菌种保藏的原理和方法

菌种保藏的原理和方法第1页/共16页第四章菌种保藏的原理和方法第2页/共16页提纲菌种保藏的目的和意义菌种保藏的原理和方法斜面保藏法和穿刺保藏法沙土管干燥保藏法真空冷冻干燥保藏法液氮保藏法菌种复壮种子扩大培养第3页/共16页菌种保藏的目的和意义目的意义：保持优良菌种优良性状的稳定，满足生产的实际需要。优良菌种丢失（退化）的原因：世代短、易变异、易污染、死亡。菌种保藏机构：世界现有700多家专门机构。措施：创造条件，使微生物处于休眠状态，减少变异。

低营养、低温、干燥、缺氧→低代谢、低生长第4页/共16页菌种保藏的原理和方法菌种保藏(Cultureconservation)原理挑选优良的菌种，最好是休眠体创造有利于种子休眠的环境（低温、干燥、缺氧、避光、缺少营养）菌种保藏方法斜面(Slant)低温保藏法 传代培养，六个月砂土管保藏法 适用范围广，两年冷冻干燥(Freez-drying)保藏法 长达十年液氮超低温保藏法（—130°C）

(Liquidnitrogenultra-lowtemperaturestorage)

第5页/共16页一、斜面保藏法和穿刺保藏法1.斜面保藏法：（短期，3-6个月）范围：细菌、放线菌、酵母、丝状真菌方法：适宜培养基→适温培养→冰箱保藏（4-5℃）→到期转种优点：设备、方法简单缺点：转代多，易变异；污染机会多第6页/共16页一、斜面保藏法和穿刺保藏法2.穿刺保藏法：（好气菌，6-12个月）方法：小试管或螺口管→1﹪琼脂培养基→接种针穿刺→培养→盖2-3mm无菌液体石蜡

→冰箱保藏范围：细菌、放线菌、丝状真菌优点：范围较广，简便实用缺点：不适用能利用石蜡为碳源的微生物；不同种类，保藏期差异较大。第7页/共16页二、沙土管干燥保藏法范围：产孢子的放线菌和丝状真菌，形成芽孢的细菌。方法：沙、土分别洗净→烘干、过筛（80-100目）→

1-2︰1沙土混合、装管1cm→121℃灭菌2-3次→无菌检验→烘干备用→孢子或悬液与沙土混匀→真空抽干→封口（熔封、石蜡封）→干燥器中于冰箱5℃保藏特点：设备简单，方法较繁，效果较好（长，2

年，有长达10年），但范围受限制。第8页/共16页三、真空冷冻干燥保藏法方法：

1.安瓶管处理：8-10×100-150mm，浸洗、烘干、盖口；灭菌、干燥（60℃）。

2.保护剂：减少冷冻干燥对微生物的损伤，常用脱脂牛奶、血清（适当方法灭菌）。

3.菌悬液制备：斜面→加保护剂→制悬液→吸入安管

4.冷冻干燥：快冷至-15--30℃，抽真空到66.661Pa，15

分钟内；达13.3322Pa，可升温至20-30℃；真空封口。

5.安瓶管保藏：4-5℃，5-10年。（样品含水量1-3％）第9页/共16页四、液氮保藏法方法：

①浓菌悬液→加保护剂→装安管0.2-1cm→封口

②降温（1℃/min）至-25℃，入液氮罐，-150—

-196℃保藏。③取出时，应于温水（38-40℃）中震荡1-2min。特点：

效果好（2-3年，长达9年），方法简单，保藏对象广泛。第10页/共16页五、菌种复壮原理与方法单细胞分离复壮改变培养条件复壮第11页/共16页六、种子扩大培养种子(Seed)扩大培养：

将保藏的生产菌种从斜面试管(Tubeslant)接出后，进行摇床(Shaker)培养及种子罐(Seedingtank)逐级培养以获得一定数量和质量的纯种的过程，纯种培养物称作种子。第12页/共16页六、种子扩大培养种子扩大培养的级数

二【三】级发酵：

斜面菌种->一级种子摇床培养->二级种子罐培养【->三级种子罐培养】->发酵罐生产影响级数的因素微生物自身的生长特性发酵罐的生产规模第13页/共16页六、种子扩大培养影响种子质量的主要因素培养基(Culturemedia)中的成分配比种龄(Cellage)与接种量(Inoculationconcentration)温度pH值通气(Ventilation)和搅拌(Stirring)泡沫(Foam)染菌(Infection)第14页/共16