病毒感染诊断与防治

病毒感染诊断与防治病毒感染诊断与防治第1页常见病毒学诊疗方法包含：病毒分离判定病毒血清学检验病毒蛋白和核酸检测第一节病毒感染诊疗病毒感染诊断与防治第2页一、标本采取与送检应注意以下标准：1.对本身带有杂菌(如咽拭子、粪便)或易受污染标本，要进行病毒分离培养时，应使用抗生素。2.因病毒在室温中易失去活性，标本应低温保留并尽快送检。3.血清学诊疗标本采取应在发病早期和病后2～3w内各取1份血清，方便对比双份血清抗体效价动态改变。病毒感染诊断与防治第3页二、病毒分离与判定(一)病毒分离1.动物接种是最原始病毒培养方法，依据病毒种类不一样，选择敏感动物及适宜接种部位，如嗜神经性病毒（狂犬病毒）可接种于小鼠脑内，痘病毒可接种于家兔角膜或皮内。

病毒感染诊断与防治第4页2.鸡胚培养鸡胚对各种病毒敏感。普通采取孵化9～14天鸡胚，依据病毒种类不一样，将病毒标本接种于鸡胚不一样部位，最常见鸡胚接种部位有：羊膜腔、尿囊腔、绒毛尿囊膜和卵黄囊等。病毒感染诊断与防治第5页病毒感染诊断与防治第6页病毒感染诊断与防治第7页3.组织培养法(tissueculture)或细胞培养(cellculture)法是将离体活组织块或分散组织细胞加以培养技术总称，为病毒分离判定中最常见基础方法。病毒感染诊断与防治第8页病毒感染诊断与防治第9页

细胞改变有些病毒在细胞内增殖时可引发特有细胞病变，称为细胞病变效应(CPE)。常见改变有细胞变圆、聚集、坏死、溶解或脱落等。有些病毒如麻疹病毒、CMV、RSV等作用于细胞膜，可使邻近细胞相互融合，形成多核巨细胞或称融合细胞。有些病毒(如狂犬病病毒、麻疹病毒等)可在培养细胞中形成胞浆或核内包涵体。病毒在培养细胞中增殖指标病毒感染诊断与防治第10页病毒感染诊断与防治第11页病毒培养时出现CPE病毒感染诊断与防治第12页2.红细胞吸附(hemadsorption,HAd)流感或副流感病毒等感染细胞后，因为细胞膜上出现了血凝素(haemagglutinin,HA)，含有吸附脊椎动物(豚鼠、鸡、猴等)红细胞能力，这一现象称红细胞吸附，常见来测定含有HA粘病毒与副粘病毒增殖。若有对应抗血清，则能中和细胞膜上HA，HAd不再发生，称红细胞吸附抑制试验。病毒感染诊断与防治第13页3.干扰现象(interference)一些病毒感染细胞时不出现CPE或其它易于测出改变(如HAd)，但能干扰在其后感染另一病毒增殖。如风疹病毒感染Vero细胞时CPE不显著，但它能干扰后感染埃可病毒(ECHOV)增殖，从而阻抑后者所特有CPE。病毒感染诊断与防治第14页4.细胞代谢改变病毒感染细胞结果可使培养液pH值改变，说明细胞代谢在病毒感染后发生了改变。这种培养环境生化改变也可作为判断病毒增殖指标。病毒感染诊断与防治第15页(二)病毒数量与感染性测定

1.蚀斑测定是一个检验和准确滴定病毒感染性方法。将稀释病毒悬液加入单层细胞培养瓶中。病毒吸附后，再覆盖一层融化半固体营养琼脂，使病毒在单层细胞培养中有限扩散。结果是每一个有感染性病毒在单层细胞中可产生一个不足感染灶。用活性染料(如中性红)染色，则活细胞着色，受病毒感染而破坏细胞不着色，形成肉眼可见蚀斑(plaque)。每个蚀斑是由一个感染性病毒颗粒形成，称作蚀斑形成单位(plaqueformingunit,PFU)。病毒悬液中感染性病毒量滴度可用PFU／ml表示。病毒感染诊断与防治第16页2.50%组织细胞感染量(TCID50)测定法该方法是测定病毒能使50%组织培养细胞发生感染最小量。普通是将病毒悬液作10倍系列稀释，分别接种细胞，经一定时间后观察CPE、血细胞吸附等指标，以最高稀释度能感染50%细胞量为终点。最终用统计方法计算出50%组织细胞感染量（50%tissuecultureinfectiousdose,TCID50)。病毒感染诊断与防治第17页三、病毒感染血清学诊疗原理是用已知病毒抗原来检测病人血清中有没有对应抗体，故须待病人感染后体内产生抗体时才能检出。另外，在采取临床标本及病人血清应注意病程，必须采取患者急性期血清与恢复期血清(双份血清)进行血清学试验。若第2次血清抗体滴度比第1次高出4倍以上时，才有诊疗意义。病毒感染诊断与防治第18页1.中和试验(neutralizingtest,NTtest)

是病毒在活体内或细胞培养中被特异性抗体中和而失去感染性一个试验。中和抗体(netralizingantibodies,NTAb)是作用于病毒表面抗原(衣壳或包膜)抗体，同种不一样型病毒间普通无交叉，特异性高，而且抗体在体内维持时间长。中和抗体阳性不一定表示正在感染中，也可能因以前有过隐性感染所致。所以，中和试验适合用于人群免疫情况调查，在临床诊疗上较少使用。病毒感染诊断与防治第19页2.补体结合试验

(complementfixationtest,CFtest)用已知病毒可溶性(CF)抗原来检测病人血清中对应(CF)抗体。CF抗原是病毒内部抗原，同种异型间常有交叉，故特异性较中和试验低。但CF抗体出现较早，消失较快，故CF阳性可作为近期感染指标。病毒感染诊断与防治第20页3.血凝抑制试验(hemagglutinatiainhibitiontest,HItest)

含有HA病毒能凝集鸡、豚鼠、人等红细胞，称血凝现象。这种现象能被对应抗体抑制，称HI试验。其原理是对应抗体与病毒结合后，阻抑了病毒表面HA与红细胞结合。本试验简易、经济，特异性高，常见于粘病毒及乙型脑炎病毒感染辅助诊疗及流行病学调查，也可判定病毒型与亚型。病毒感染诊断与防治第21页病毒+鸡RBC=凝集（血凝试验）病毒+特异性抗体+鸡RBC=不凝集（血凝抑制试验）病毒感染诊断与防治第22页四、病毒感染快速诊疗

快速诊疗主要是指从含有病毒标本及感染机体血清中检测病毒颗粒、蛋白抗原、IgM抗体和核酸等，往往在数小时内即可得出结果。病毒感染诊断与防治第23页(一)形态学检验1.电镜和免疫电镜检验2.普通光学显微镜检验有些病毒在宿主细胞内增殖后，在细胞一定部位(胞核、胞浆或二者兼有)出现一个或数个、圆形或椭圆形、嗜酸性或嗜碱性结构，即包涵体。包涵体对病毒感染诊疗有一定价值。病毒感染诊断与防治第24页(二)病毒蛋白抗原检验

用荧光素、放射性同位素、过氧化物酶等标识抗体，采取免疫学和分子生物学技术，检测标本中病毒蛋白抗原，含有敏感、特异、快速等优点。1.免疫荧光技术(immunofluorescence,IF)2.固相放射免疫测定(solid-phaseradioimmunoassay,SPRIA)3.酶免疫技术(enzymeimmunoassay,EIA)此法可检测各种病毒及其抗体，主要是酶免疫组化法和酶联免疫吸附试验法(ELISA)。病毒感染诊断与防治第25页(三)特异性IgM抗体检测

检测病毒特异性IgM抗体可诊疗急性感染，尤其是对证实孕妇感染风疹病毒尤为主要，但应注意类风湿因子(IgM)干扰。另外，检测早期抗原抗体是快速诊疗另一路径。如检测针对EBV早期抗原(EA)、关键抗原(EANA)和衣壳抗原(VCA)等抗体，能够区分急性或慢性EBV感染。另外，分子生物学检测技术、气相色谱技术等，均可用来分析和判定病毒感染。病毒感染诊断与防治第26页(四)检测病毒核酸

1.核酸杂交技术用于病毒检测有斑点杂交、细胞内原位杂交、DNA印迹杂交、RNA印迹杂交等。2.核酸扩增法当前多数病毒基因已经过分子克隆技术被明确了核苷酸序列，使得DNA扩增技术逐步发展为常规诊疗技术之一。3.基因芯片技术病毒感染诊断与防治第27页基因芯片又称DNA芯片、生物芯片（biochip）。其原理是：将已知生物分子探针或基因探针，大规模或有序排布于小块硅片等载体上，与待测样品中生物分子或基因序列相互作用和并行反应，在激光激发下，产生荧光谱信号被接收器搜集，计算机自动分析处理数据并汇报结果。其优点是：能够一次性完成大量样品DNA序列检测和分析，处理了传统核酸杂交技术许多不足。芯片技术在病毒等微生物学诊疗和流行病学调查方面有着辽阔应用前景。病毒感染诊断与防治第28页第二节病毒感染预防一、人工自动免疫(一)活疫苗(attenuatedvaccine,orlivingvaccine)1.常规活疫苗即减毒活疫苗(attenuatedvaccine)，通常是用自然或人工选择法(如温度敏感株)筛选对人低毒或无毒变异株制成疫苗，如脊髓灰质炎、流感、麻疹减毒活疫苗等。病毒感染诊断与防治第29页2.新型活疫苗应用基因工程技术，控制病毒变异，或利用DNA重组技术，插入和定向缺失病毒基因，将保护性病毒蛋白编码基因插入活载体中或选择性地去除病毒某一个或几个致病基因而到达减毒作用制备可在机体内增殖，诱发抗病毒免疫应答疫苗。病毒感染诊断与防治第30页(二)死疫苗(killedvaccine)1.灭活全病毒疫苗应用物理或化学方法使病毒完全灭活而制成疫苗。常见有乙型脑炎、狂犬病、流感等灭活疫苗。2.亚单位疫苗(subunitvaccine)制备不含有病毒核酸、仅含有能诱发中和抗体病毒衣壳蛋白或包膜表面抗原，是最理想疫苗。3.合成肽病毒疫苗(synthesizedpeptideviralvaccine)人工合成与病毒保护性抗原决定簇氨基酸序列相同肽段，制备成免疫原后免疫动物或人体，使机体产生保护性抗体病毒感染诊断与防治第31页4.基因工程疫苗(geneengineringvaccine)利用基因工程技术，分离、重组、转化和表示基因，制备出能引发人体保护性免疫应答疫苗。5.DNA疫苗又称基因疫苗或核酸疫苗，这种核酸分子是一个细菌质粒，在克隆了特异性基因以后，能在真核细胞中表示蛋白质抗原，刺激机体产生特异性体液和细胞免疫。6.新型多价联合疫苗、口服疫苗研究病毒感染诊断与防治第32页减毒活疫苗与死疫苗优缺点比较特点减毒活疫苗死疫苗制备方法经过非正常培养减毒株经过化学物理方法使感染失活免疫接种普通为一次性屡次免疫疫苗稳定性相对不稳定相对稳定免疫类型体液免疫和细胞免疫体液免疫毒力回升有可能不可能安全性对免疫缺点者有危险安全性好生产和成本生产较复杂、成本高生产简单、成本低病毒感染诊断与防治第33页二、人工被动免疫人工被动免疫制剂有免疫血清和丙种球蛋白，或与细胞免疫相关因子等。大多数人均受过不一样种类病毒感染，从正常血清中提取免疫球蛋白可用于紧急预防。常注射人免疫球蛋白预防甲型肝炎、麻疹、脊髓灰质炎等。可使接触病原者不出现症状或仅出现轻微症状。多年来有些人应用含有高滴度抗HBs乙肝免疫球蛋白Ig)预防乙型肝炎有一定效果。在使用免疫球蛋白时因其半衰期短，故应注意使用期。病毒感染诊断与防治第34页第三节病毒感染治疗一、抗病化学制剂（一）核苷类药品核苷类药品作用机制有主要是抑制病毒基因复制①模拟核苷成份掺入病毒基因组：合成异常嘧啶取代病毒DNA前体胸腺嘧啶，病毒在复制过程中，这种异常嘧啶分子掺入子代DNA中使子代病毒结构基因合成和表示无法进行，从而抑制病毒复制，或复制出病毒为缺点病毒。②竞争病毒复制酶病毒感染诊断与防治第35页1.无环鸟苷(acyclovir,ACV，阿昔洛韦)和丙氧鸟苷（ganciclovirGCV，庚昔洛韦）为鸟嘌呤或脱氧鸟嘌呤核苷类似物。该药细胞毒性很小，是当前最有效抗疱疹病毒药品之一。广泛用于疱疹病毒感染引发单纯疱疹、生殖器疱疹及带状疱疹。病毒感染诊断与防治第36页2.叠氮胸苷(azidothymidine,AZT)胸腺嘧啶核苷类似物，经过阻断前病毒DNA合成而抑制HIV复制，AZT对病毒逆转录酶抑制比对细胞DNA多聚酶敏感100倍以上。能够有效地降低AIDS发病率与病死率。耐药株出现系由基因突变造成逆转录酶含有耐药性。因有抑制骨髓作用和形成病毒耐药而面临被淘汰。病毒感染诊断与防治第37页3.病毒唑对各种RNA和DNA病毒复制都有抑制作用，但主要用于RNA病毒感染治疗，对细胞核酸也有抑制作用。当前临床主要用于流感病毒和呼吸道合胞病毒治疗。病毒感染诊断与防治第38页（二）病毒基因转录抑制剂这类核苷衍生物模拟天然二脱氧核苷底物，经一系列磷酸化成为5’-三磷酸后，作为相同底物竞争性抑制病毒逆转录酶活性。被磷酸化药品分子与核苷酸分子相同，在RNA模板合成DNA过程中被嵌入DNA中。此DNA再转录时，因为其中药品分子不是正常核苷酸，因而转录酶不能识别，从而使转录受阻。病毒感染诊断与防治第39页（三）非核苷类逆转录酶抑制剂①nevirapine第1个新合成非核苷类逆转录酶抑制剂。1996年获准用于治疗HIV，耐药株已出现，故提议与其它药联合使用；②pyridone作用类似nevirapine.病毒感染诊断与防治第40页（四）蛋白酶抑制剂1．赛科纳瓦(saquinavir)1995年同意第1个蛋白酶抑制剂。2．英迪纳瓦（indinavir）、瑞托纳瓦（ritonavir）是1996年同意新一代蛋白酶抑制剂，用于HIV。病毒感染诊断与防治第41页（五）其它抗病毒药品1.金刚烷胺和甲基金刚烷胺金刚烷胺为合成胺类，甲基金刚烷胺是其衍生物，二者有相同抗病毒谱和副作用，能阻止脱壳，主要用于治疗甲型流感。2.甲酸磷霉素无机焦磷酸盐有机类似物，抑制各种疱疹病毒，包含CMV、HSV、VZV、EBV、HHV6，可能还对HBV和逆转录病毒有作用。选择性抑制病毒DNA多聚酶和逆转录酶，而对宿主细胞无影响。病毒感染诊断与防治第42页二、干扰素和干扰素诱生剂应用1.干扰素(IFN)含有广谱抗病毒作用，毒性小，使用同种IFN无抗原性，主要用于甲、乙、丙型肝炎，HSV，乳头瘤病毒和鼻病毒等感染