免疫组化实验课

免疫组化实验课第1页，共48页，2023年，2月20日，星期日实验一实验动物取样、固定与保存（4学时）实验室规章制度及实验室安全讲解学生分组分小组配置相关溶液：操作动物的致死法及取材:操作细胞标本的制备：操作尸体解剖的取材：讲解活检标本的取材：讲解组织样品的固定：操作第2页，共48页，2023年，2月20日，星期日实验室规章制度及实验室安全⑴熟悉你所使用的化学物质的特性和潜在危害。⑵检查设备的性能，充分考虑到使用设备的局限性。⑶工作中碰到疑问，及时请教技术负责人以及有丰富知识的专业人员，不得盲目操作。⑷不得在实验室储藏食品、吃食品、抽烟、使用化妆品以及清洗隐形眼镜。不得将家属、小孩、亲友带进化学实验室。⑸必须戴防护镜，穿工作服，包括不露脚趾的满口鞋，长发必须束起。⑹熟悉在紧急情况下的逃离路线和紧急疏散方法；清楚灭火器材、安全淋浴间、眼睛冲洗器的位置、急救电话。⑺保持实验室门和走道畅通，最小化存放实验室的试剂数量，未经允许严禁储存剧毒药品。⑻实验必须在合适的通风柜内进行，密闭和有压力的实验必须在特种实验室进行。⑼离开实验室前须洗手，不可穿着实验室服装和戴手套进入清洁场所，如餐厅和休息室等。⑽遇试剂溢出，应当立即清除。如溢出物有剧毒气体挥发，当事人无法处理，必须及时疏散人员并封闭现场，立即报告室主任和安全部门。⑾保持实验室干净整洁，无堆积，每天至少清理一次实验台面，通常在下班前或完成某个特定实验后进行。⑿做实验期间严禁脱岗。过夜实验按所“过夜实验管理办法”执行。⒀及时按规定处理废弃化学品，包括化学废弃物、过期化合物、生物废弃物。每周在指定时间送往指定地点。⒁实验室及禁烟区内禁止吸烟，禁止吸游烟。严禁违章使用明火。⒂工作时间之外，任何人都不允许在实验室单独操作大型仪器和危险化学品，或单独处于具潜在危险的场所。第3页，共48页，2023年，2月20日，星期日学生分组1学生分为6组，每组3个人，每组选一个小组长2安排值日生第4页，共48页，2023年，2月20日，星期日分小组配置相关溶液1配制10XPBS及1XPBS10×PhosphateBufferedSolution（PBS）(pH7.4)：ReagentWeightFinalconcentrationNaClMW=58.4481.816g1.4MKClMW=74.552.01g27mMNa2HPO4·12H2OMW=358.1435.8g100mMKH2PO4MW=136.092.45g18mMH2OUpto1000ml注：1000ml溶液用约1ml10MNaOH调节pH值至7.4。因为实验室所用蒸馏水、三蒸水和去离子水的本底pH值有一定差异，加之NaOH可能由于放置时间而产生pH值的变化，故实际用量需根据情况调整。第5页，共48页，2023年，2月20日，星期日2配制1NHCl，1NNaOH3配制组织固定液：4%PFA4配制热修复液：Tris-EDTA5配制梯度酒精：75%，85%，95%6酒精：二甲苯=1:17石蜡：二甲苯=1:1分小组配置相关溶液第6页，共48页，2023年，2月20日，星期日动物的致死法动物处死方法：

1.麻醉法乙醚或4％戊巴比妥静注

2.空气栓塞法

3.断头法

4.断颈法

5.二氧化碳窒息法第7页，共48页，2023年，2月20日，星期日

病人死亡后，一般要在数小时后才能做尸检，因此，及时取材，尽早固定是开展IHC检测的关键。尸检组织的取材第8页，共48页，2023年，2月20日，星期日第9页，共48页，2023年，2月20日，星期日

抗原在组织中的分布常不均一，取材时应考虑：主要病灶，病灶与正常组织交界处，远离病灶的正常组织。

组织大小：长1cm×宽1cm×厚0.2～0.3cm。手术切除标本的取材第10页，共48页，2023年，2月20日，星期日

1.组织要求离体后30min内浸入固定液，尤其是开展分子生物学工作。动物组织取材要求心脏还在跳动时取材。2.注意防止人为因素的影响

刀和剪要快，刀要足够长。

3.组织块的大小

厚为0.1～0.3cm，大小可根据需要而定

4.组织的取材位置

要视研究目的，观察部位而定5.取材时间

原则上，应尽快取材，但比较大的手术标本如胃、肺、肠等器官，最好先固定后取材。组织取材注意事项第11页，共48页，2023年，2月20日，星期日

培养的活细胞可分贴壁和悬浮二种。贴壁细胞可将

（1）细胞大量培养后，经消化将细胞制成悬液（106）涂在涂有切片粘合剂的载玻片上，凉干后固定。

（2）将细胞直接培养在盖玻片上。

（3）将细胞直接培养在6孔或9孔板上，经固定后可行IHC。活细胞标本的制备法第12页，共48页，2023年，2月20日，星期日

目的

(1)防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。

(2)使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。（3）使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折射率，造成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。

（4）固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、增加组织硬度、便于制片。（5）防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。

（6）经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便于辨认。组织标本的固定第13页，共48页，2023年，2月20日，星期日

(1)甲醛固定液

10％福尔马林

(2)4％多聚甲醛固定液

(3)BouinS液及改良BouinS液

固定液的种类第14页，共48页，2023年，2月20日，星期日(1)大小2cm×2cm×0.3cm

(2)及时固定(3)固定时间固定时间要视组织块的厚薄，固定液的种类及浓度，温度而定，原则上，组织块大小与固定时间成正比，固定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。

(4)组织固定后必须彻底冲洗。固定方法的选择及注意事项第15页，共48页，2023年，2月20日，星期日实验步骤组织取材与细胞制备。组织取材：小鼠子宫、淋巴结、胸腺、脾、骨髓。组织洗涤。将取到的材料在灭菌预冷的PBS中洗净，尽量彻底洗掉血液，以免切片观察时红细胞影响结果；组织固定。所取材料于4％多聚甲醛中固定24小时（固定的时间依组织大小而定，组织较大可固定较长时间，如果一开始分小块固定，则固定时间应缩短，约6小时）；组织脱水。分别用50％和70％酒精脱水1h，样品在70％酒精中置于4℃保存直至石蜡包埋；梯度脱水。组织块从70％酒精中取出，在80％、95%、100％、100％酒精中各脱水1h；透明。组织块在100％酒精/二甲苯（1:1）中透明30min；再到二甲苯中透明，具体时间根据组织块大小而定，以组织块完全透明为宜；浸蜡。包埋机可直接接取加温并过滤好的石蜡液体，组织块在二甲苯/石蜡(1:1)、石蜡、石蜡中各透蜡2h；第16页，共48页，2023年，2月20日，星期日实验完毕整理实验室及实验台第17页，共48页，2023年，2月20日，星期日实验二组织包埋与切片及HE染色（4学时）实验内容：1经脱水，透明，浸蜡的组织样品进行包埋：操作2包埋样品的切片：石蜡切片3切片的HE染色：第18页，共48页，2023年，2月20日，星期日目的：

由于石蜡不溶于水和醇类试剂，只溶解在二甲苯类试剂中。因而,组织经固定和水洗后含大量水分,需用乙醇类试剂进行脱水,水脱完后,组织内含有大量的乙醇,还必须用能溶解乙醇的二甲苯来置换,最后经浸蜡,组织细胞内被大量石蜡支撑,才使组织能用于石蜡切片。组织脱水、浸蜡及包埋第19页，共48页，2023年，2月20日，星期日(1)脱水：75％、85％乙醇，95％Ⅰ、Ⅱ、

Ⅲ乙醇，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。

(2)透明：二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ(3)浸蜡：石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ、石蜡Ⅲ

(4)石蜡包埋：修蜡块，标号常规石蜡包埋过程第20页，共48页，2023年，2月20日，星期日一般的组织化学染色切片厚度要求在5～7µm左右，神经组织切片的厚度要求比较特殊，一般在20～100µm之间，以便观察神经纤维的走行。对于不同的组化反应在切片制作上有不同的要求。目前的切片技术主要有：冰冻切片、石蜡切片、超薄切片（电镜学）。

组织切片第21页，共48页，2023年，2月20日，星期日⑴骤冷（Quenching）骤冷的目的①最主要的目的是防止标本内的水结成冰晶——破坏标本结构。②杀死组织（细胞）。③快捷制片。冰冻切片是酶组织化学和免疫组织化学最常用的方法。它的突出特点：能比较好地保存组织的酶活性，较完好地保存组织抗原的免疫活性。

冰冻切片第22页，共48页，2023年，2月20日，星期日⑵切片骤冷后的组织块切片机上切片，目前的切片机有两类：1）开放式冰冻切片机（半导体制冷切片机、

甲醇制冷切片机及老式CO2、氯乙烷等切片机）。开放式冰冻切片机由于暴露于空气中，温度不易控制，技术难度大，现多已淘汰。2）恒温冰冻切片机（Cryastat）——常用

恒温冰冻切片机切片后如不染色，必须冷风吹干，贮存于低温冰箱内或短暂预固定后，冰箱贮存。

冰冻切片第23页，共48页，2023年，2月20日，星期日LEICA冰冻切片机第24页，共48页，2023年，2月20日，星期日石蜡切片LeicaRM2235RotaryMicrotome第25页，共48页，2023年，2月20日，星期日第26页，共48页，2023年，2月20日，星期日

(1)连续切片按序贴在玻片的下1/3。

(2)52－60℃烤片。

(3)切片厚2～4μm。

(4)切片刀要快

(5)编上号

(6)切片可在4℃保存数年（石蜡切片）(7)冰冻切片后需凉干后立即固定

(8)冰冻切片分固定和新鲜组织，固定组织需经庶糖处理24h，冰冻切片。

(9)冰冻切片固定后-80℃保存备用切片要求及注意事项第27页，共48页，2023年，2月20日，星期日包埋。在包埋盒底先铺上一定厚度的石蜡，置于热台，将组织用镊子放入，调整好方向，将包埋盒置于凉台，使底部略微凝固，继续浇上石蜡，放上切片托，凉台冷冻，浇蜡，冷冻，直至整个蜡块成型。置于凉台，待石蜡彻底凝固后，利用切片托将蜡块取出。组织切片。把切片刀架上，固定紧，然后利用切片托将蜡块在切片机固定器上夹紧。若位置不够平，可调整切片台的位置，同时修块。切片时，一开始可以将厚度调整至20μm。右手匀速转动手柄，直到把组织全部切出，这时将厚度调为5μm，继续切片。蜡片切成后，右手用小镊子摄蜡片，左手用毛笔沿刀锋轻轻把蜡片分开，切面朝下把切片放入42℃水中，展平后用镊子轻轻将连续蜡片分开，再用载玻片捞起，晾干，放入切片盒。37℃烤片过夜。石蜡包埋及切片实验步骤第28页，共48页，2023年，2月20日，星期日HE染色法，即是苏木精-伊红染色法。石蜡切片技术里常用的染色法之一。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。易于被碱性或酸性染料着色的性质分别称为嗜碱性和嗜酸性；若于两种染料的亲和力都不强，则称中性。一般的组织变化和组织产物都可以通过这一染色法显示出来。是形态学最常用的染色方法。HE染色第29页，共48页，2023年，2月20日，星期日HE染色步骤试剂时间×次数1二甲苯10min×32100％酒精5min×3395％酒精5min×1485％酒精5min×1570％酒精5min×1650％酒精5min×17蒸馏水5min×38苏木精染液10min9自来水（缓流水）10min10蒸馏水2min×1111％HCl分色1-2s（浸入即取出）12自来水（缓流水）立即冲净13蒸馏水2min×1140.1％氨水

返蓝2-2.5min15蒸馏水2min×11650％酒精5min×11770％酒精5min×11885％酒精5min×119伊红染液20s2095％酒精

脱浮色5min×12195％酒精

5min×122100％酒精5min×323二甲苯10min×324二甲苯&封片剂封片25通风橱晾干4h或过夜第30页，共48页，2023年，2月20日，星期日实验三免疫组化染色（4学时）实验内容：1免疫组化原理2免疫组化操作第31页，共48页，2023年，2月20日，星期日免疫组化原理抗原＋抗体（特异性）＋酶标记抗体，通过酶与底物作用生成有色反应物，定位组织或细胞内抗原的一门技术。第32页，共48页，2023年，2月20日，星期日设对照的目的是为了排除假阴性和假阳性。对照染色的目的第33页，共48页，2023年，2月20日，星期日假阴性的原因主要有：①组织处理不当，抗原丢失过多或被遮蔽；②抗体失活、效价过低或稀释度不合适（主要指一抗，即特异性抗体）；③染色步骤遗漏及差错，或显色剂的选择、缓冲液的pH和离子强度不当等。第34页，共48页，2023年，2月20日，星期日假阳性均系由多种因素造成的非特异着色所致，原因主要有：①自发荧光或内源酶等干扰；②抗体试剂不纯(特别是一抗）；③操作失误，如污染、切片干枯或显色剂操作不当等；第35页，共48页，2023年，2月20日，星期日对照染色大致可分为阳性组织对照、阴性组织及阴性试剂对照和自身对照四大类：对照的种类及其选用目的第36页，共48页，2023年，2月20日，星期日阳性组织对照指用已证实含有靶抗原的同源及不同源组织切片或细胞涂片与待检实验切片同时作同样处理和免疫染色的组织对照。正确的结果应呈现阳性，目的是为了证实所用免疫组化染色流程的有效性，排除假阴性的可能。对照的种类及其选用目的第37页，共48页，2023年，2月20日，星期日阴性组织对照指用已证实不含靶抗原的同步处理和免疫标记染色的组织对照。正确的结果应为阴性，目的是除外假阳性。对照的种类及其选用目的第38页，共48页，2023年，2月20日，星期日空白对照指以缓冲液（PBS、TBS等）取代第一抗体（主要的，必要时还可做第二抗体及桥联抗体的空白取代），其他各步不变的试剂对照染色，结果应为阴性。对照的种类及其选用目的第39页，共48页，2023年，2月20日，星期日取代对照指以所用方法第一抗体同源动物的正常血清，或与本实验无关的抗体(靶生物缺如的)取代第一抗体，其他步骤不变的试剂对照染色，结果应为阴性。吸收试验是指用事先经过量抗