食品微生物检验课 4-2 GBT 4789.3-2010 大肠菌群计数

食品微生物学检验

大肠菌群计数

浙江工商大学赵广英GB4789.3-2010食品安全国家标准

食品微生物学检验大肠菌群计数

Nationalfoodsafetystandard

Foodmicrobiologicalexamination:Enumerationofcoliforms

2010-03-26发布2010-06-01实施食品伙伴网中华人民共和国卫生部发布前言本标准代替GB/T4789.3-2008《食品卫生微生物学检验大肠菌群计数》。本标准与GB/T4789.3-2008相比，主要修改如下：——修改了标准的中英文名称；——“第二法大肠菌群平板计数法”的平板菌落数的选择范围修改为“15CFU～150CFU”；——删除了“第三法大肠菌群PetrifilmTM测试片法”。本标准的附录A、附录B为规范性附录。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：——GB4789.3-1984、GB4789.3-1994、GB/T4789.3-2003、GB/T4789.3-2008。1范围本标准规定了食品中大肠菌群（Coliforms）计数的方法。本标准适用于食品中大肠菌群的计数。

/uploads/201005/12751421897T9lSsmf.jpg大肠杆菌(e-coli).hk/imglanding?2术语和定义

2.1大肠菌群coliforms:在一定培养条件下（基质、在36±1℃48h－96h）能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。*（一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。）

*用途：该菌主要来源于人和温血动物粪便，以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌（如霍乱、伤寒、痢疾等）的可能。为何选用大肠菌群作为食物和饮水被粪便污染的指标－指示菌？

－－因其符合作为指示菌的条件：

①来源只有肠道，且普遍而量多：②在外界生存条件和肠道致病菌相符或略长，但不在水中繁殖;③对消毒药的抵抗力和肠道致病菌相符;④检查方法比较简单。还有什么菌可作为食物和饮水被粪便污染的指标菌？

－－产气荚膜杆菌和粪链球菌可辅助证明，二者都是重要肠道正常菌群成员产气荚膜杆菌：可在外界环境中形成芽胞，抵抗力强，存活时间长，对氯抵抗力强；检测有氯消毒水的污染情况。粪链球菌：在自然环境中存活时间又较短。大肠菌群、产气荚膜杆菌和粪链球菌三者都检出说明食品新近被粪便所污染。2.2

最可能数mostprobablenumber，MPN:最可能数mostprobablenumber，MPN:基于泊松分布的一种间接计数方法。泊松分布(Poissondistribution):（述昆虫随机分布型的数学表达公式。）一种概率分布，其特点是该分布的均值等于方差。适合于描述单位时间内随机事件发生的次数。Siméon-DenisPoisson*在生态学中常用来描述随机分布型的生物个体的空间分布格局。泊松分布是一种统计与概率学里常见到的离散概率分布，由法国数学家西莫恩·德尼·泊松（Siméon-DenisPoisson）在1838年发表。3设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：3.1恒温培养箱：36℃±1℃。······3.11菌落计数

/upload/encyclopedia/ac4培养基和试剂4.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LaurylSulfateTryptose，LST）肉汤：见附录A中A.1。4.2煌绿乳糖胆盐（BrilliantGreenLactoseBile，BGLB）肉汤：见附录A中A.2。4.3结晶紫中性红胆盐琼脂（VioletRedBileAgar，VRBA）：见附录A中A.3。4.4磷酸盐缓冲液：见附录A中A.4。4.5无菌生理盐水：见附录A中A.5。4.6无菌1mol/LNaOH：见附录A中A.6。4.7无菌1mol/LHCl：见附录A中A.7。4.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LaurylSulfateTryptose，LST）肉汤：见附录A中A.1成分胰蛋白胨或胰酪胨

20.0g

氯化钠5.0g

乳糖

（产酸产气）

5.0g

磷酸氢二钾

2.75g

磷酸二氢钾2.75g

月桂基硫酸钠*0.1g

蒸馏水1000.0mL

pH6.8±0.2*月桂基硫酸钠（又称十二烷基硫酸钠/椰油醇（或月桂醇）硫酸钠）具有抑制非大肠菌群的细菌生长和修复已损伤的大肠菌群细胞的作用制法将上述成分溶解于蒸馏水中，调解pH。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL，121℃灭菌15min。

大肠杆菌在月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(LST)上典型特征/news_details.asp?ID=37大肠菌群检验中常用的抑菌剂：大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。抑菌剂的主要作用是抑制其它杂菌，特别是革兰氏阳性菌的生长。国家标准中乳糖胆盐发酵管利用胆盐作为抑菌剂，行业标准中LST肉汤利用十二烷基硫酸钠作为抑菌剂，BGLB肉汤利用煌绿和胆盐作为抑菌剂。抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于大肠菌群细菌的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也产生一些抑制作用。有些抑菌剂用量甚微，称量时稍有误差，即可对抑菌作用产生影响，因此抑菌剂的添加应严格按照标准方法进行。4.2煌绿乳糖胆盐（BrilliantGreenLactoseBile，BGLB）肉汤：见附录A中A.2。成分蛋白胨10.0g

乳糖

10.0g产酸产气

牛胆粉溶液

200mL

抑制革蓝氏阳性菌

（oxgall或oxbile）

0.1%煌绿水溶液

13.3mL抑制非肠道杆菌蒸馏水800mL

pH7.2±0.1/upload/3624d40796bc8e4d6713a04028984031.jpg大肠菌群在煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB）中生长制法将蛋白胨、乳糖溶于约500mL蒸馏水中，加入牛胆粉溶液200mL(将20.0g脱水牛胆粉溶于200mL蒸馏水中，PH7.0~7.5)用蒸馏水稀释到975mL，调节pH至7.4，再加入0.1%煌绿水溶液13.3mL，用蒸馏水补足到1000mL，用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL，121℃灭菌15min。4.3结晶紫中性红胆盐琼脂（VioletRedBileAgar，VRBA）：见附录A中A.3。成分蛋白胨7.0g

酵母膏3.0g

乳糖10.0g产酸产气氯化钠5.0g

胆盐或3号胆盐1.5g抑制杂菌中性红0.03g

结晶紫0.002g抑制杂菌，特别是G＋菌琼脂15~18g

蒸馏水1000.0mL

pH7.4±0.1/upimg/080227/20_094931.jpg大肠菌群在结晶紫中性红琼脂(VRBA)上的典型特征

4.4磷酸盐缓冲液：见附录A中A.4。4.5无菌生理盐水：见附录A中A.5。4.6无菌1mol/LNaOH：见附录A中A.6。4.7无菌1mol/LHCl：见附录A中A.7。第一法大肠菌群MPN计数法

5检验程序大肠菌群MPN计数的检验程序见图1。初发酵试验月桂基硫酸盐胰蛋白胨3个×3管×1mL调pH:6.5～7.5续图1复发酵试验一环接种煌绿乳糖胆盐6操作步骤

6.1样品的稀释6.1.1固体和半固体样品：称取25g样品,放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000r/min～10000r/min均质1min～2min,或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，制成1:10的样品匀液。6.1.2液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。6.1.3

样品匀液的pH值应在6.5～7.5之间，必要时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节。6.1.4

用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。6.1.5

根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。6.2初发酵试验每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），36℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h±2h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。6.3复发酵试验：用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36℃±1℃培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。6.4大肠菌群最可能数（MPN）的报告：按6.3确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附录B），报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。附录B第二法大肠菌群平板计数法：7检验程序大肠菌群平板计数法的检验程序见图2。2－3天大肠菌群在结晶紫中性红胆盐琼脂上的典型菌落煌绿乳糖胆盐肉汤证实试验结晶紫中性红胆盐琼脂8操作步骤8.1样品的稀释按6.1进行。8.2平板计数8.2.1选取2个～3个适宜的连续稀释度,每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1mL。同时取1mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。8.2.2及时将15mL～20mL冷至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3mL～4mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于36℃±1℃培养18h～24h。8.4证实试验从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，36℃±1℃培养24h～48h，观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。8.3平板菌落数的选择选取菌落数在15CFU～150CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。8.5大肠菌群平板计数的报告经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以8.3中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。例：10-4

样品稀释液1mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×6/10×104

/g（mL）=6.0×105

CFU/g（mL）。复习与思考题1、翻译：大肠菌群测定(Enumerationofcoliforms

)、MPN含义和用途？2、大肠菌群的定义？为什么选择大肠菌群作为食品可能被粪便（肠道病原菌）污染的指示菌？3、概述本国标中检查大肠菌群的主要培养基有哪三种？各种中主要的选择性鉴别成份及其机理是什么？4、试述大肠菌群测定程序的第一法5、自学：⑴附录B：大肠菌群最可能数（MPN）检索表（实验用）⑵生活饮用水大肠菌群检测（实践用）THEEND2008年国标的PPT前言对03版的修改本标准第一法和第二法修改采用美国食品药品管理局（FDA）《细菌学分析手册》第4章大肠杆菌和大肠菌群计数(2002)。本标准第三法修改采用国际分析家学会AOAC990.14《食品中大肠菌群和大肠杆菌计数Petrifilm测试片法》(1994)。

本标准与FDA和AOAC方法相比主要区别是：将样品制备时取样量50g（或50mL）修改为25g（或25mL）将培养基温度由35℃±1℃修改为36℃±1℃

本标准代替GB/T4789.3--2003《食品卫生微生物学检验大肠菌群测定》。

本标准与GB/T4789.3-2003相比修改如下：将标准名称改为“食品卫生微生物学检验大肠菌群测定”；增加了大肠菌群的平板计数法和纸片法检测方法；大肠菌群的MPN（mostprobablenumber）法从以乳糖胆盐为主要培养基的MPN法，修改为以月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤为主要培养基的MPN法；大肠菌群的MPN法中原“报告每100

mL(g)大肠菌群的MPN值”，修改为“报告每1mL(g)大肠菌群的MPN值”。一、范围本标准规定了食品中大肠菌群计数的方法。标准适用于各类食品中大肠菌群的计数。/calcine.htm二、术语与定义大肠菌群

coliforms

一群在36℃条件下培养48h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌*。最有可能数mostprobablenumber；MPN

*:一般认为大肠菌群可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。

用途：

大肠菌群主要来源于人和温血动物粪便，以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌（如霍乱、伤寒、痢疾等）的可能。在食品中存在的大肠菌群数量越多，表示该食品受粪便污染的程度越大，也就相应地表示该食品被肠道致病菌污染的可能性也就越大。为何选用大肠菌群作为食物和饮水被粪便污染的指标－指示菌？

－－因其符合作为指示菌的条件：

①来源只有肠道，且普遍而量多：

②在外界生存条件和肠道致病菌相符或略长，但不在水中繁殖

③对消毒药的抵抗力和肠道致病菌相符：

④检查方法比较简单。还有什么菌可作为食物和饮水被粪便污染的指标菌？

－－产气荚膜杆菌和粪链球菌可辅助证明，二者都是重要肠道正常菌群成员产气荚膜杆菌：可在外界环境中形成芽胞，抵抗力强，存活时间长，对氯抵抗力强；检测有氯消毒水的污染情况。粪链球菌：在自然环境中存活时间又较短。大肠菌群、产气荚膜杆菌和粪链球菌三者都检出说明食品新近被粪便所污染。三、设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：恒温培养箱：36℃±1℃冰箱：2℃--5℃恒温水浴箱：46℃±1℃天平：感量0.1g均质器、振荡器。无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。无菌锥形瓶：容量500mL无菌培养皿：直径90mmpH计或pH比色管或精密pH试纸。菌落计数器或PetrifilmTM自动判读仪。四、培养基和试剂月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)磷酸盐缓冲液无菌生理盐水：称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃

高压灭菌15min。1mol/L氢氧化钠（NaOH)：称取40g氢氧化钠溶于1000mL蒸馏水中。1mol/L盐酸（HCl)：移取浓盐酸90mL，用蒸馏水稀释至1000mL。PetrifilTM大肠菌群检验测试片和压板。培养基特定培养基的选择制备一般原则

有基础营养物质；有专有营养物质;指示物；有杂菌抑菌剂。大肠菌群检验中常用的抑菌剂有：

胆盐、十二烷基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。抑菌剂的主要作用：抑制其它杂菌，特别是革兰氏阳性菌的生长。标准中月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤利用月桂基硫酸盐（十二烷基硫酸钠）作为抑菌剂；煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤利用煌绿和胆盐作为抑菌剂。结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)利用结晶紫和胆盐作为抑菌剂月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤成分胰蛋白胨或胰酪胨

20.0g

氯化钠5.0g

乳糖

5.0g（产酸产气）

磷酸氢二钾

2.75g

磷酸二氢钾2.75g

月桂基磺硫酸钠0.1g

蒸馏水1000.0mL

pH6.8±0.2*月桂基硫酸钠（又称十二烷基硫酸钠/椰油醇（或月桂醇）硫酸钠）具有抑制非大肠菌群的细菌生长和修复已损伤的大肠菌群细胞的作用制法将上述成分溶解于蒸馏水中，调解pH。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL，121℃灭菌15min。煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤

成分蛋白胨10.0g

乳糖

10.0g

产酸产气

牛胆粉溶液

200mL抑制革蓝氏阳性菌

0.1%煌绿水溶液

13.3mL

指示剂月桂基磺硫酸钠0.1g抑制杂菌，促进大肠菌生长

蒸馏水1000.0mL

pH7.2±0.2制法将蛋白胨、乳糖溶于约500mL蒸馏水中，加入牛胆粉溶液200mL(将20.0g脱水牛胆粉溶于200mL蒸馏水中，PH7.0~7.5)用蒸馏水稀释到975mL，调节pH至7.4，再加入0.1%煌绿水溶液13.3mL，用蒸馏水补足到1000mL，用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL，121℃灭菌15min。结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)成分蛋白胨

7.0g

酵母膏3.0g

乳糖10.0g

产酸产气

氯化钠5.0g

胆盐或3号胆盐

1.5g

抑制杂菌

中性红0.03g

结晶紫

0.002g

抑制杂菌，特别是G＋菌

琼脂15~18g

蒸馏水1000.0mLpH7.4±0.1制法将上述成分溶于蒸馏水中，静置几分钟，充分搅拌，调节pH，煮沸2min，将培养基冷却至45~50℃倾注平板。使用前临时制备，不得超过3h。五、检验程序

及操作步骤

(1)第一法大肠菌群MPN计数

检验程序如图：初发酵试验复发酵试验

操作步骤

1.样品的稀释

2.初发酵试验

3.复发酵试验

4.大肠菌群最可能数报告样品的稀释固体和半固体样品：称取25g样品，放人盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，800or/min--10000r/min均质1min--2min，或放人盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min--2min，制成1:10的样品匀液。液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品，置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分棍匀，制成1:10的样品匀液。样品匀液的pH

值应在6.5--7.5之间，必要时分别用1mol/L

氢氧化钠（NaOH）或1mol/L

盐酸（HCl）调节。用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注人9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。

初发酵试验每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤）,36℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48h±2h。记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。未产气者为大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。

复发酵试验用接种环从所有48h±2h

内发酵产气的LST肉汤管中分别取培养物l环，移种于煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤管中，36℃±1℃

培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。大肠菌群最可能数报告根据大肠菌群阳性管数，检索MPN表，报告每克（或毫升）样品中大肠菌群的MPN值。(2)第二法

大肠菌群平板计数

检验程序如图：

操作步骤

1.样品的稀释(同第一法)

2.平板计数

3.平板菌落数选择

4.证实试验

5.大肠菌群平板计数报告平板计数选取2个～3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种两个无菌平皿，每皿1mL。同时分别取1mL生理盐水加入两个无菌平皿作空白对照。及时将15mL-20mL冷至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3mL-4mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于36℃±l℃培养18h-24h。平板菌落数选择选取菌落数在30-150之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可