水产品兽药残留检测技术概述

样品处理方法包括原因很多，操作复杂，方法灵活，直接影响各项分析指标、成本和效率，普通占70%分析工作量。水产品兽药残留检测样品前处理技术水产品兽药残留检测技术概述第10页惯用提取溶剂有乙腈，甲醇，丙酮，这些溶剂与水，稀酸，稀碱混合溶剂如乙腈-甲醇，氯仿-甲醇，乙腈-水，或酸化，碱化等。乙酸乙酯，氯仿，二氯甲烷，乙醚和叔丁基甲醚。叔丁基甲醚可代替卤代溶剂。

1、提取溶剂选择

水产品兽药残留检测样品前处理技术水产品兽药残留检测技术概述第11页乙腈，甲醇，丙酮与样品轻易结合，溶剂化作用和渗透能力强，粘度小，提取速度快，能使结合态药品释放，提取同时脱蛋白脱脂，PH值可调，待测物分布均匀。但提取杂质较多，深入萃取乳化严重，效果相同，甲醇提取液杂质最高。“万能溶剂”DMSO沸点高极少用。在酯溶性残留物中，采取非水溶性极性溶剂，乙酸乙酯，氯仿，二氯甲烷，乙醚。加无水硫酸钠，盐析提升回收率。干样（含水小10%）加水增强提取。

1、提取溶剂选择

水产品兽药残留检测技术概述第12页均浆提取法；震荡法；索氏提取法（考虑热稳定性，适合水分少如饲料样品，水产品组织要和海砂或无水硫酸钠一起研磨成干粉）；超声波提取（SAE，空化作用，增加溶解，时间不能长，发烧）；超临界流体萃取（SFE），强化溶剂萃取（ASE）和微波辅助萃取（MAE）2、提取方法

水产品兽药残留检测样品前处理技术水产品兽药残留检测技术概述第13页超临界流体密度与液体相同，不过溶质在其中扩散系数比液体中大得多。极性低碳氢化合物，醚，酯，环氧化合物，能够在低压力下提取（7-10MPa）进行萃取，羟基，羧基难萃取，一个羧基和两个羟基化合物和三个酚羟基苯环衍生物能够被萃取；40MPa以下，糖和氨基酸都不能被萃取；分级极性差异和挥发性差异。2、提取方法

水产品兽药残留检测样品前处理技术水产品兽药残留检测技术概述第14页

超临界流体萃取仪—流体源，加压装置，控温装置，萃取容器，节流装置，搜集装置。CO2作为流体操作温度低，利于热不稳定化合物，组分中不含氧，预防氧化。2、提取方法

水产品兽药残留检测样品前处理技术水产品兽药残留检测技术概述第15页液-液萃取LLELLE利用待测组分与样品杂质在互不相溶两相中溶解性差异进行净化。设计基础为：极性组分与非极性组分；极性物质再分成酸性，中性，碱性物质。正己烷（石油醚）-乙腈；正己烷-甲醇；正己烷-丙酮；异辛烷-80%丙酮；氯仿-水；乙酸乙酯-水。影响原因：溶剂，PH值（磺胺，喹诺酮，苯并米唑类，苯乙胺类等）3、净化方法水产品兽药残留检测样品前处理技术水产品兽药残留检测技术概述第16页液-液萃取操作方法分液漏斗震荡，漩涡萃取，逆流萃取，特殊容器萃取。从水相中提取药品时溶剂中常带如少许水分，可干扰固相萃取，延长浓缩时间和增加杂质，加无水硫酸钠脱水。高极性药品在净化中发生吸附，硅烷化玻璃器皿（1%三甲基氯硅烷甲苯溶液淌一次，100℃下干燥30min）；加异丙醇或二乙胺也能降低吸附。3、净化方法水产品兽药残留检测样品前处理技术水产品兽药残留检测技术概述第17页固相萃取（SPE）采取固相萃取小柱作为分离媒介，小柱中添加了不一样填料固定相，以键合硅胶为基质C18、NH2、COOH、PSA、SAX等，是硅胶表面活性大为降低，最大程度降低了极性化合物不可吸附和拖尾，使样品回收率和重现性得到保障；以高分子聚合物为基质如PEP、HXN、PAX、PCX等，含有高纯度、高比表面特点；以吸附型填料为固定相如硅酸镁、氧化铝等，主要经过表面极性吸附到达分离目标。所以，固相萃取法适合用于各种极性化合物

3、净化方法水产品兽药残留检测样品前处理技术水产品兽药残留检测技术概述第18页固相萃取（SPE）

3、净化方法水产品兽药残留检测样品前处理技术水产品兽药残留检测技术概述第19页固相萃取（SPE）操作步骤：活化，上样，洗涤，洗脱。其它方法固相微萃取：固液吸附平衡制备色谱法：制备HPLC分析激素残留凝胶渗透色谱法：分子筛作用膜分离技术：硝酸纤维，醋酸纤维等半透膜基质固相分散技术：样品和填料百分比是1：4免疫亲和色谱：连接有抗体惰性基质做固定相，选择性吸附。分子印迹技术：印迹聚合物，塑料抗体

3、净化方法水产品兽药残留检测样品前处理技术水产品兽药残留检测技术概述第20页

旋转蒸发：溶剂可回收气流吹蒸：少许溶剂K-D浓缩器：浓缩，回流，洗涤，定容真空离心：热敏性组分，粘稠液体再溶解使用流动相初始百分比作溶剂4、浓缩富集及再溶解水产品兽药残留检测样品前处理技术水产品兽药残留检测技术概述第21页步骤1.确立质谱条件2.建立LC方法3.内标选择4.前处理方法选择建立液相色谱串联质谱定量分析方法水产品兽药残留检测技术概述第22页文件检索：了解化合物性质包含化合物结构、化合物极性及化合物pKa值。首先了解化合物结构，可大约推断其碎片离子断裂方式，选择较为稳定碎片离子作为定量子离子，也能够依据经验判断选取哪种离子源更为适当；依据化合物极性大小，能够选择一个或几个恰当溶剂作为溶媒，既能确保完全将样品溶解，又能提升化合物质谱响应；化合物pKa值，有利于选择流动相添加剂及其pH值，从而提升质谱响应。

建立液质定量分析方法水产品兽药残留检测技术概述第23页建立液质定量分析方法水产品兽药残留检测技术概述第24页1.连接管路2.选择Q1MS扫描模式和FullScan扫描类型3.设置离子源参数4.将流动相导入质谱仪，观察到待测化合物准分子离子峰峰强度在106次方左右。1、确立质谱条件（化合物优化）建立液质定量分析方法水产品兽药残留检测技术概述第25页5.选择MSOnly优化模式和SyringePumpInfusion入口类型选项6.优化TubeLensOffset、SprayVoltage、SheathGasPressure、AuxGasPressure取得待测化合物稳定准分子离子峰。7.选择MS+MS/MS优化模式设置ParentMass、ChargeState和NumProduct对子离子进行优化。8.MRM优化模式优化TubeLensOffset和CollisionPressure9.统计并保留子离子全扫描质谱图。保留TuneMethod文件。

1、确立质谱条件（化合物优化）建立液质定量分析方法水产品兽药残留检测技术概述第26页1、确立质谱条件（化合物优化）建立液质定量分析方法水产品兽药残留检测技术概述第27页1、确立质谱条件（化合物优化）建立液质定量分析方法水产品兽药残留检测技术概述第28页2、确立LC条件在液相-紫外检测中，使用添加剂种类繁多，能够是挥发性酸或者碱（如甲酸、乙酸和氨水等），也能够是不易挥发缓冲盐（如磷酸二氢钠-磷酸缓冲液、磷酸二氢钾-磷酸缓冲盐）。不过在液质分析中，基于质谱检测原理，我们只能使用可挥发酸碱或缓冲盐，那么种类就会受到极大限制。在日常分析中使用到添加剂主要有甲酸、乙酸、三氟乙酸、氨水和甲酸铵、乙酸铵等缓冲盐。三乙胺在紫外检测中，常作为扫尾剂，不过在液质检测中是绝对禁止。因为三乙胺进入质谱后不易去除，残留及其严重，能够抑制离子响应。在液相色谱紫外检测中，要求化合物之间R≥1.5，进行定量，那R最好≥2.0，要求准确配制流动相，准确调好流动相pH及添加剂浓度。但在液质分析中，我们经常使用多反应监测（MRM/SRM）对化合物进行定量，因为MRM要求选择两次离子，所以它含有很高专属性，基于这点我们对多个化合物同时进行检测时，不需要彼此间到达完全分离就能够对他们进行定量分析。建立液质定量分析方法水产品兽药残留检测技术概述第29页2、确立LC条件因为生物样品中含有大量基质，这些基质存在会严重干扰和影响化合物测定，因而我们需要利用色谱将化合物与基质分开，从而降低基质效应影响，即降低离子抑制。待测化合物要在色谱柱上有保留，而且适当延长保留时间。三聚氰胺最好用离子柱。建立液质定量分析方法水产品兽药残留检测技术概述第30页3、内标选择内标工作方式：在每个样品、标准和空白中加入测定到每个样品中内标响应依据实际测定内标响应值与预期内标响应值比值来校正其它化合物信号用分析信号和内标比作标准曲线或乘校正因子或除内标回收率计算未知样品分析信号和内标比值并从标准曲线中读出信号建立液质定量分析方法水产品兽药残留检测技术概述第31页3、内标选择1.样品中不存在或者能够忽略2.没有受到质谱干扰3.没有对分析对象产生质谱干扰4.不轻易受到环境污染5.和分析对象质量数接近（氘代物）6.离解方式和分析对象靠近建立液质定量分析方法水产品兽药残留检测技术概述第32页能力验证经验及基质效应为何要采取LC-MS考评化合物含量越来越低基体越来越复杂药残能力验证提议第一方法比如：干鱼粉中恩诺沙星和环丙沙星鱼肉中氟苯尼考水产品兽药残留检测技术概述第33页能力验证经验及基质效应

考评中质量控制方法控制样品空白平行双样测定或三样加标回收标准参考物质同时分析重复测定和仪器比对水产品兽药残留检测技术概述第34页能力验证经验及基质效应加标回收：可分为前处理加标回收和上机加标（单点标准加入）水产品兽药残留检测技术概述第35页能力验证经验及基质效应加标回收：可分为前处理加标回收和上机加标（单点标准加入）加标回收靠近100％不能代表考评结果完全准确无误。不能检验标准物质本身所带来误差；不能检验加和性干扰，如污染和质谱干扰；水产品兽药残留检测技术概述第36页能力验证经验及基质效应标准参考物质同时分析：选择基体和浓度相同标准参考物质同时进行分析作用：标准是否合格样品前处理是否适当测定中是否存在干扰当前药残标准参考物质极难购置，对于固体国家一级标准物质，即使不能购得，也要尽可能搜集到证书。水产品兽药残留检测技术概述第37页能力验证经验及基质效应其它质控方法不一样仪器比对试验不一样仪器在一定程度可考查基体和质谱干扰情况重复分析和人员比对试验尽可能消除过失误差和随机误差以上质量控制方法在考评中应尽可能多采取水产品兽药残留检测技术概述第38页能力验证经验及基质效应考评前准备确认色谱柱柱效各流动相充分清洗锥口重新调谐校正仪器总之就是使仪器处于良好状态水产品兽药残留检测技术概述第39页能力验证经验及基质效应预试验稀释到一定(或要求)倍数后测定稀释成各种稀释倍数有利于多项目标测定使浓度在标准曲线中间点有利于发觉干扰有利于预防污染水产品兽药残留检测技术概述第40页能力验证经验及基质效应定容要考虑溶剂匹配。测定每个样品测定23次，同时分析标准参加物质并分析加标样品。数据处理查看校准曲线是否符合要求确定是不一样质量数测定结果是否相同尽可能不一样超出标准曲线范围，如超出应稀释后测定。水产品兽药残留检测技术概述第41页能力验证经验及基质效应基质效应成因待测组分与基质中内源性物质共洗脱而引发色谱柱超载所致，这些成份常因在色谱分析中与目标化合物分离不完全或未被检测到而进入质谱后产生基质效应。待测组分与生物样品中基质成份在雾滴表面离子化过程中竞争。因为基质中一些干扰组分存在会使待测组分离子生成速度同标准样品相比有显著不一样，使得信号响应值产生较大变异。离子有效淌度受到周围离子影响，由其周围离子所形成包围圈，称为离子基体。假如样品组分从进样点到探测点迁移过程中，在某一时间间隔遇上一个不一样组成基体区带，这个离子基体区带就将对样品组分产生影响，使它们淌度发生瞬时改变，从而选择性地影响溶质迁移和分离，这就是瞬时离子基体效应。分为离子抑制和离子增强

水产品兽药残留检测技术概述第42页能力验证经验及基质效应基质效应评价：1.用流动相配制高中低三个浓度待测物，并加入内标，测得响应值。2.空白基质提取后加入相同浓度待测物和内标，测响应值。

基质效应=空白基质响应值/流动相响应值×100％

这么不一样浓度待测物基质效应和内标基质效应均可得到。

水产品兽药残留检测技术概述第43页能力验证经验及基质效应基质效应消除方法1.选择适当样品制备方法，对于不一样样品制备方法，不能简单地说某种方法优于另一个方法，每种组分对基质效应