蛋白质沉淀技术

蛋白质沉淀技术第1页/共34页一、蛋白质的基本性质蛋白质是人体机能构成成分,人体任何器官和组织都是以蛋白质作为重要组成成分。鉴于蛋白质重要性研究蛋白质分离十分必要。第2页/共34页1、胶体性质蛋白质表面有一些亲水基团易起水合作用，从而形成水化层，导致蛋白质颗粒不易聚集沉淀，这些蛋白质分子直径在2～20nm范围，所以蛋白质溶液是亲水胶体，具有半通透性，丁达尔效应、布朗运动等一些亲水胶体性质①

。[1]杨丰科.系统有机化学[M].北京:化学工业出版社,2003·433一435.第3页/共34页2、两性解离和等电点蛋白质可解离基团包括末端α-氨基和末端α-羧基及可解离侧链R基。这些可解离基团在特定的PH范围内解离，产生带正电荷或者带负电荷的基团。当溶液PH使蛋白质所带正电荷与负电荷恰好相等，即蛋白质分子本身净电荷为零，此时PH即为该蛋白质分子等电点，用PI表示，测PI时一定在缓冲液中进行，因为离子强度可以使PI改变①。[1]杨丰科.系统有机化学[M].北京:化学工业出版社,2003·433一435.第4页/共34页两性解离和等电点第5页/共34页3、沉淀作用沉淀是指在溶液中加入沉淀剂使溶质溶解度降低，形成固相从溶液中析出从而达到分离的一种技术。沉淀分离方法和其他分离方法相比，优点是过程简单、成本低、原料易得，便于小批量生产，在产物浓度愈高的溶液中沉淀越有利、收率越高；缺点为过滤困难、产品质量较低，需重新精制。第6页/共34页4、变性作用天然蛋白质受物理或化学因素影响，蛋白质分子内部维系其高级结构原有氢键、盐键等次级键遭到破坏，使分子内部结构发生改变，导致其生物学性质、物理化学性质改变，这种现象称为蛋白质变性作用。第7页/共34页5、凝固作用变性蛋白质分子相互凝聚或相互穿插缠绕在一起的现象称为蛋白质凝固，例如生鸡蛋蛋白溶液受热变为蛋白块现象。第8页/共34页6、颜色反应蛋白质颜色反应实际上是氨基酸一些基团肽键等与一定试剂所产生化学反应。第9页/共34页二、蛋白质沉淀分离技术蛋白质胶粒上同性电荷互相排斥，不易凝聚成团下沉；蛋白质表面许多亲水基团水合作用形成一层水化膜,在胶粒之间起隔离作用，蛋白质在水溶液中,虽分子量很大,但仍能维持稳定溶解状态。若能除去其水化膜并中和其电荷,则蛋白质可从溶液中沉淀而出。常用有以下几种沉淀方法：第10页/共34页蛋白质沉淀分离常用方法1、盐析法2、有机溶剂沉淀法3、等电点沉淀法4、变性沉淀分离技术5、复合盐沉淀法第11页/共34页1、盐析法（中性盐沉淀）

一般来说,所有固体溶质都可在溶液中加入中性盐而沉淀析出,这一过程称之盐析②。（1）中性盐沉淀蛋白质的基本原理

a.高浓度盐离子使蛋白质表面双电层厚度降低，静电排斥作用减弱。

b.中性盐比蛋白质具更强的亲水性，因此将与蛋白质争夺水分子。[2]李冬梅,张锦茹,田园.蛋白质沉淀分离[J].粮食与油脂,2007·9一11第12页/共34页盐析法盐析机理示意图第13页/共34页盐析法（2）中性盐的选择原则a.要有较强的盐析效果。一般来说，阴离子影响盐析的效果比阳离子显著，且含高价阳离子的无机盐比含低价阳离子的无机盐效果好。b.要有足够大的溶解度，且溶解度受温度影响尽可能地小。便于获得高浓度的盐溶液，尤其是在低温时，不至于造成盐结晶的析出。c.不影响蛋白质等生物大分子的活性，并且，最好不引入给分离或测定带来麻烦的杂质。d.来源丰富，价格低廉。第14页/共34页盐析法

常用的中性盐有：(NH4)2SO4

，Na2SO4

，NaH2PO4等。其中最重要的是(NH4)2SO4。优点：①溶解度大；尤其是在低温时仍有相当高的溶解度②分离效果好；③有稳定蛋白质结构的作用，不易引起变性；④价格便宜；废液可以肥田，不污染环境。缺点：硫酸铵水解后变酸，在高pH值下会释放出氨，腐蚀性较强，因此，盐析后要将硫酸铵从产品中除去。第15页/共34页盐析法（3）影响盐析的因素a.蛋白质浓度一般较适当的样品浓度是2.5%-3.0%，通过实验确定。b.离子强度和类型一般来说,离子强度越大,蛋白质溶解度越低。下面为几种盐盐析能力排列次序:磷酸钾>硫酸钠>磷酸铵>柠檬酸钠>硫酸镁③[3]GelazkaVB,SmithDDS,LedwardDA,etal.Influenceofhighpressureonprotein-polysaccharideinteractions[J].Pros.Int.Conf,1998,24:397-400.第16页/共34页盐析法c.pH值

一般来说,蛋白质所带净电荷越多,溶解度越大；净电荷越少,溶解度越小,在等电点时蛋白质溶解度最小,为提高盐析效率,多将溶液pH值调到目的蛋白等电点处。d.温度在低离子强度或纯水中,蛋白质溶解度在一定范围内随温度增加而增加;但在高浓度下,蛋白质、酶和多肚类物质溶解度随温度上升而下降。在一般情况下,蛋白质对盐析温度无特殊要求,可在室温下进行,只有某些对温度较敏感酶要求在0℃～4℃进行。第17页/共34页盐析法（4）脱盐

常用的脱盐处理方法有：透析法、超滤及凝胶过滤法。透析最早应用的膜分离技术。第18页/共34页2、有机溶剂沉淀法（1）有机溶剂沉淀机理：降低水的介电常数,导致具有表面水层的生物大分子脱水,相互聚集,最后析出。该法优点在于：a.分辨能力比盐析法高,即蛋白质只在一个较窄有机溶剂浓度下沉淀;b.沉淀不用脱盐，过滤较为容易。其缺点是对具有生物活性大分子易引起变性失活,操作要求在低温下进行。总体来说,有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍②。[2]李冬梅,张锦茹,田园.蛋白质沉淀分离[J].粮食与油脂,2007·9一11第19页/共34页有机溶剂沉淀法(2)有机沉淀剂有机沉淀剂有乙醇、甲醇、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、异丙酮等,其中最常用的是乙醇和丙酮。蛋白质和酶的沉淀大多采用乙醇,由于甲醇、丙酮均有一定毒性,故使用时必须谨慎。第20页/共34页有机溶剂沉淀法(3)有机沉淀剂分离技术的影响因素温度低温，而且要保持温度的相对恒定。样品浓度蛋白质:0.5%-2%;黏多糖1%-2%pH保证待沉淀物稳定的前提下，接近等电点离子强度重要因素，一般以0.01mol/L-0.05mol/L为宜金属离子钙离子、锌离子等，可与呈阴离子状态的蛋白质形成复合物第21页/共34页有机溶剂沉淀法(4)应用实例应用实例有高粱蛋白质的提取,其基本工艺流程为:高梁粉→萃取→离心→沉淀→水洗→烘干[4][4]张伟敏,谭小蓉,钟耕.高粱蛋白质研究进展[J].粮食与油脂,2005(1):7-9.第22页/共34页3、等电点沉淀法（1）等电点沉淀法的原理等电点(pI)是两性物质在其质点的净电荷为零时介质的pH值,溶质净电荷为零，分子间排斥电位降低，吸引力增大，能相互聚集起来，沉淀析出，此时溶质的溶解度最低。第23页/共34页等电点沉淀法（2）等电点沉淀法的影响因素a.杂质种类的影响混合液中存在许多等电点相近的两性电解质，单独使用此法效果差。b.离子强度的影响蛋白质有盐溶和盐析两面性，等电点的数值随着溶液中中性盐离子的种类和浓度变化而变化，所以离子强度对等电点的沉淀作用影响较大。c.溶质表面极性的影响等电点沉淀法适合于疏水性较大的蛋白质（如酪蛋白），因其表面水化层相对较薄。而亲水性较强的蛋白质在等电点下不容易产生沉淀，这时需要结合其他方法一起使用。第24页/共34页等电点沉淀法(3)应用实例应用实例有大豆蛋白的碱提酸沉法,基本工艺流程为:豆粕原料→二次碱提→粗滤→酸沉→打浆→回调→改性→喷粉→成品[5][5]高孔荣,黄惠华,梁照为.食品分离技术[M].广州:华南理工大学出版社,1998:12-15.第25页/共34页4、变性沉淀分离技术（1）基本原理利用生物大分子物质对物理、化学等外部环境因子敏感性的差异而选择性地使一种组分发生变性形成沉淀,而另一些组分保持不变,从而达到分离、除杂和提纯的目的。第26页/共34页变性沉淀分离技术（2）变性沉淀分离的方法a.热变性沉淀分离:利用蛋白质热稳定性不同的特点,使蛋白质组分之间得以分离,同时使蛋白质与水及其他可溶物分离,此法常用于组织化植物蛋白的生产[6]。[6]张建云,邱坚,李正红,等.木豆叶蛋白提取工艺研究[J].西南林学院学报,2001,21(1):40-44.第27页/共34页变性沉淀分离技术b.选择性酸碱变性沉淀分离:利用酸碱变性原理,通过调节溶液pH值,可有选择地去除杂蛋白,常用于生化制备中[7]。c.利用酶进行变性分离:利用酶的催化作用使一些蛋白质变性,从而沉淀分离,如凝乳酶催化牛乳酪蛋白的沉淀。[7]刘芳,敖常伟.刺槐叶蛋白提取工艺条件的初步研究[J].中南林学院学报,1999,19(1):64-67.第28页/共34页变性沉淀分离技术d.利用表面活性剂或有机溶剂引起变性沉淀分离:

在制备核酸时,可加入含水酚、氯仿以及十二烷基磺酸钠等试剂,有选择地使蛋白质发生变性沉淀,达到去除杂质、提纯核酸的目的。第29页/共34页变性沉淀分离技术(3)影响蛋白质变性的因素a.温度。在较高温度作用下,蛋白质的二级、三级和四级结构的弱键断裂,破坏了肽链原来特有的排列和空间结构,使原来在大分子内部的极性基团转到分子表面,促进蛋白质分子相互凝集而沉淀,但温度过高又会使蛋白质发生变性。第30页/共34页变性沉淀分离技术b.pH值。大部分蛋白质在pH4～10的范围内是比较稳定的,超过这个范围强酸或强碱会使蛋白质分子内的基团带电性质发生变化,从而破坏静电引力所形成的键,使原来的构象发生变化,导致蛋白质变性c.其他化学因子。第31页/共34页5、盐复合物沉淀法a.金属复合盐法:许多有机物质包括蛋白质在内,在碱性溶液中带负电荷,能与金属离子形成沉淀。根据有机物与它们之间作用机制,可分为羧酸、胺及杂环等含氮化合物,如铜、锌、锅;亲羧酸疏含氮化合物类,如钙、镁、铅;亲硫氢基化合物类,如汞、银、铅等。蛋白质一金属离子复合物重要性质是对溶液介电常数非常敏感,调整水溶液介电常数(如加入有机溶剂),即可沉淀多种蛋白。第32页/共