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文档简介
分子生物学实验当你翻开书本的时候,你必须尽可能地展开想象的“翅膀”,否则,你就不能走在别人的前面;而当你进入实验室时,要象脱下你的外衣那样脱下你的想象力,因为实验操作中不能有一丁点儿的想象,否则,你对事物的观察就会受到影响。实验相关知识1、实验准备:2、实验室安全与卫生3、分组与实验操作4、实验报告与成绩评定移液器的使用实验一、质粒DNA的提取纯化实验目的:学习与掌握最常用的质粒DNA的提取与纯化方法实验原理:碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。DNA是具有一定结构的物质,一些特殊的环境会导致DNA变性,如加热、极端PH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等,而适宜的环境又可以使DNA复性SDS是一种阴离子表面活性剂,即可使细菌裂解,又可使蛋白变性,因此用SDS处理细菌会导致细菌细胞壁的破裂,从而使质粒DNA和基因组DNA同时从细胞中释放出来。释放出的DNA在强碱的作用下发生变性,再用酸性醋酸钾(KAc)缓冲液中和,质粒DNA迅速复性,而基因组DNA分子量太大不能复性。离心后,质粒DNA在上清中,而基因组DNA与细胞碎片一起沉淀至离心管底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来操作步骤
在50毫升的LB培养基中加入50微升氨苄青霉素(终浓度50微克/毫升),接入含PUC19的大肠杆菌,37度过夜培养。取1ml培养物入微量离心管中,室温离心12000转×30s,弃上清,将离心管倒置,使液体尽可能流尽,将10毫升菌体收集在1个小指管中。将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中,剧烈振荡,使菌体分散混匀。加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ,颠倒数次混匀(不要剧烈振荡),并将离心管放置于冰上2-3min,使细胞膜裂解(溶液Ⅱ为裂解液,故离心管中菌液逐渐变清)。加入150μl预冷的溶液Ⅲ,将管温和颠倒数次混匀,见白色絮状沉淀,可在冰上放置15min。12000转,10分钟,将上清移到另一个小指管中。(溶液Ⅲ为中和溶液,此时质粒DNA复性,染色体和蛋白质不可逆变性,形成不可溶复合物,同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。)加入等体积的酚/氯仿/异戊醇,振荡混匀,离心12000转×10min,将上清移到另一个小指管中。加入等体积的氯仿/异戊醇,振荡混匀,离心12000转×10min,将上清移到另一个小指管中。加入2倍体积预冷的无水乙醇,旋涡混匀,-20℃放置30min,离心12000转×10min,去上清。1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀2次(每次离心12000转×5min),弃上清,将沉淀在室温下晾干。沉淀溶于20μlTE缓冲液(超纯水),-20℃保存备用。
实验二、质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳
实验目的:学习水平式琼脂糖凝胶电泳,检测DNA的构型
实验原理:闭合环状质粒、线性质粒和开环质粒DNA由于构形不同,在加溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳上呈现不同的迁移率,因而在紫外灯下观察,能区别闭合环状质粒DNA、线性质粒DNA和开环质粒DNA。实验方法
选择合适的水平式电泳槽,调节电泳槽平面至水平。选择孔径大小合适的点样梳子,垂直架在电泳胶模的一端,使点样梳子底部离电泳胶模底部的距离为1.0mm。制备1%琼脂糖凝胶。
(0.2克琼脂糖,加20毫升0.5倍的TBE)将电泳胶模四周密封好,防止浇灌琼脂糖凝胶板时发生渗透。待琼脂糖凝胶冷却至60℃左右时,加入一滴溴化乙锭,摇匀,轻轻倒入电泳胶模中,琼脂糖凝胶的厚度在3~5mm。倒胶时要避免产生气泡,若有气泡可用吸管小心吸去。琼脂糖凝胶凝固后,在室温放置20分钟,小心拔掉点样梳子和电泳胶模两端的挡板,保持点样孔的完好。将电泳胶模放入电泳槽中,加入电泳缓冲液,使电泳缓冲液面高出琼脂糖凝胶表面1~2mm。如点样孔内有气泡,用吸管小心吸出,以免影响加样。将DNA样品与1/5体积的溴酚蓝指示剂点样缓冲液混合。用微量移液器将样品小心加入加样孔内,记录样品点样秩序。
盖上电泳槽,开启电源开关,最高电压不超过5V/cm(
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