海洋病毒专题知识讲座

海洋病毒专题知识讲座海洋病毒专题知识讲座第1页传统海洋病毒学海洋病原体学海洋食物链动力学这两个领域支配着全球地球化学循环和宿主进化，而且含有主要经济和环境保护潜在价值。海洋病毒专题知识讲座第2页海洋病毒荧光染色(SYBRGreenIstain25)(1998.5.加利福利亚SantaCatalina岛附近5m海水)星云?自Fuhrman,J.Nature.1999,399:541～548海洋病毒专题知识讲座第3页一、海洋病毒介绍海洋病毒:是海洋环境中土著性、超显微、仅含有一个类型核酸DNA或RNA、专性活细胞内寄生非细胞形态一类微生物。能够经过细菌滤器，在活细胞外含有普通化学大分子特征，进入宿主细胞又含有生命特征。海洋病毒各种多样，含有形态多样性和遗传多样性。海水中病毒分布，展现近岸高，远岸低特点。海洋病毒专题知识讲座第4页1、海洋生物多样性哺乳类鱼类无脊椎动物原生动物高等植物大型藻类浮游藻类蓝细菌真菌细菌病毒因为技术原因，大家往往低估了病毒在水体中丰度，因而忽略了它们在水环境中作用海洋病毒专题知识讲座第5页2、海洋病毒生态海洋中最普通生物群体丰度在107—109个/ml(细菌丰度5—25倍)几乎对全部海洋生物都有影响，是海洋生物化学循环中最大一环5%—40%海洋生物被病毒销毁近30％海洋蓝藻和60％游离异养菌死亡与病毒相关地球26%碳循环经海洋病毒完成。海洋病毒专题知识讲座第6页各种海洋生物丰度海洋病毒专题知识讲座第7页3、海洋中病毒种类噬菌体藻类病毒(噬藻体)浮游动物病毒无脊椎动物病毒脊椎动物病毒陆源生物病毒非感染性粒子大小在20nm一350nm之间海洋病毒专题知识讲座第8页４、海洋病毒存在方式游离浮游吸附于无机或有机颗粒海洋生物非感染性携带海洋生物急性或慢性感染海洋生物溶源性感染海洋病毒专题知识讲座第9页海水中噬菌体

A,B:Myoviridae

C,D,E:Siphoviridae

F:Podoviridae.Bar

=

100

nm.

(自ProctorLM.1997.MicroscResTech.37(2):136～161)

细菌丰度与病毒丰度相关性到达

67%

海洋病毒专题知识讲座第10页藻类病毒已在40多个类群真核藻类中发觉了病毒或VLPs，它们分布于已知14个纲中11个纲。(vanEtten,1991)VLPs致死作用是调整藻类种群结构、生物量和生产力主要因子。(Bratbak,1993)病毒丰度与海水中叶绿素a含量及细菌数量有很好相关性海洋病毒专题知识讲座第11页５、海洋病毒生态海洋各种生物有机会充分接触，有利于病毒传输及变异，使海洋系统成为极富多样性原始病毒库。海洋病毒丰度随海洋生态改变而动态改变，藻类及细菌大量繁殖时，病毒丰度升高。研究赤潮发生前后,水体中藻细胞死亡率与病毒样颗粒(VLPs)数量变动关系,认识到VLPs致死作用是调整藻类种群结构、生物量和生产力主要因子。上层海水病毒数量较大，随深度增加丰度降低，靠近海底又回升。海洋病毒专题知识讲座第12页６、海洋病毒生态效应感染藻类，影响海洋物质和能量流开启泵；感染海洋细菌，影响海洋有机质循环链；感染浮游生物，影响海洋经济动物和高等动物食物链；感染海洋动物，影响海洋动物生态多样性。海洋生态系统种群结构、生物量和生产力主要调整原因，使系统内物质循环和能量流动愈加多样化。影响许多生物地球化学过程和生态学过程：营养物循环、离子分布和沉积率、物种多样性和分布、基因传递、赤潮调控、全球变暖等。其生态效应之广，其它任何物种均望尘莫及海洋病毒专题知识讲座第13页异养微生物细胞碎片病毒溶解有机物无机营养物食植动物初级生产力浮游生物病毒生态环输出自Fuhrman,J.Nature.1999,399:541～548浮游生物病毒生态环海洋病毒专题知识讲座第14页（１）病毒影响光合作用人工试验表明,在海水中只要将2—200nm大小病毒组份增加20%,就能使光合作用效率降低达50%。(Suttleetal,1990,Nature,387,467–469).海洋生物能量流、CO2循环(藻类和微生物)、全球气候改变(甲硫醚,DMS和DMSP)。海洋病毒专题知识讲座第15页（２）病毒在海洋生物间基因转移噬菌体介导基因转导转导率在1.58

×

10-8—3.7

×

10-8/PFU佛罗里达TampaBay河口每年发生

1.3

×

1014次转导事件!病毒介导海洋生物间基因转导是海洋生态中最主要基因水平转移机制。(自Jiang&Paul,App.Envir.Microbiol.,1998,64,8:2780-2787.)海洋病毒专题知识讲座第16页海洋病毒这种能力动摇了咱们对微观世界认识。海洋病毒编码宿主基因：病毒感染能够增加宿主新陈代谢、免疫力、分布范围和进化能力参加光合作用，如蓝藻病毒携带有光合作用基因海洋病毒介导共生菌或益生菌变为病原菌，如霍乱弧菌海洋病毒专题知识讲座第17页海洋病毒多样性研究存在巨大困难难于培养缺乏普遍病毒基因标签宏基因组学应用于海洋病毒多样性研究，已经表明100L海水（5000），1千克沉积物中（100万）病毒各个种类是在全球分布，但每一类病毒相对丰都受当地环境限制。海洋病毒专题知识讲座第18页二、海洋生物疾病病毒生态１、经济海洋生物病毒传输特征已经发觉100各种,其中鱼类16(10),甲壳类8种食物链伴随传输:病毒多宿主感染、人工饲料循环、种类蚕食水介导传输:群集状态(人工养殖、野生群集)、病毒携带(物理富集、生物富集)垂直传输:溶源感染海洋病毒专题知识讲座第19页２、病毒与海水养殖容纳量病毒各种宿主丰度变动游离病毒丰度变动病毒存活时间病毒传输空间原因变动宿主敏感性改变海洋病毒专题知识讲座第20页三、变异与新病毒发生海量病毒库容紫外线和其它理化原因诱变遗传物质交换复杂生态系统中宿主交替筛选大时空系统海洋生物容量预测海洋病毒专题知识讲座第21页四、海洋病毒综合利用赤潮治理有害细菌控制有害病原竞争性防治功效基因资源开发新基因操作载体新生态学技术海洋病毒专题知识讲座第22页五、海洋病毒生态学关键技术1、病毒分离浓缩和形态学判定技术（1）吸附洗脱方法：膜吸附过滤、盐沉淀、吸附剂吸附等是常见方法。膜吸附过滤-洗脱法被认为是比很好病毒浓缩技术。（2）基于病毒物理学特征：超速离心或透析2、病毒分子生物学判定主要有两种检测方法:(1)核酸杂交检测病毒核酸,利用核酸探针、基因芯片检测病毒核酸。(2)聚合酶链式反应(PCR)检测病毒核酸。主要有两种基因分析方法：(1)对病毒核酸克隆或PCR产物做限制性酶切片段长度多态性分析(RFLP)。(2)克隆或PCR产物核酸序列分析,产物直接做核酸序列测定,与已公布序列作比对,分析核酸基因型和基因多态性。海洋病毒专题知识讲座第23页3、病毒定量测定在海洋病毒定量研究方面,主要有噬菌斑计数法(PFU)、透射电镜技术(TEM)、表面荧光显微技术(EIPFM)和流式细胞计数仪计数(FCM)等方法。海洋病毒专题知识讲座第24页六、研究需求与展望重点海区病毒分布、丰度、种类病毒分离物资源库和病毒基因库海洋病毒选择性生态分析技术海洋病毒基因芯片分析技术动态病毒资源数据库病毒与各种海洋生物相互作用关系海洋生态和养殖生物疾病动态预报治理赤潮与海洋污染海洋生物多样性与生态平衡调整近期远期海洋病毒专题知识讲座第25页7研究实例1淋巴囊肿病淋巴囊肿病(Lymphocystisdisease,LCD)

是由虹彩病毒科淋巴囊肿病毒属病毒感染而致一个病毒病。该病侵染宿主范围广，已知最少42科125种以上鱼可被该病毒感染。淋巴囊肿病是发觉最早鱼类病毒性疾病之一，鲈形目、鲽形目和钝形目中一些种类都可感染。鲈鱼、真鲷、红斑笛鲷、石斑鱼、牙鲆、大菱鲆和东方纯等都曾发觉过。

1998年,该病在我国北方养殖牙鲆中大规模暴发，给养殖者造成了严重经济损失。海洋病毒专题知识讲座第26页被淋巴囊肿病毒感染、并表现经典病症牙鲆。海洋病毒专题知识讲座第27页图１

示体表、鳍小疱状肿胀物

图２示鳍膜上肿状物

海洋病毒专题知识讲座第28页被淋巴囊肿病毒感染、并表现经典病症鲈鱼。

海洋病毒专题知识讲座第29页7.1淋巴囊肿病介绍淋巴囊肿病是1874年发觉，当初认为是原虫引发。1962年发觉病毒粒子，1966年从鱼类成纤维细胞中分离出病原性病毒而得到证实。该病毒是网箱或工厂化养鱼常见病，主要见于1龄鱼类，体长20-30cm，体重100-160g。病原:淋巴囊肿病毒粒子为正二十面体，大者200-250nm，小130-150nm。可引发细胞病变，产生细胞质包涵体。海洋病毒专题知识讲座第30页7.2淋巴囊肿病组织学特征牙鲆淋巴囊肿病毒中国分离株(lymphocystisdiseasevirusisolatedfromChina,LCDV-C)体外感染显微图片。显示LCDV-C可在草鱼细胞(GCO)中增殖，并形成病变斑。(A)正常GCO对照细胞。(B)LCDV-C接种1天后，GCO细胞改变。

©LCDV-C接种了3天后，在单层GCO细胞中形成病变斑。

海洋病毒专题知识讲座第31页7.3淋巴囊肿病细胞学特征LCDV-C感染GCO细胞电镜照片。(A)显示细胞中染色体固缩、形成空泡。(B)主要显示核碎裂。

海洋病毒专题知识讲座第32页LCDV-C在GCO细胞中引发病变显微照片。A、C、E为正常对照细胞；A、B由Giemsa染色(100)，C、D、E和F由Hoechest33258染色(200)；A、B、C、D为普通光镜观察，E、F为荧光显微镜观察。

海洋病毒专题知识讲座第33页7.4淋巴囊肿病病状和诊疗病理学特征:在鱼体表和鳍上出现大小不一、呈白色、灰色、粉红色乳头状肿瘤状物，这些肿胀物有各个分散，也有聚集成团或联成片，严重患者密布于全身皮肤。囊肿细胞大小普通为0.1-0.5毫米，大者可达1毫米以上。除发生在鱼体表外，鳃、咽喉、肠壁、肠系膜、肝、脾、卵巢等器官上也可能出现。除引发鱼外行难看外，还可造成鱼免疫能力下降。肿瘤破裂时形成溃疡面，引发寄生虫、细菌等继发性感染。病症较轻时，可自愈，2龄以上鱼感染此病概率小。临诊:依据外观病状进行诊疗和抗原-抗体反应。海洋病毒专题知识讲座第34页7.5流行情况

此病在10月至翌年5月，水温10—25摄氏度时为流行高峰期，在我国整年均可发生。网箱养殖感染率可达60％以上，池塘为20％—27％。此病在2龄以上鱼，普通不引发死亡，但鱼体较瘦，外表难看，失去商品价值；有病鱼囊肿可脱落自愈。对1龄幼鱼可引发死亡，发病后两个月内死亡率可达30％,甚至到80%

7.6防治方法:（1）人工繁殖用亲鱼应严格检疫，确保为无病毒感染健康鱼；不购置带有淋巴囊肿病毒病症苗种鱼进行养殖。

（2）对发病养殖网箱或鱼池实施隔离，捞除病鱼并销毁；泼洒消毒剂和投喂抗菌药饵，预防继发性感染。

海洋病毒专题知识讲座第35页海洋病毒专题知识讲座第36页7.7当前研究内容快速监测：以利于选择无病毒亲鱼可利用各种细胞系来培养病毒，方便进行研究，或制作弱毒或无毒疫苗研究抗体结构，怎样提升其免疫能力。研究防治：对感染病鱼怎样进行治疗。海洋病毒专题知识讲座第37页8研究实例2对虾白斑病毒8.1发病前养殖概况1987年，中国科学院海洋研究所进行对虾高密度养殖试验，能够到达1.98千克/平方米，然后深入研究，2.72千克/平方米，最好2.93千克/平方米。大田也在800-900斤，现在是10-20斤。1993、1994年对虾养殖产量为3万吨和3.5万吨，1991、1992是世界首位，为14.5和14万吨。海洋病毒专题知识讲座第38页8.2对虾病毒种类20世纪60年代首次报道甲壳纲病毒，当前海洋甲壳类病毒有30各种，其中对虾病毒有17种左右。分属于7个病毒科。最近几年，日本、中国、泰国对虾病暴发。对虾杆状核病毒（RV-PJ）、系统外胚层和中胚层杆状病毒（SEMBV）、皮下及造血组织坏死杆状病毒（HHNBV）、中国对虾杆状病毒（PCBV）、白斑综合症相关杆状病毒（WSBV）。海洋病毒专题知识讲座第39页5种病毒引发对虾个体病状、组织病理学相同。主要感染对虾皮下组织、造血组织和结缔组织等。患病对虾头胸甲内表面都有肉眼可辨透明十分显著白斑，外胚层全部组织都受到感染；病虾肝胰腺肿大发白；感染细胞有经典核肿大，不形成核形多角体或颗粒类包涵体。肠上皮、真皮和鳃等病变细胞占到60-90%，造血组织细胞病变率在40-70%，有组织细胞核无病变现象。同属于杆状病毒科无包涵体型杆状病毒亚群。统称白斑综合症病毒（WSSV）海洋病毒专题知识讲座第40页1992年，在台湾北部日本对虾中暴发，2-7天累计死亡率为100%。1993年在斑节对虾中也发觉了白斑综合症，电镜下观察为无包涵体杆状病毒粒子。为dsDNA,用HindⅢ酶切，最少可取得22个片段。当前已经构建了WSBV基因组文库，建立了WSBVPCR诊疗方法，制备成WSBV特异核酸探针，用于WSBV斑点杂交和Sourthern杂交检测。海洋病毒专题知识讲座第41页7.3病