤须参照文献修和经验建立歪相应的提取池方法，以获信得可用的D枝NA大分子攻。尤其是组洲织中的多糖乔和酶类物质雀对随后的酶厉切、PCR惜反应等有较慨强的抑制作规用，因此用敲富含这类物葵质的材料提身取基因组D弱NA时，应卸考虑除去多均糖和酚类物手质。目前针洽对不同类型杏的细胞均开倚发除了相应门的抽提试剂猴盒。或常规实验中槐从细菌基因冬组上PCR球扩增目的基倾因时，一般置所用的DN丛A量较少，怀可以采用较录简单的沸水络浴裂解法制躲备少量的D谷NA。在短白时间的热脉构冲下，细胞拨膜表面会出屿现一些孔洞绵，此时就会怒有少量的染扯色体DNA档从中渗透出歉来，然后离丘心去除菌体庸碎片，上清伟中所含的基装因组DNA垃即可用于P葡CR模板。串而对于大量船的基因组D秃NA制备（隆如Sout推hern斯Blott咬ing，需写大量基因组桨），可采用帖试剂盒抽提胆。蒙3.2试倾剂与器材居1.试剂妇 果（1）溶液缝I园 典碱溶法抽提础质粒DNA纷 羞葡萄糖浅 犬50浴mM找 渐Tris-招HCl盯 恰50mM食 忽EDTA提 妨10mM晚 源溶菌酶竹 绍5渴mg/mg阵 最使用前加入衔 拔（2）溶液惜II睛 心碱溶法抽提吊质粒DNA醒 旱NaOH迹 阵0.2射M雕 散SDS伟 蒙1.0%秧 冤使用前用母死液配制晶 尚（3）溶液芽III（p盐H5勇.5签3M竭KAc）宏 症碱溶法抽提娇质粒DNA笼 尾5如mol哑/L乙酸钾泥 份60ml镰 数冰乙酸测 劈11.5m盆l过 倒（4）苯酚傅饱和溶液标苯酚溶解后尺用什10mM瘦Tris痰（pH衔8.0胶）平衡至上直清中的水相薄pH升至芽8.0低 晓（5）氯仿朵 拒（6）异丙宝醇冈 装（7）ST乖ET溶液仪 庆沸水浴抽提武质粒DNA愤 搂蔗糖越 训8%藏 罩Trito射nX-10腰0它 震5%慢 块Tris-摔HCl(跃PH8.0价)叉 率50mM孝 跑EDTA评(PH8.尾0)气 晓50mM刃 肾使用前加入扣溶菌酶至终楚浓度0.5树待mg/ml结 约（8）Bu丝ffer用A紫 按大肠杆菌染溜色体DNA袋的制备览 庄Tris-衬HCl(仅pH8.0厦)堤 掌10mM摔 僻EDTA缝(pH8.索0)励 仙20mM兵 律使用前加入针溶菌酶至终时浓度5蒙mg/ml践 旨（9）SD情S（10％祸）炎 仪（10）N程aOH（2消M）花 宋（11）N只aCl（5份M）储 弱（12）R康N曲aseA（诸10蛇mg/ml翅）扑 朽固体粉末溶室于无菌水后雄煮沸10分凶钟，后冷却晶并分装于小率管中垦-20争℃匙保存台 爆（13）冰肢乙醇（70柄％）帜 充可用95％童乙醇配制，恰-20环℃品保存备用载2.器材肢 弓（1）ep义pendo飘rf管，枪镜头慕 池（2）移液己器白 陕（3）水浴退锅吐 豆（4）离心摄机莲 运（5）摇床照3幕.辜菌种企 华（1）件E.col勒i碎JM83梳F倒’回，床ara别,劫lac-p签ro盲AB)，惯rps博L，(掩Str饮r屋)，王80贼士lac经Z妇M15陆 研（2）pM服D雀-phoA覆/JM83薯3.3实验堆步骤狭3警.3.1橡沸水浴法快秀抽大肠杆菌椒质粒DNA诞（1）在E疤ppe况n恨dorf管李中加入11察0吊l的STE诉T（使用前职加入溶菌酶改至终浓度为借5焦g/ml）债溶液，挑入茎米粒大小的旋菌团，充分卷悬浮并混匀瞎。淡（2）上述坑菌体悬浮液近沸水煮20牛秒。某（3）迅速劲放置于常温穷下150捐00rpm怠离心15分吓钟。梢（4）用牙池签挑去菌体柔碎片（白色伪沉淀），在齿上清液中加祖入100馋l橡的异丙醇（面注意不同样粗品管中的溶议液平衡），传充分混匀后招1爆5挡000r聚pm离心1笨5分钟。自（5）弃上谣清液，沿管鹅壁四周加入绸70%冰乙援醇400接l洗涤上述均所得DNA凯样品，完毕草后弃上清，浅管子倒扣1绸0S左右，苍然后将DN按A沉淀凉干姻。棍（6）沉淀御凉干后用5局0呀l无菌重蒸朋水溶解，样溜品可取5刮l酶切电泳纱分析或待用仆。牲3逐.3.捞2碱溶法筑制备大肠杆遗菌质粒DN地A棚（1）取1厨.5ml过候夜细菌培养疑液于1.5奋ml离心管贪中，于台式离高速离心机散中以15帅000rp砖m，常温离驳心30秒，掏弃去上清液且并将离心管属倒扣在滤纸习上。想（蝴4兴管尺/聚组)汁（2）在离案心管中加入痕100变l溶液I悬察浮菌体，涡伞旋振荡，以你充分悬浮菌澡体成均匀悬医浮液。异（3）加入虫200燃l溶液II肆，扣上离心哲管盖，立即移轻轻混匀（援来回颠倒数脸次），至溶揪液几乎澄清键，成淡黄色破透明粘液状僻。锋（4）打开葵离心管盖，讽加入150雷l落溶液III育，轻轻混匀产（来回颠倒养数次），看会到淡黄色消锹失，有大量夏白色沉淀生推成，然后离劳心。袋（5）常温偏1500默0rpm离妄心10分钟灿，小心吸取战上清液于另卫一离心管中飞。注意，不最要把白色絮豪状物混入上钉清液中。放（6）清液甩中加入等体抵积的苯酚饱位和溶液：氯娃仿混合溶液雾（1:1）搅（各2呀00展l译），充分混山匀，常温1配5000站rpm离心疼10分钟，且小心将上清喜液转移至另谅一离心管。碗注意不要将氏下层有机相劲混入上清液莫中。蓬（7）在上奇清液中加入鄙-20箭℃针冷冻的异丙义醇60蓄0怨l滑，盈充分混匀，磁常温15寒000显僵rpm离心立10分钟。坦（8）小心航倾去上清液消，注意避免酿把离心管底馅的白色DN眠A沉淀也随助同上清倒掉煮。加入40圾0恋l75%足的冰乙醇，孝再1500邪0rpm离姥心1min裂，倾去上清个，倒扣离心猛管于滤纸上驴，稍许凉干昨。溪（9）加入践100柜l无菌重蒸窑水溶解质粒逝DNA，可葵在37耳℃里保温5批~惭10分钟。太(100捡l奔/管，4管虹)础（10）合棉并于一管，晶加入2巡lRNa芽se，37渠℃篇保温30分属钟，取5妙l电泳检查玩消化彻底否浊。旱（以电泳前饲端无RNA摔条带为准）龄（11）R拉Nase消君化完全后加香入等体积的旁苯酚饱和溶易液：氯仿混姐合溶液（1祖:1）（各晶3糕00灿l滥），充分混将匀，4碎℃姥，150析00rpm晌离心15分甩钟，将上清权液转移至另摘一离心管。影（12）在种上清液中加郊入0.1倍日溶液体积的呆3M,p霸H5.5网KAc（约蚂40酒l拒），400消l姓的醉–艇20轮℃晓冷冻的异丙饼醇，充分混哑匀，4拖℃述，150肢00看驰rpm离心取20分钟。疼（13）用距400低l75%聚的冰乙醇洗省涤一次，再嫁15000麻rpm离心主1min，罢倾去上清，房倒扣离心管婶于滤纸上，度稍许凉干，陡待用。响（14）如摔需定量或检笑测制备的质侮粒DNA的墙质量，可取认适量质粒D绘NA进行适循当稀释，测滑定OD活260nm圈和OD敲280nm滋值，计算O申D灵260nm卧/OD伪280nm野的比值。质抄粒双链DN解A量可以1牧OD犬260nm厚＝50陡g/ml计模算。OD些260nm目/OD己280nm你应为1.8累左右。插3亡.3.很3沸水浴兔制备染色体蚀DNA漠（1）在E戏ppe碑n帆dorf管阁中加入10适0嫩l的ddH骂2掉O，挑入米自粒大小的菌缴团，充分悬遥浮并混匀。昏（2）上述铅菌体悬浮液备沸水煮20熄秒。政（3）迅速盟放置于常温汉下150爆00rpm取离心10分旧钟。端（4）用牙房签挑去菌体挠碎片（白色元沉淀），上胡清待用。菊3患.3.鬼4大肠杆塌菌中染色体袄DNA的抽屋提缝（1）大肠脉杆菌一级瓶予培养过夜，帮以他10%附的接种量接志二级瓶培养骆4～5小时夕后，培养物摆以50械ml恳/管离心收纸获（80仇00博rpm巷，先5min榴，青4带℃饱）。凯（2）菌体社沉淀中加入衡10ml嫩山Buffe末rA，旋涡盯振荡混匀，此37炸℃挪保温30分煎钟。绞（3）取出幻后加入10劫%SDS嗓至最终浓度赚为1%，轻显轻混匀，3良7蜜℃客保温30分巡钟澄清即可牲。工（4）取出俩后加入20棵mg/ml好的ProK挠至最终浓度诚为5荡g/ml，旷60圈℃携保温1小时参。（染色体合DNA结合绩蛋白的消化插）辛（5）取出飞后加入预冷铺的5MN罗aCl至最取终浓度为1凭M，混匀后茄冰浴30分鸟钟（溶液要绳混合成为均肢相，并且冰截浴要充分，期时间可适当惠延长）。救（6）取出补后4远℃稀，颠1堤5绣000茄rpm强离心30分间钟。（离心妄前样品管要狠进行平衡，倘以免离心机及受损）僵（7）在上砍清液中加入香6丸ml票苯酚和6胆ml演氯仿混合液分，混匀，室录温下宋12,00蝇0rpm蜂离心30分美钟。福（8）在上温清液中加入李10线ml溉氯仿，混匀舰，室温下链1200线0rpm夜离心30分芦钟。河（9）取上段清液，加一短倍量异丙醇卷沉淀殃DNA冰，冰浴放置包30幅分钟，卫1抱5仿000r漫pm榨离心30分但钟。枣（10）薯75%采冰乙醇洗左涤5分钟。供（11）晾池干后，用全300杰l忘无菌双蒸水头溶解染色体锦DN储A职，在37俘℃弊水浴中放置俊30分钟。矩（12）用透2～2.5辞体积的无水咳乙醇沉淀(侄加入请p餐H5.5的萌KAc0厚.1体积)赖。呈（13）沉麻淀洗涤，抽专干后用dd源H详2给O溶解，分嚷装并保存于现-20摧℃意。禾4DN感A的连接蚊摘要铸本单元摘主要介绍载高体和供体D继NA连接的化影响因素，孔连接中两种计DNA投入外量的确定原盐则和，学会炉根据不同克摘隆要求设计猫连接反应。幼4.1实漫验原理戚添DNA的施连接策略籍质粒具有稳但定可靠和操税作简便的优捆点。如果要鲁克隆较小的姐DNA片段饭(＜10k斥b)且结构捕简单，质粒惹要比其它任麻何载体都要联好。在质粒逃载体上进行撕克隆，从原驼理上说是很环简单的，先采用限制性内推切酶切割质拖粒DNA和艇目的DNA例片段，然后栗体外使两者木相连接，再广用所得到重脖组质粒转化四细菌，即可漠完成。的外源DNA忌片段和质粒躬载体的连接夜反应策略有独以下几种：卖（1）互补中性粘性末端序的连接消单一限制性颤内切酶或两午种限制性内瑞切酶（为同板尾酶，如B报amHI和托BglII亭）分别处理形载体和外源将DNA，得睛到的粘性末乘端为互补性胶突出末端，刷在连接反应箱中外源片段衫和质粒载体赶DNA均可拒能发生自身车环化或几个尺分子串连形按成寡聚物，蔽且正反两种甚连接方向都萍可能有。为魔了降低载体新的自身环化宿，使正确的微连接产物数己量达到最高学水平，一般脱载体DNA哨和外源DN放A的分子数止比（浓度比上）为1：3舍～1：10副之间。同时孤，为了最大献限度地抑制唇质粒DNA堪的自身环化好，还可将载先体DNA的住5'磷酸基削团用碱性磷届酸酯酶去掉递，防止其自震身环化。而卧带5'端磷约酸的外源D猴NA片段可君有效地与去遵磷酸化的载戏体相连，产凯生一个带有悔两个缺口的佩开环分子，康在转入冻E.col阶i筝受体菌后该傻种缺口可在做DNA复制呢过程种自动董修复。购（2）非互幅补粘性末端茂的连接乎用两种不同江的限制性内暗切酶进行消扭化可以产生狮带有非互补芳的粘性末端延，这DNA剖重组中最容诸易克隆的D告NA片段。台一般情况下低，常用质粒胡载体均带有浪多个不同限吃制酶的识别怠序列组成的逆多克隆位点趁，因而几乎保总能找到与麦外源DNA扰片段末端匹猛配的限制酶厦切位点的载单体，从而将框外源片段定视向地克隆到应载体上。也搬可在PCR烧扩增时，在骄DNA片段略两端人为加宿上不同酶切歼位点以便与筑载体相连。葛该种粘性末承端的连接载谜体DNA和妇外源DNA草的分子数比宅（浓度比）泳通常为为1赶：1。潜（3）平头雀末端的连接崇是由产生平课末端的限制啦酶或核酸外尿切酶消化产描生，或由D堤NA聚合酶稻补平所致。亚由于平端的翼连接效率比码粘性末端要薄低得多，故碧在其连接反桑应中，T4陡DNA连馋接酶的浓度浓和外源DN踩A及载体D闷NA浓度均友要高得多。来通常还需加忙入低浓度的军聚乙二醇（蛾PEG8满000）以肉促进DNA输分子凝聚成槐聚集体的物尚质以提高转廊化效率。特还殊情况下，勉外源DNA座分子的末端晌与所用的载前体末端无法典相互匹配，缝则可以在线匀状质粒载体梅末端或外源口DNA片段粮末端接上合荣适的接头（准linke邀r）或衔接固头（ada考pter）冻使其匹配，阶也可以有控屑制的使用掀E.co菌li欢DNA聚昂合酶浆Ⅰ弓的klen貌ow大片段本部分填平3换'凹端，使随不相匹配的爆末端转变为据互补末端或诸转为平末端怕后再进行连琴接。登4.1.嚷2怜DNA连郑接酶类型校能用于连接讽DNA骆的酶有蝴2粱种：大肠杆液菌连接酶和继大肠杆菌约T4想噬菌体所编情码的棉T4-软DNA连接清酶。前者的段反应需要荷NAD镰+奏参与催化，比而猴T4逼连接酶的反蚂应则需要抚ATP论参与催化。肆最初的研究守表明，大肠令杆菌连接酶饱只能催化粘钳端的连接，男现在发现在行PEG读或聚蔗糖存菌在的条件下骗，也能进行锅平端的连接电。相比较而饶言，旋T4-DN衔A碍连接酶并不扯需要某PEG惠等的存在就品能进行平端志的连接，所地以现在实验拨中绝大多数短情况下使用若T4-DN踏A僻连接酶。到4符.1捷.直3衔DNA连陡接的影响因塞素泛连接反应的渴影响因素包肥括温度，时窄间，酶量，努缓冲体系，肝DNA末端牙的性质（见角邪）及浓度，犁DNA片段熔的大小等。遮（1）温度渔与时间汪连接反应的降一项重要参馅数是温度瓶，比理论上连接壁反应的最佳缝温度是37闻℃，此时连快接酶的活性建最高。但3陷7℃时粘性征末端分子形宜成的傲氢键风配对结构极慨不稳定，因露此人们找到但了一个既可傅最大限度地剥发挥连接酶扔的活性，又易有助于短暂卫配对结构稳满定的最适温套度即12~做16℃。狱一般粘性末扶端的连接在犬此温度下，垒反应30杆min言即可取得较宿好的效果，戚如时间充裕兰的话连接6束0逝min舰则更完全些霸，为了实验忧方便有时也苏在4论℃益条件下连接魄过夜。而对币于平头末端阿的连接，建模议在37障℃信条件下连接未，并且时间核适当延长。（2）酶量碍酶单位的定繁义在宝生物洒工程公司提婶供的T4腿-DNA碑连接酶中是伐指在20塌l霸的连接发应旱体系中，6瓣g乡的牢勉DNA-转HindI净II亏的分解物在脉16烂℃课下发应30抢min肃时，有90婶%以上的D喉NA片段进薄行连接的酶怠量为1U。顷由以上的定达义可知，日敲常连接实验左中的DNA辱的浓度比酶全量定义的状播态下低很多培10～总20张倍，所以实须际酶量是过谷量的。平头鹅末端的连接哨酶的用量要侧比粘性末端弃连接所需酶沙量大10州~100盗倍，因此厂舱商提供的连盖接酶浓度往哄往是高浓度绕的（宝生物扩的T4沉-DNA摧连接酶浓度当350崖U/阴l享）。故从这完个意义上分午析，常规的太粘性末端的虚连接反应体战系中酶量的活加入往往是夺过量的。绸（3）缓冲贸体系记不同公司的贪连接酶缓冲锹液大部分含寿有Tris棉-HCl忙（险pH7.塞5野）提供连接娇所需的合适揪pH肚值。另外在拒缓冲液中还扇有两种主要骂成份非常重篮要：DTT旧和ATP。右前者提供一软定的还原能朵力，而后者管能促进连接变反应的有效习进行。但是霉在实验中缓写冲液使用时余的反复冻融尾会引起AT厉P的分解，晚从而影响连刊接效率。为赖了保证实验孤的顺利进行腐，一般大剂消量的缓冲液闭可以分装成扬小管保存并刷使用，另外论可考虑使用赤一段时间的者缓冲液定期篮更新一下。双（4）DN垂A浓度畜DNA连接挤反应中建议皮的DNA连光接浓度为薄0.1~1铺pmol/滋l丝，，而为了隙降低载体分中子间的环化承，载体DN秒A的浓度不础宜过高，外掌源DNA的荒投入量则依暂据连接类型而不同投入1筋～10倍。挎4.2试哀剂与器材幅1.试剂明 纲（1）外源浴DNA和载宰体DNA滥 咱（2）T4奴-DNA疯连接酶洗2.器材永 结（1）ep判pendo桨rf管、枪尤头养 沃（2）移液滴器布4.3实验探步骤索4.3距.章1常规D屡NA分子的偷连接套（1）用适粘当限制酶消虾化载体质粒他和外源DN资A，必要时坝用琼脂糖凝梁胶电泳分离扔片段。蛮（2）载体约DNA取A封梢l，外源D言NA取B温l，充分混找匀后于42万℃美保温10分凡钟后，迅速蚁冷却到0岛℃烟（可省略，驻热脉冲是为鲁了提高两种伤DNA分子盲碰撞的概率管）。费（3）再按锋设计的反应窜体系依次加塑入：煮10康×喜T蚊4歌-集缓冲液，T您4挺-踏DNA连接颗酶。使（4）置于崭16留℃菜连接1h以廉上，待用。轿建议连接体怖系（可根据歇样品浓度进塌行适当调整边）：南ddH符2众O（真l）侵 暮外源DNA宰（护l）助 晋载体DNA弄（帆l）椅 贺Buffe近r（帮l）惹 文Enzym悲e（宿l）重 馅Total拖（累l）江13-A-俩B凡 嫂B窃 乏A融 仙1.5巧 缴0旅.5尘 担15突4.3沫.动2偿PCR翠产物与T卫-让载体连接墨（1）回收军的PCR扩腾增产物直接机与p臣MD18孤-T载体连宫接，连接反民应按如下：攀异 改5连×胖Buffe究r态 崖pMD18去-T吃 造PCR产物壮 系T4-DN啊Alig恨ase广 撇∑熄 塌2扮l鸭 形0.5要l各 斑7研l椅 薄0.5粉l圣 认10央l渡（2）16留℃禾连接1h以棋上，用于转防化。墙5目的触基因的PC削R克隆从摘要劳本单元步主要介绍细龄菌基因组中罚的目的基因吩的PCR克队隆，要求学泡会PCR实涛验中引物的量设计及后续泄克隆方案的疑确定。联5.1实验厉原理艰斯聚合酶链式昼反应（亚PCR蹈）的基本构扁成繁PCR指在呼引物指导下板由酶催化的赠对特定模板蜘（克隆或基眼因组方DNA在）的扩增反冰应，是模拟连体内米DNA曲复制过程，论在体外特异悉性扩增牵DNA钱片段的一种详技术，在分狮子生物学中同有广泛的应搅用，包括用走于DNA作膀图、DNA久测序、分子潜系统遗传学筋等。触PCR基本喷原理是以单搂链炒DNA备为模板，4翅种区dNTP刺为底物，在痰模板薄3’茧末端有引物柏存在的情况末下，用酶进绕行互补链的膜延伸，多次拆反复的循环冻能使微量的归模板DNA词得到极大程促度的扩增。要在微量离心刮管中，加入照与待扩增的扩DNA昨片段两端已殊知序列分别伙互补的两个混引物、适量残的缓冲液、兴微量的悉DNA友膜板、四种赚dNTP渔溶液、耐热苦Taq我影DNA航聚合酶、硬Mg狡2+宋等。反应时敲先将上述溶尊液加热，使漆模板题DNA咬在高温下变校性，双链解左开为单链状嘉态；然后降并低溶液温度辉，使合成引衫物在低温下梯与其靶序列纸配对，形成谦部分双链，护称为退火；匀再将温度升猪至合适温度尤，在产TaqD主NA押聚合酶的催条化下，以盒dNTP碧为原料，引泄物沿蜜5’烟→狼3’寒方向延伸，逃形成新的古D贷NA蹲片段，该片鹅段又可作为附下一轮反应破的模板，如箩此重复改变塌温度，由高很温变性、低握温复性和适皂温延伸组成末一个周期，盖反复循环，誓使目的基因浆得以迅速扩春增。因此感PCR夜循环过程为箱三部分构成甩：模板变性研、引物退火检、热稳定灿DNA叙聚合酶在适市当温度下催医化隶DNA概链延伸合成锐。被（1）模板朋DNA冬的变性逐模板纲DNA慢加热到90付~95裳℃诚时，双螺旋老结构的氢键临断裂，双链迈解开成为单火链，称为掉DNA货的变性。变豆性温度与雹DNA驶中璃G-C倦含量有关，荐G-C左间由三个氢涝键连接，而绵A-T唉间只有两个弱氢键相连，肤所以脏G-C出含量较高的呢模板，其解胃链温度相对目要高些。故肯PCR中右DNA妈变性需要的损温度和时间第与模板扫DNA评的二级结构宿的复杂性、挨G-C残含量高低等域均有关。对揭于高拌G-C饿含量的模板轮DNA在实唱验中需添加批一定量二甲紫基亚砜（D尝MSO），威并且在PC双R循环中起粪始阶段热变千性温度可以覆采用97缝℃后，时间适当做延长，即所唉谓的热启动菠。端（2）模板雅DNA林与引物的退甚火质将反应混合典物温度降低敞至娇37婶~65按℃鼻时，寡核苷贞酸引物与单饼链模板杂交辛，形成规DNA玩模板-引物及复合物。退帖火所需要的指温度和时间室取决于引物安与靶序列的凳同源性程度具及寡核苷酸牺的碱基组成抚。一般要求习引物的浓度迹大大高于模收板咽DNA我的浓度，并楚由于引物的裙长度显著短踏于模板的长已度，因此在铅退火时，引丝物与模板中统的互补序列尤的配对速度难比模板之间抱重新配对成桂双链的速度描要快得多，司退火时间一戴般为1～2激min蚂。辟（3）引物尼的延伸咐DNA谱模板-引物滨复合物在拣Taq臭誉DNA奇聚合酶的作废用下，以剃dNTP皱为反应原料驰，靶序列为牙模板，按碱疗基配对与半祥保留复制原企理，合成一饭条与模板奶DNA减链互补的新币链。延伸所裙需要的时间切取决于模板决DNA拔的长度。在炉72骂℃羽条件下，涨TaqD瓜NA示聚合酶催化思的合成速度惊大约为40末～60个碱烈基/秒。经集过一轮怒“鄙变性-退火党-延伸亿”交循环，模板态拷贝数增加弱了一倍。在暮以后的循环斩中，新合成沿的灿DNA匠都可以起模叔板作用，因睁此每一轮循务环以后，资DNA延拷贝数就增炉加一倍。每稳完成一个循复环需2～4怪min蔑，一次答PCR信经过30～坡40次循环喂，约员2女～奉3h嗓。扩增初期化，扩增的量矩呈直线上升行，但是当引胳物、模板、供聚合酶达到含一定比值时榴，酶的催化犹反应趋于饱列和，便出现遵所谓的杰“挖平台效应匆”在，即靶DN福A产物的浓短度不再增加下。浩蒸PCR滚反应的五个桌元素羡参与键PCR全反应的物质们主要为五种错：引物、酶涂、因dNTP乏、模板和口Mg热2+描。煎拼.1陆引物倡引物是华PCR票特异性反应细的关键，旦PCR决产物的特异蜜性取决于引奏物与模板艇DNA佩互补的程度鬼。理论上，仰只要知道任莫何一段模板寄DNA渗序列，就能袖按其设计互增补的寡核苷幼酸链做引物蓝，利用骆PCR恒就可将模板像DNA匙在体外大量拘扩增。垃引物设计应迫遵循以下原西则：帜（1）引物宪长度垂长度要求在托15傻～按30bp欧，常用为移20bp征左右，引物怎过短时会造捞成评Tm体值过低，在撇酶反应温度凑时不能与模洽板很好的配土对；引物过丧长时又会造孔成尝Tm否值过高，超耻过酶反应的录最适温度，争且合成长引晃物还会使费弯用大大增加饼。舱（2）引物面碱基构成绞引物的拉G+C慎含量以厨40袭～冠60%刘为宜，因为蚊G+C货含量过高或到过低都会直死接造成蜘Tm粒值的过高或沫过低，都不肉利PCR反村应的进行。岂ATGC格最好随机分换布，避免洗5灯个以上的嘌沾呤或嘧啶核妥苷酸的成串室排列。趟（3）引物简二级结构南应尽量避免悼引物内部出仿现二级结构尘，并且两条五引物间不能婶形成互补结团构，特别是墨3’战端的互补，丢否则形成引涉物二聚体，买PCR扩增梯中产生非特醉异的条带。踩引物自身也锈应无回文对虾称结构（限爹制性酶切位功点除外），也防止形成茎蛮环结构。可（4）引物壤3’壶端序列捞3’惜端碱基要求索与模板严格灵配对，连续谢配对的碱基翠数超过15病bp慌，以避免因替末端碱基不腊配对而导致凳PCR汪失败。陷（5）引物峰中酶切位点史的引入育引物中一般闯会引入一至跟两个酶切位犬点，便于后院期的克隆实格验，特别是患在用于表达挥研究的目的斜基因的克隆团工作中，P城CR克隆基劈因时已将后棵续方案设计虑完毕。选（6）引物夺的特异性伯引物应与核巴酸序列数据圣库的其它序论列无明显同戴源性，特别派是与待扩增刺的模板DN壤A之间要没王有明显的相员似序列。携（7）引物短量绩反应体系中鹅引物的常用坏浓度为励0.1李～惰1pmol顷/编l达，以最低引炭物量产生所熟需要的结果班为好，引物背浓度偏高会详在反应过程难中形成二聚耻体，过低则扶扩增效率会锣降低。仿括.2婶酶及其浓度既TaqD敌NA碎多聚酶是耐惰热绩DNA封聚合酶，是货从水生栖热胀菌（失Therm镰usaq缺uatic父us阿）中分离的柳。辰TaqD想NA浅聚合酶是一旷个单亚基，织分子量为躺94谎，胸000D侧a醋。具有其5’-->传3逗的聚合酶活牙力，唯5’惠-->3’萄的外切核酸贩酶活力，无信3’-->君5’妙的外切核酸辩酶活力，会液在迟3’盾末端不依赖烦模板加入肌1奴个脱氧核苷山酸（通常为爷A渴，故PCR犁产物克隆中栋有与之匹配些的T载体）蹄，在体外实侨验中，童TaqD套NA暮聚合酶的出简错率为斧10携-4破～秧10邪-5身。此酶的发生现使误PCR俭广泛的被应甩用。贫此酶具有以只下特点：帆（1）耐高流温，在拘70票℃爽下反应谜2标小时后其残蹲留活性在隔90%添以上，在矮93粮℃体下反应攻2麦小时后其残易留活性是仍欣能保持量60%锤，而在肤95尿℃绵下反应熊2诸小时后为原仇来的滔40%屋。耻（2）在热恳变性时不会目被钝化，故维不必在扩增叫反应的每轮怎循环完成后府再加新酶。害（3）一般寸扩增的PC梅R产物长度证可达阶2.0k罗b奔，且特异性锦也较高。廉PCR誉的广泛应用积得益于此酶没，目前各试事剂公司中开码发了多种类妈型的Taq暑