动物细胞工程演示文稿

动物细胞工程演示文稿目前一页\总数一百零六页\编于四点优选动物细胞工程目前二页\总数一百零六页\编于四点3第一节概述

动物细胞工程是以动物细胞培养技术为主要手段，对动物细胞在离体条件下的细胞形态、结构、生理功能进行研究，在此基础上，采用工程技术手段对细胞的遗传或生理特性进行改造，以获得有价值的细胞产物、器官或个体的生物技术。目前三页\总数一百零六页\编于四点4动物细胞工程主要包括：动物细胞培养细胞杂交（融合）技术胚胎培养细胞核移植干细胞培养等。目前四页\总数一百零六页\编于四点5一、体外培养技术的产生与发展

19世纪后期，胚胎学的发展极为迅速，人们在研究胚胎学时，将一些活的组织放在体外进行观察，从而拉开了培养技术的序幕。目前五页\总数一百零六页\编于四点61.早期组织培养1859年，法国解剖学家Vulpain将蛙尾组织在水中培养，观察到了生长与分化现象。1885年，德国人Roux用温生理盐水在体外培养鸡胚组织并使之存活了数天，被认为是组织培养的萌芽。他首次提出了组织培养的概念。1897年，Loeb首次在含有血凝块的试管中培养兔的甲状腺、卵巢、肾脏等，发现这些器官在3天内仍保持正常的组织学结构。他的工作被认为是器官培养的最早尝试。目前六页\总数一百零六页\编于四点72.基本培养技术的建立1907年，实验胚胎学家Harrison（哈里森）为了研究神经突起的起源问题而进行了一项著名的实验：在无菌条件下将蛙胚神经组织接种在蛙的淋巴液中，放在一快盖玻片上，然后将盖玻片翻转并密封在一张凹玻片上，因而创建了盖片悬滴培养法。

Harrison采用该方法将神经组织培养了数周，并观察到神经突起的生长。这项工作标志着体外培养技术的创立。

目前七页\总数一百零六页\编于四点81912年，外科医生Carrel（卡勒尔）将外科手术的无菌操作观念带入体外培养技术，并连续培养鸡胚心肌组织长达数年。无菌观念已经成为体外培养的最重要理念。

Carrel的第二个重要贡献是将组织包埋技术、营养供应和细胞传代技术引入体外培养实验，使Harrison的盖片悬滴培养法更加完善。1923年，Carrel又设计出卡氏瓶培养法，进一步扩大了组织的培养空间，卡氏瓶已成为体外培养的重要器皿。目前八页\总数一百零六页\编于四点91925年，Maximow又把Harrison的悬滴培养法改良为双盖片培养,因而极大地方便了培养液的更换，大大降低了污染的机会。双盖片培养在体外培养的历史上发挥了重要作用，至今仍有不少学者采用这种方法。1926年，Strangewags设计了试管培养法，并改良了器官培养的营养供应方式，开始以血浆和胚胎提取液混合物代替单纯的血凝块。目前九页\总数一百零六页\编于四点101933年，GoGey创立了旋转管培养法，并以此建立了许多细胞系。如来源于人的肿瘤组织的Hela细胞系。1949年，Polge等人发现甘油能够用于保护低温下储藏的细胞。同年，Hanks等提出了Hanks平衡盐溶液。目前十页\总数一百零六页\编于四点113.体外培养技术的发展1950年，JFMorgan等人提出了199培养基。1951年Pomerat设计出灌流小室，实现了培养液的不断更新；1954年，Earle等建立了悬浮培养法。目前十一页\总数一百零六页\编于四点121957年，Dulbecco采用胰蛋白酶消化法分离细胞，创造了单层细胞培养法，以后的学者采用该方法建立了许多细胞系（cellline）。1959年，Lovelock等人发现了一种新的化学冷冻保护剂——二甲基亚砜（DMSO）1960年，Baski观察到两种不同细胞混合培养所产生的细胞自发融合现象。目前十二页\总数一百零六页\编于四点13二、动物细胞的体外培养生长特性目前十三页\总数一百零六页\编于四点14

除单细胞原生动物外，细胞培养过程具有以下特性；

细胞生长缓慢，分裂周期长，一般12-48小时，而且易受环境因素的影响；如CHO（中国仓鼠卵巢癌细胞）12.5小时，人胚肺成纤维细胞21小时；易受微生物污染，培养时需用抗生素；动物细胞较微生物大得多，无细胞壁，机械强度低，适应环境能力差；培养过程需氧量少，对搅拌搅拌或剪切力敏感；1.动物细胞培养特性目前十四页\总数一百零六页\编于四点15

在培养中，细胞相互粘连以集群形式存在，培养过程具有群体效应、锚地依赖性、功能全能性及接触抑制性（有接触抑制现象，即细胞在培养器皿表面生长到一定程度，相互紧密接触时，细胞停止生长）：

对环境因素非常敏感。培养器皿的特性、培养液的温度、pH值、溶氧浓度、营养成分及含量等均影响到细胞生长与分裂原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡。目前十五页\总数一百零六页\编于四点162、体外培养细胞生长方式

在活体内，细胞的形态与其功能密切相关。如肌细胞呈纤维状，便于收缩；神经细胞发出许多分支，便于形成网络；红细胞呈圆盘状，便于气体交换；上皮细胞呈不规则状，便于覆盖在器官表面相互挤压。目前十六页\总数一百零六页\编于四点17在离体条件下，细胞一般表现为三种形态：（1）贴壁依赖型（anchorage-dependent)细胞；（2）非贴壁依赖型（anchorage-independent)细胞：也称为悬浮型细胞，包括来源于血液的细胞和许多肿瘤细胞。（3）兼性贴壁细胞：主要是一些细胞系，如CHO细胞。目前十七页\总数一百零六页\编于四点贴壁依赖型细胞包括：（P87）1）成纤维细胞：细胞贴壁后呈梭形，细胞中央有圆形的核，胞质向外伸出2-3个长短不一的突起，生长时细胞群呈放射状。成纤维细胞、肌细胞、成骨胳细胞均具有这种特点；2）上皮型细胞：细胞贴壁后呈不规则三角形或柳叶形，细胞中央有圆形的核，生长时细胞紧密连接，长成单层片状。如皮肤表皮细胞、肝细胞、肺上皮细胞消化管外皮细胞，肝脏上皮细胞等等均具有这种特点；3）游走型细胞：如神经胶质细胞,分散生长，位置不固定，外形不规则等；4）多形型细胞：不常见，形态不规则，如神经组织细胞。目前十八页\总数一百零六页\编于四点19贴壁生长细胞的生长过程：游离期：细胞变圆吸附期：因细胞不同而有差异潜伏期：细胞不分裂繁殖期：细胞分裂增值停止、退化期：营养耗尽，产物积累，细胞停止分裂并开始退化目前十九页\总数一百零六页\编于四点20细胞接种后在培养液中呈悬浮状态，也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。10分钟一4小时游离期：吸附期：细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。

底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等目前二十页\总数一百零六页\编于四点21

血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）为何会贴壁？目前二十一页\总数一百零六页\编于四点22细胞贴壁的过程：目前二十二页\总数一百零六页\编于四点23对数生长繁殖期：细胞数随时间变化成倍增长，呈对数生长状态，活力最佳，最适合进行实验研究。潜伏期此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。目前二十三页\总数一百零六页\编于四点24对数生长期是细胞活力最好的时期，在接种细胞数量适宜情况下，指数生长期持续3-5d后，随细胞数量不断增多，生长空间日趋减少，细胞相互接触汇合成片，呈现接触抑制（Contactinhibition）。而恶性细胞则无接触抑制现象，因此接触抑制可作为区分正常与癌细胞标志之一。癌细胞则由于营养成分的消耗和细胞代谢产物的影响而发生密度抑制（Densityinhibition）目前二十四页\总数一百零六页\编于四点25停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂机制：接触抑制、密度依赖性。退化期：代谢产物积累，PH下降，细胞中毒受损，大量细胞出现死亡。目前二十五页\总数一百零六页\编于四点26目前二十六页\总数一百零六页\编于四点27容易更换培养基；可采用灌注培养；方便产物表达；方便调节培养液与细胞的比例；易于观察等。细胞贴壁生长优点（P104）:目前二十七页\总数一百零六页\编于四点283、体外培养细胞的生长与增殖1）、潜伏期（Latentphase）2）、指数生长期（Logarthmicgrowthphase）3）、停滞期（Stagnatephase）4）、死亡期目前二十八页\总数一百零六页\编于四点29胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％，用滤器过滤除菌。胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。用含血清培养液终止其对细胞的消化作用胰蛋白酶消化液目前二十九页\总数一百零六页\编于四点30第二节常见概念目前三十页\总数一百零六页\编于四点31一、原代培养与传（继）代培养1、原代培养（primaryculture):将组织取出来后，先用胰蛋白酶等使组织分散成单个细胞，然后配制成一定浓度的细胞悬浮液，再将该悬浮液放入培养瓶中，在培养箱中培养，这个过程称为原代培养。目前三十一页\总数一百零六页\编于四点322、传（继）代培养（secondaryculture,passage,split):细胞在培养瓶中贴壁生长。随着细胞的生长和增殖，培养瓶中的细胞越来越多，需要定期地用胰蛋白酶使细胞从瓶壁上脱离下来，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中培养，这称为传代培养。目前三十二页\总数一百零六页\编于四点小细节问题

当细胞生长达到一定密度后，都需要做传代处理，传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞的数量和细胞增殖速度有关。所谓细胞“一代”，即从细胞接种到分离再培养的一段时间。如某一细胞系为50代即该细胞已传代50次。

目前三十三页\总数一百零六页\编于四点34二、细胞株与细胞系1、细胞株（cellstrain):原代培养的细胞一般传至10代左右就不容易传下去了，细胞的生长就会出现停滞，大部分细胞衰老死亡。但是有极少数的细胞能够度过“危机”而继续传下去，这些存活的细胞一般能够传到40～50代，这种传代细胞叫做细胞株。细胞株细胞的遗传物质没有发生改变。目前三十四页\总数一百零六页\编于四点352、细胞系(cellline)：当细胞株传至50代以后又会出现“危机”，不能再传下去。但是有部分细胞的遗传物质发生了改变，并且带有癌变的特点，有可能在培养条件下无限制地传代下去，这种传代细胞称为细胞系。目前三十五页\总数一百零六页\编于四点36三、有限细胞系与无限细胞系1、有限细胞系（finitecellline）：指在连续传代培养后，细胞只能在有限的时间存活，最后细胞逐渐死亡。有限细胞系的存活时间与细胞来源（年龄、物种）有关，一般幼龄动物的存活时间比较长。例如来源于胚胎的成纤维细胞可以培养50代，而取自成年动物的成纤维细胞一般不超过30代；鸡胚成纤维细胞可以培养30代，而小鼠的则只能培养10代。研究表明细胞系的寿命与端粒和端粒酶有关。目前三十六页\总数一百零六页\编于四点372、无限细胞系(infinitecellline)：也称为永久细胞系，理论上可以无限传代，但实际上，每次传代后细胞有一定变化（例如，发生染色体丢失），多次传代后必须对细胞再次进行筛选和纯化处理。目前三十七页\总数一百零六页\编于四点38第三节

细胞培养的基本技术目前三十八页\总数一百零六页\编于四点39一、细胞体外生长的要求环境要求营养要求目前三十九页\总数一百零六页\编于四点401、细胞培养的环境要求温度pH值气体渗透压思考：主要考虑哪些环境因素？目前四十页\总数一百零六页\编于四点411）、温度：不同来源的细胞，其培养的最适温度不同。例如，昆虫及鱼类细胞25-28度，哺乳动物细胞一般为37度；细胞对低温的耐受力比高温强。

温度除直接影响细胞生长外，还与培养液的pH值有关，温度低时CO2溶解性增加，从而影响pH。目前四十一页\总数一百零六页\编于四点42CO2培养箱CO2培养箱设定的条件为37℃，5％CO2

。使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。②保持培养箱内空气干净。定期消毒（90℃，14h)。③箱内火菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。目前四十二页\总数一百零六页\编于四点432）、pH值：动物细胞培养最适pH值为，低于6.8或高于7.6均对细胞产生严重影响，甚至导致细胞死亡；一般原代培养的细胞对pH值要求严格，细胞系对一定范围的pH值改变有抵抗力。酚红是常用的指示剂，用来检测PH的变化：红色--pH7.4，橙色--pH7.0，黄色--pH6.5，蓝红色--pH7.6，紫色--pH7.8。目前四十三页\总数一百零六页\编于四点443）、气体：细胞在培养初期对溶氧要求较少，但在快速增殖（对数增长期或指数增长期）要求有较多的溶氧。4）、渗透压：培养液的渗透压一般保持在与体液相同的水平，对细胞较为适宜。例如，生理盐水或平衡盐溶液。目前四十四页\总数一百零六页\编于四点452、细胞培养的营养要求动物细胞培养营养要求高，培养液的主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液。分天然培养基和合成培养基。目前四十五页\总数一百零六页\编于四点461）、天然培养基：来自动物的体液或组织液，早期广泛采用。例如：血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）等；优点：营养成分丰富，培养效果好，符合细胞生长的要求；缺点：成分不确定，来源复杂、有限，不能做到标准化，易发生支原体污染。目前四十六页\总数一百零六页\编于四点472）、合成培养基：根据动物的体液成份和细胞生长的需要，由各种营养物质组合而成，如MEM、DMEM、RPMI1640等。优点：能够标准化生产，组分和含量相对固定，成本低；缺点：不能完全满足细胞生长与增殖的需要。因此，在培养时，一般在培养液中加入一定量（10-15%）的血清，为细胞提供促贴壁因子或促生长因子。目前四十七页\总数一百零六页\编于四点48人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清等）。血清中含有：①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）；②多种金属离子；③激素；④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等；⑤各种生长因子；⑥转移蛋白；⑦其它不明成分。目前四十八页\总数一百零六页\编于四点49一般说来．含2~5％小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死．但支持细胞生长一般需加10％血清．血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞．目前四十九页\总数一百零六页\编于四点50无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，如激素、生长因子、结合蛋白、贴壁和扩展因子等。无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。目前五十页\总数一百零六页\编于四点51血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。血清的灭活（消除补体活性）：56℃，30分钟血清的消毒：过滤除菌目前五十一页\总数一百零六页\编于四点52完全培养基的组成基础培养基80％一95％血清5％一20％碳酸氢钠2.0g/L青、链霉素各100卑位／毫升庆大霉素：每毫升100单位——方便、广谱、稳定淋可霉素：主要用于抑制支原体培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长目前五十二页\总数一百零六页\编于四点53例：培养基的配制PMI-1640培养粉1袋碳酸氢钠2.0g青、链霉素各100单位／毫升加三蒸水至1000ml,过滤除菌。调节pH值至7.2

加血清（终浓度为10％）目前五十三页\总数一百零六页\编于四点543、细胞传代方法根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。1、悬浮生长细胞传代离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。2、半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3、贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。目前五十四页\总数一百零六页\编于四点55二、细胞培养的准备实验室的布局仪器设备的准备实验用品的准备目前五十五页\总数一百零六页\编于四点超净工作台；细胞培养设备：如CO2培养箱；培养器材：如培养瓶，培养板等；其它：纯水设备，干燥、消毒除菌设备，清洗设备，冰箱等。1、仪器设备的准备目前五十六页\总数一百零六页\编于四点2)、血清：一般常用为小牛血清(包括胎牛血清)，人血清和其它动物血清。由于不同的研究目的，血清成分往往干扰研究实验，如进行药物和受体及营养等方面的研究时，需要使用无血清培养基。1)、培养液:

目前常用的基础培养液均已商品化，如RPMI1640，MEM，DMEM，F12等，可根据培养需求合理选择。2、实验营养用品的准备目前五十七页\总数一百零六页\编于四点58血清种类及来源：(1)胎牛血清(2)犊牛血清：犊牛出生后，不给吮乳，尽早由颈动脉无菌放血。(3)牛、马、羊血清：通常由颈静脉采取，或屠宰时由颈动脉放血采取。(4)其它血清：如兔血清和鸡血清等，

目前五十八页\总数一百零六页\编于四点3)、平衡盐溶液(BSS):

主要用于作为稀释和灌注的液体，维持细胞渗透压，提供缓冲系统，使培养液的酸碱度维持在培养细胞生理范围内，提供细胞正常代谢所需的水分和无机离子等。常用的有PBS，Hank’s等。4)、抗生素:

常用为青霉素（每毫升培养液50~100单位）和链霉素（每毫升培养液50~100微克）。目前五十九页\总数一百零六页\编于四点60Hanks液

(1)原液甲：

NaCl160gKCl8gMgSO4·7H202gMgCl2·6H202g加水至800mlCaCl22.8g加水至100ml

将上述两种溶液混合后，加水至1000m1，并加2m1氯仿作为防腐剂，保存于0～4℃冰箱内。目前六十页\总数一百零六页\编于四点61(2)原液乙：

Na2HPO4·12H2O3.04gKH2PO：1.20g

葡萄糖20.0g

加水至1000ml，加2ml氯仿防腐，保存于0—4℃冰箱内。按下述比例配成Hanks液：原液甲1份原液乙1份水18份

10磅15分钟灭菌后，置0—4℃冰箱内备用。使用时于100mlHanks液内加入3.5％NaHCO3液，将pH调至。目前六十一页\总数一百零六页\编于四点625）、细胞消化液：能水解细胞间的蛋白质，起解离、分散细胞的作用。消化液种类：胰蛋白酶溶液：常用0.125％和0.25％EDTA溶液：非酶性解离，常用0.02％目前六十二页\总数一百零六页\编于四点636）、培养基pH调整液HEPES（N’-2-hydroxy-ethylpiperazine-N’-ethanesulfonicacid），缓冲效能(pKa)在20℃时为7.55，37℃为7.31；HEPES不是起维持pH恒定的作用，而是起恒定和抵抗快速pH变化的。NaHCO3溶液，调整pH用。目前六十三页\总数一百零六页\编于四点646)、其它添加成分：有机补充物：如丙酮酸钠，谷胺酰氨等。促细胞分裂因子：如生长因子类的FGF(成纤维细胞生长因子)，EGF(表皮生长因子)。贴壁和铺展因子：如胶原蛋白，纤粘蛋白等。可根据培养细胞的特殊要求进行添加。目前六十四页\总数一百零六页\编于四点

解离常指组织、细胞的解离，在无菌情况下采取动物的组织或器官，放在含有抗生素的平衡盐溶液(BSS)中，然后尽快在超净台或无菌室内进行解离处理。常用酶和鳌合剂进行解离作用。三、细胞的解离目前六十五页\总数一百零六页\编于四点解离细胞的方法1）胰蛋白酶解离细胞法：所需时间较短，主要缺点是破损细胞。2）胶原酶解离细胞法：这种方法对解离胚胎性、正常和恶性组织是很有效的。胶原酶最终浓度200u/ml，36.5℃温育，一般温育4-48h。胶原酶和透明质酸酶协同作用有助于分离大鼠或兔的肝脏组织。3）机械解离细胞法：比酶法所需时间短，但细胞存活率较低。4）螯合剂解离细胞法：分离效果差目前六十六页\总数一百零六页\编于四点67第三节、细胞的培养悬滴培养法(hanging-dropculture)盖玻片培养法(coverslipculture)培养瓶培养法(flaskculture)旋转管培养法(rotatetubeculture)培养板培养法(plateculture)灌流小室培养法(perfusedchamberculture)一、体外培养的基本方法目前六十七页\总数一百零六页\编于四点681、悬滴培养法将组织块接种在一张包被有生长基质的盖玻片上，翻转盖玻片并置于凹玻片上，用熔蜡密封后放入培养箱中培养。悬滴培养法包括单盖片培养法与双盖片培养法优点：便于观察，培养液用量少；缺点：操作繁杂，空间小，培养环境难控制。Levi-Montalcini（1956）采用双盖片悬滴培养法发现了神经生长因子并荣获Nobel奖。目前六十八页\总数一百零六页\编于四点692、盖玻片培养法以盖玻片为生长表面，将组织块接种盖玻片上，然后一起放入培养瓶或培养皿中进行培养。优点：便于观察和染色处理；缺点：表面积小，仅适合短时间培养。目前六十九页\总数一百零六页\编于四点703、培养瓶培养法将组织块或细胞接种在培养瓶中，再放入培养箱中培养。玻璃培养瓶与塑料培养瓶（卡氏瓶）培养瓶的规格：底面积（25、100cm2）胶塞封口与螺口瓶（带通气膜）优点：极大地减少了污染机会，培养空间大，换液方便，便于观察；缺点：成本较高。目前七十页\总数一百零六页\编于四点714、旋转管培养法将组织细胞接种在培养管内，置于可旋转的支架（旋转鼓）上，边旋转边培养。优点：培养液均一性好，有利于细胞生长与物质交换；缺点：培养管的球面不利于观察。目前七十一页\总数一百零六页\编于四点725、培养板培养法将组织细胞接种在培养板内，置于培养箱中培养。是现代培养技术中最常用的方法。培养板规格：2孔、4孔、6孔、24孔、48孔、96孔等；优点：可进行微量培养、使培养容积标准化、可进行组间比较；缺点：成本较高。目前七十二页\总数一百零六页\编于四点736、灌流小室培养法将细胞接种在一个由上、下两张盖玻片和一个用金属圈密封围成的小室内，然后将整个小室保持在恒温下，使细胞在盖玻片上生长。在小室的侧壁分别有液体流入和排出的开口，新鲜培养液不断地灌注进小室，旧的培养液则不断流出小室。优点：能保持培养液的不断更新，有利于细胞生长与物质交换，有利于获得高浓度的产物；缺点：操作繁琐、难度较高。目前七十三页\总数一百零六页\编于四点74目前七十四页\总数一百零六页\编于四点75二、原代培养与传代培养技术

动物细胞培养中，幼龄组织优于老龄组织，分化程度低的优于分化程度高的，但均从原代培养开始。原代培养方法：

组织块培养法和组织消化培养

A组织块培养法：采取动物的组织或器官，剪碎组织，平衡盐溶液(BSS)冲洗，低速离心，然后洗涤接入培养瓶。目前七十五页\总数一百零六页\编于四点76B组织消化培养：目前七十六页\总数一百零六页\编于四点77原代细胞培养：鸡胚原代细胞：在无菌条件下采取9－10日龄鸡胚↓除去头(或仅除去喙和眼)、爪和内脏，并剪成块↓用Hanks液等充分冲洗↓剪将其剪成lmm大小的碎块↓加入Hanks液或其他洗液，充分冲洗↓约4倍量的0.25％胰酶，并调整pH至7.6－7.8↓37℃水浴中感作30分钟，每10分钟轻轻摇动一次↓吸弃上层胰酶溶液↓用洗液轻洗2次后↓吸管充分吹打，直至形成均匀的细胞悬液↓准备细胞计数↓单层细胞培养目前七十七页\总数一百零六页\编于四点78传代培养技术传代操作过程：吸出旧培养液；加入酶解液，消化至细胞间隙变大，胞质回缩为止；吸出消化液，用洗液洗；加入培养液，吸管轻轻吹打，制成细胞悬液；重新接种培养。目前七十八页\总数一百零六页\编于四点79三、现代细胞培养技术单层细胞培养技术悬浮细胞培养技术固定化细胞培养技术动物细胞大规模培养技术与生物反应器目前七十九页\总数一百零六页\编于四点801、单层细胞培养技术单层细胞培养主要针对大多数动物细胞需要附着于带正电荷的固体或半固体表面的特性，适用于成纤维细胞、上皮细胞及一些细胞系的培养。细胞贴壁过程目前八十页\总数一百零六页\编于四点81单层细胞培养也称为贴壁培养（attachmentculture)，这类细胞被称为锚着依赖性细胞(anchorage-dependentcell)。贴壁培养的优点：容易更换培养液、容易采用灌注培养以提高细胞密度、采用生长基质方便。贴壁培养的缺点：占表面积大，放大困难；不能有效监测细胞的生长；难以达到培养环境均一化。贴壁培养的表面特性：带正电荷、有高度表面活性、亲水性。主要材料有玻璃、塑料（聚苯乙烯）、金属（不锈钢、钛）、天然高分子材料（如葡聚糖）等。目前八十一页\总数一百零六页\编于四点822、悬浮细胞培养技术悬浮培养（suspensionculture)是指细胞在培养容器中自由悬浮生长的培养方式。适用于一些来源于血液、淋巴组织的细胞，许多肿瘤细胞以及某些转化细胞。动物细胞的悬浮培养是在微生物发酵的基础上建立起来的，但由于动物细胞没有细胞壁，不能耐受剧烈搅拌和通气时产生的剪切力，因而又与经典的发酵不同。目前八十二页\总数一百零六页\编于四点833、固定化细胞培养技术固定化细胞培养（immobilizationculture)是指采用吸附（固体吸附剂）、共价贴附（与固相载体结合）、共价交连（用试剂处理形成细胞絮结）、包埋（将细胞包埋在多孔材料内）等方法将细胞固定在支持物上，或形成细胞絮结，或将细胞嵌入微囊或高分子聚合物的网络中进行培养。该方法对贴壁依赖性细胞与非贴壁依赖性细胞均适用。

目前八十三页\总数一百零六页\编于四点844、动物细胞大规模培养技术

动物细胞大规模培养技术（large-scaleculturetechnique)是指在动物细胞生物反应器中大量地培养动物细胞以获得生物制品的技术。主要包括：微载体（microcarrier)培养技术中空纤维(hollowfiber)培养技术微囊化(micro-encapsulation)技术

目前八十四页\总数一百零六页\编于四点85（1）微载体培养技术微载体是指直径在60-250μm的微珠、能够适用于贴壁细胞生长，细胞贴壁于微载体上，微载体(和细胞)悬浮于培养基中，细胞在微载体表面逐渐生长成单层。优点：是表面积与体积比大、可搅拌、便于显微观察、占用空间小、易放大；具有单层培养和悬浮培养的特点；缺点：是培养液用量大。玻璃微珠目前八十五页\总数一百零六页\编于四点86微载体的主要特性微载体的大小：通常直径在100-200微米之间。微载体的密度：在慢速（40-50rpm)搅拌下，一般为1.03-1.05g/cm3微载体的表面电荷：表面电荷密度应适中，太低不利于细胞贴附；太高则有细胞毒性。目前八十六页\总数一百零六页\编于四点87微载体的种类以交连葡聚糖为基质的微载体：DEAE-交连葡聚糖微载体、cytodex2微载体、dormacell微载体、cytodex3微载体等。以塑料为基质的微载体：聚苯乙烯微载体、聚苯烯酰胺微载体。明胶(gelatin)微载体以玻璃为基质的微载体以纤维素为基质的微载体（DE-52、DE-53）液膜微载体（形成聚赖氨酸微液珠）大孔微载体（载体内部有大孔互相连通）目前八十七页\总数一百零六页\编于四点88（2）中空纤维培养技术中空纤维培养技术由Knazek于1972年研制成功。空心纤维的材料是聚砜或聚丙烯等高分子物质。纤维壁为半透膜。数百或数千条纤维捆成一束并集中开口，培养液从管腔流过，细胞贴附在纤维外壁生长。目前八十八页\总数一百零六页\编于四点89（3）微囊化技术微囊化培养由Lim等于1981年提出，其原理是采用一层亲水性的半透膜将细胞包围在珠状的微囊内，因而降低了培养液对细胞的剪切力，培养密度高。目前采用最多的是多聚赖氨酸/海藻酸法（PLL/ALG法），通过氯化钙成囊，再用柠檬酸液化。缺点：成囊技术较难，成功率约50%。目前八十九页\总数一百零六页\编于四点90（4）动物细胞培养生物反应器（Bioreactor)气升式生物反应器；搅拌式生物反应器；中空纤维管式生物反应器；流化床式生物反应器；固定床式生物反应器。

气升式生物反应器目前九十页\总数一百零六页\编于四点91流化床式生物反应器目前九十一页\总数一百零六页\编于四点第四节、培养细胞的污染问题及检测

细胞培养的污染问题十分重要，一旦发生污染，将导致前功尽弃。所以细胞培养一定要建立无菌观念。遇到培养污染要分析原因，及时处理。目前九十二页\总数一百零六页\编于四点一、细胞污染的种类和判定

细胞培养中常见的污染物有细菌、酵母菌、真菌、支原体和病毒等。在出现以下情况时培养的细胞可能有污染：1、培养液的酸碱度发生异常的改变。2、培养液出现混浊。3、光镜观察到菌丝和颗粒。4、细胞出现死亡或增殖缓慢等。目前九十三页\总数一百零六页\编于四点二、污染物的检测

1、细菌和真菌污染的检测：

1）涂片染色镜检；

2）接种培养：Trypticase大豆肉汤、BHI、Thioglycocollate肉汤和血琼脂板适于广泛的细菌检测；Sabouraud肉汤、YM肉汤和营养肉汤适于检测真菌。检测到阳性结果后，应高压灭菌处理污染的培养物及其用具。目前九十四页\总数一百零六页\编于四点952、支原体检测:

支原体污染细胞后，能抑制细胞代谢和生长，改变核酸合成，影响细胞的抗原性，引起细胞染色体改变，干扰病毒的复制，以及具有类病毒作用。在培养细胞初期，由于支原体对细胞的繁殖影响较小而往往被忽略。目前九十五页\总数一百零六页\编于四点支原体检测方法和处理