响应面法优化深共熔溶剂提取烟碱的工艺

响应面法优化深共熔溶剂提取烟碱的工艺尚宪超;谭家能;杜咏梅;刘新民;张曼曼;张忠锋【摘要】为考察深共熔溶剂在烟碱绿色提取中的应用效果,以烤烟烟叶为提取原料,比较了不同种类的深共熔溶剂,并对影响烟碱得率的4个因素(深共熔溶剂含水率、提取时间、提取温度以及料液比)进行了单因素试验和响应面法工艺优化.结果表明:确定的最佳深共熔溶剂为氯化胆碱-尿素;优化后的工艺条件为氯化胆碱-尿素含水率32%(体积分数)，提取温度40乜提取时间30min,料液比10mg/mL•在优化的工艺条件下，烟碱理论得率为22.72mg/g,实测值22.89mg/g.以氯化胆碱-尿素作为深共熔溶剂提取烟叶中烟碱的方法是可行的,通过响应面法优化确定的工艺条件较可靠，可为烟碱的绿色提取提供方法参考.％Inordertodevelopagreennicotineextractionmethod,deepeutecticsolvents(DES)werestudiedusingflue-curedtobaccoleavesasextractionmaterials,andfourextractionfactors(moisturecontentinDES,extractiontime,extractiontemperatureandsolid/liquidratio)wereoptimizedviasingle-factorexperimentstoproducearesponsesurfacebasedonnicotineyields.Theresultsshowedthat:1)Theoptimumdeepeutecticsolventwascholinechloride-urea.2)TheoptimizedtreatmentconditionwasachievedwiththeDESmoisturecontentat32%(V/V),extractingfor30minutesat40°Cwiththesolid/liquidratioof10mg/mL.Thecalculatedextractionyieldofnicotinewas22.72mg/g,andthemeasuredyieldwas22.89mg/g.Insummary,theoptimizedextractionconditionisreliable,andcouldbeusedasareferenceforthegreenextractionofnicotineintobaccoleaves.期刊名称】《烟草科技》年(卷),期】2018(051)005【总页数】8页(P55-62)【关键词】深共熔溶剂;绿色提取;响应面;烟草;烟碱【作者】尚宪超;谭家能;杜咏梅;刘新民;张曼曼;张忠锋【作者单位】中国农业科学院烟草研究所,山东省青岛市崂山区科苑经4路11号266101;中国农业科学院研究生院,北京市海淀区中关村南大街12号100081;中国农业科学院烟草研究所,山东省青岛市崂山区科苑经4路11号266101;中国农业科学院烟草研究所,山东省青岛市崂山区科苑经4路11号266101;中国农业科学院烟草研究所,山东省青岛市崂山区科苑经4路11号266101;山东农业大学园艺科学与工程学院,山东省泰安市泰山区岱宗大街61号271018;中国农业科学院烟草研究所,山东省青岛市崂山区科苑经4路11号266101【正文语种】中文【中图分类】TS411.1烟碱(Nicotine)又名尼古丁，是烟叶中含量最多的生物碱［1］。烟碱分子具有旋光性，存在两个光学异构体，天然烟碱以左旋型(S型)存在。生物碱的生理活性与其旋光性密切相关，通常左旋体的生物活性显著，右旋体的生物活性较弱或无活性［2-3］。有研究表明，S型烟碱对昆虫的毒性大于右旋型(R型)烟碱［4］,另外，S型烟碱在治疗帕金森病、阿尔茨海默病等有良好效果，但R型烟碱未见有此类活性报道［5-9］。通过有机化学手段合成的烟碱分子以消旋体形式存在，无旋光性，其生物活性远低于天然烟碱［10］。因此，目前商品交易的烟碱仍以烟草中提取的烟碱为主。从烟叶中提取烟碱的常见方法有溶剂萃取法［11］、超临界萃取法［12］、水蒸气蒸馏法［13］、离子交换法［14］、超声辅助酶法［15］等。目前工业生产中主要采用溶剂萃取法和蒸馏法，但这两种方法存在工艺复杂、环境污染大和提取效率低等缺点。离子交换法和超临界萃取法的提取效率较高，但生产成本也较高。超声辅助酶法较环保，但提取时间长，且分离难度大。因此，寻找高效的绿色提取方法具有重要意义。在绿色化学十二原则中，溶剂的使用至关重要。深共熔溶剂（DeepEutecticSolvents，DES），是指利用有机分子和离子型化合物构成的体系［16-17］。DES是一种新型的绿色溶剂，具有制备路线简单、成本低、可生物降解等特性，且合成过程原子利用率达100%。由于DES优越的特性，其在天然产物、有机化学、电化学、能源、材料等研究领域的应用日益广泛［18-22］。Dai等［23］利用DES（蔗糖、葡萄糖或1,2-丙二醇和氯化胆碱）提取红花中酚类物质，提取率为75%~97%。Pang等［24］的研究表明，氯化胆碱可与苯酚、甲酚等低级酚类化合物形成深共熔溶剂，并成功分离正己烷相中的苯酚类物质。Zhao等［25］的密封瓶降解实验表明，21种深共熔溶剂经细菌处理后，降解率均超过69%，进—步证实了深共熔溶剂的绿色环保特性。目前，DES主要用于多酚或黄酮类生物活性物质的提取，有关烟草生物碱类物质的提取研究未见报道。因此，利用DES提取烟叶中的烟碱，旨在拓宽DES的应用领域，并实现烟碱的绿色提取。1材料与方法材料、试剂和仪器烟叶品种为红花大金元，C3F等级，2016年生产，由云南省大理市试验站提供。氯化胆碱、葡萄糖、果糖、蔗糖、尿素、1,2-丙二醇、丙三醇、甜菜碱、脯氨酸［AR，阿拉丁试剂（上海）有限公司］;烟碱标准品"99%,上海源叶生物科技有限公司）；甲醇、乙腈、氨水（色谱纯，德国Merck公司）。WatersUPLCH-CLASS超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；ME414S电子天平（感量0.0001g，德国Sartorius公司）；IKA磁力搅拌器（德国IKA公司）；KQ-500GVDV型双拼恒温数控超声波发生器（昆山市超声仪器有限公司）。方法DES的制备按照不同DES组分（表1），分别准确称取一定质量的试剂于50mL圆底烧瓶中，在80°C条件下反应4~6h，得到的无色透明液体即为DES。表1深共熔溶剂的组成Tab.1CompositionofDES标准溶液配制准确称取10.5mg烟碱标准品，用甲醇溶解并于10mL容量瓶中定容，得到标准储备液。分别取1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL标准储备液，于100mL容量瓶中用甲醇定容，配制成6个系列标准溶液，其质量浓度分别为10.5、21.0、42.0、63.0、84.0和105.0pg/mL。烟叶样品处理与分析将鲜烟叶于60C烘干[26-27],制成380pm（40目）粉末，于4C冰箱中储存，作为提取烟碱的烟草原料。准确称取20mg烟末，置于20mL带聚四氟乙烯密封盖的离心玻璃管中，加入1mLDES-水提取溶剂，旋紧密封盖，放入恒温超声提取仪中，在超声频率为45kHz，一定温度（30、40、50、60.70°C）和时间（10、20、30、40、50min）条件下进行目标化合物提取。提取完毕，将提取液冷却至室温，在3000r/min条件下离心10min,移取上清液，用甲醇定容至10mL,过0.22pm滤膜后取1mL样品溶液进行UPLC-UV分析，每个样品均检测3次。分别考察DES种类、DES含水率、料液比、提取温度及提取时间对烟碱得率的影响。UPLC-UV分析条件为：流动相A:乙腈；流动相B:0.1%氨水溶液；等梯度洗脱程序：0~8min,92%A、8%B;色谱柱：AcquityUPLCBEHHILIC柱(100mmx2.1mm,1.7pm);流速：0.3mL/min；进样量：5pL;柱温：35°C;UV检测波长：259nm。按照公式(1)计算烟碱的得率：式中：Y—烟碱的得率,mg/g;C—样品中烟碱的浓度，mg/mL;V—提取液定容体积,mL;m—烟叶样品的质量，goBox-Behnken试验设计根据Box-Behnken试验设计原理[28-29],综合单因素试验结果，选取DES含水率、提取温度、提取时间、料液比作为影响烟碱得率的4个主要因素，分别以A、B、C、D表示，每个因素的不同试验水平分别以丄0、1进行编码，如表2所示。表2响应面分析因素与水平设计Tab.2Factorsandlevelsinresponsesurfaceanalysis因素ADES含水率/%B提取温度/°CC提取时间/minD料液比/(mg・mL-1)水平-1103010100130453025506050402结果与讨论烟碱分析条件优化分别考察了由乙腈、水及氨水、乙胺、三乙胺等组成的不同比例、不同pH流动相的分离效果，结果表明，流动相为乙腈-0.1%氨水溶液(体积比为92:8),检测波长为259nm、流速为0.3mL/min、柱温为35C、进样量为5pL条件下，目标物的保留时间为2.61min，且色谱峰的分离效果较好；流动相为乙腈-0.1%乙胺(或三乙胺)溶液时，目标物的色谱保留时间均小于1.0min，且杂质峰影响较大，不利于色谱分析。实验中还比较了BEHC18柱(50mmx2.1mm,1.7pm)与BEHHILIC柱（100mmx2.1mm,1.7pm）对目标物的分离效果，通过对比目标物的色谱分离度、信号响应值和峰形等，发现BEHHILIC柱（100mmx2.1mm,1.7pm）对样品溶液中目标物的分离效果较好。因此，最终确定了1.2.3节所示的色谱条件。图1为标准溶液及样品中烟碱的色谱图。可以看出，在优化后的色谱条件下，目标物的色谱峰分离度和信号响应值较高，峰形也较好。方法验证结果采用外标法定量，以烟碱的色谱峰面积（Y,Au）对质量浓度（X,pg/mL）进行线性回归分析，得到烟碱的标准曲线回归方程。将最低浓度标准工作溶液重复进样10次，计算标准偏差，分别以3倍和10倍标准偏差为方法的检出限（LOD）和定量限（LOQ），结果见表3。可以看出，方法的线性良好，且灵敏度较高。图1烟碱（a）标准溶液（A）和烟草样品（B）色谱分离图Fig.1UPLCchromatogramsofthestandards（A）andtargetcompounds（B）:nicotine（a）表3目标物工作曲线、决定系数、检出限和定量限Tab.3Calibrationcurves,determinationcoefficients,LODandLOQoftarget目标物烟碱线性回归方程Y=16021X-6726R20.9999LOD/（pg・mL-1）0.012LOQ/（pg・mL-1）0.040单因素试验结果DES种类的确定合成了8种深共熔溶剂，按氢键供体分为4类：甜菜碱-丙三醇（DES-5）、脯氨酸-丙三醇（DES-8）氢键供体为多元醇类；氯化胆碱-尿素（DES-3）、氯化胆碱-尿素-1,2-丙二醇（DES-4）氢键供体为酰胺类；氯化胆碱-葡萄糖（DES-1）、氯化胆碱-果糖（DES-2）氢键供体为糖类；氯化胆碱-脯氨酸-葡萄糖（DES-6）、氯化胆碱-脯氨酸-蔗糖（DES-7）氢键供体为羧酸类。图2DES种类对烟碱得率的影响Fig.2EffectsoftypeofDESonnicotineyield在超声辅助提取条件下，设置相同的实验条件：DES含水率25%，提取温度50°C,提取时间30min，料液比20mg/mL，并以传统的提取溶剂95%乙醇为对照。结果（图2）显示，氢键供体为酰胺类的深共熔溶剂（DES-3和DES-4）对烟碱的提取效率明显优于氢键供体为多元醇类、糖类、羧酸类的深共熔溶剂，且优于95%乙醇的提取效果。综上，确定最优DES为氯化胆碱-尿素（DES-3），以其为提取溶剂时烟碱得率为21.44±0.19mg/g。DES含水率的确定考察了DES含水率对烟碱提取效率的影响，结果如图3所示。可以看出，以氯化胆碱-尿素/水为提取溶剂（DES含水率为0~50%）,在50°C和提取时间30min条件下，烟碱得率先升高后降低，在DES含水率为30%时烟碱的得率最高，为22.67±0.37mg/g。因此，选择DES含水率为30%。图3DES含水率对烟碱得率的影响Fig.3EffectsofmoisturecontentinDESonnicotineyield提取温度的确定以氯化胆碱-尿素/水为提取溶剂，在提取时间30min条件下，考察了提取温度对烟碱测定结果的影响。结果（图4）显示，在30~50C范围内，随着提取温度的升高，烟碱得率先升高后趋于稳定，在50C时烟碱得率基本稳定。因此，选择提取温度为50C。图4提取温度对烟碱得率的影响Fig.4Effectsofextractiontemperatureonnicotineyield提取时间的确定在DES含水率30%、提取温度50C、料液比20mg/mL条件下，考察了提取时间对烟碱得率的影响，结果如图5所示。可以看出，提取时间在10~30min范围内增加时，烟碱得率先升高后趋于稳定，在30min时烟碱得率基本稳定。因此，选择提取时间为30min。图5提取时间对烟碱得率的影响Fig.5Effectsofextractiontimeonnicotineyield料液比的确定以氯化胆碱-尿素/水为提取溶剂，提取温度50工、提取30min条件下，考察了料液比对烟碱测定结果的影响，结果如图6所示。可以看出，料液比在10~50mg/mL范围内增加时，烟碱得率呈逐渐下降趋势。从节约溶剂，控制成本方面考虑，选择料液比为20mg/mL。图6料液比对烟碱得率的影响Fig.6Effectsofsolid/liquidratioonnicotineyield2.4Box-Behnken设计优化提取工艺响应面试验结果响应面试验设计与结果如表4所示。模型建立与分析对表4的试验结果进行多元线性回归拟合，得到烟碱得率（Y）与DES含水率（A）、提取温度（B）、提取时间（C）和料液比（D）4个因素的回归方程（1）：模型回归方差分析结果见表5。可以看出，回归模型Pv0.0001,表明回归模型达到极显著水平；方程的决定系数R2=0.97，表明该方程拟合度较高，可利用该模型对烟叶中烟碱的提取情况进行分析和预测；失拟项F=2.994,P=0.151>0.05，表明回归模型失拟不显著。可见，该模型可用于预测DES提取烟碱的得率。其中，A和D的P值小于0.05，表明DES含水率和料液比两个因素对烟碱得率有显著影响。表4提取响应面分析方案及结果Tab.4Experimentaldesignandresultsforresponsesurfaceanalysis试验编号1234567891011121314151617181920212223242526272829ADES含水率/%5030501030305030303030103030 10 50 3030301030 30 10505030303010B提取温度/°C4545454545 60 45 3030456045 60 45604545453045304530306045604545C提取时间/min30505030301030303010305050303010301050 30 10 5030303030 30 3010D料液比/(mg・mL-1)40402540252510 10 40 4010252525 25 2525102510251025252525402525烟碱得率/(mg・g-1)17.5220.5017.7415.3021.2320.2417.0021.8920.8621.3422.2015.7222.6722.1116.0417.2922.1722.3722.1116.0720.8622.3715.7017.7618.0421.9921.0921.8115.92各因素的交互作用根据回归模型绘制各因素交互作用曲面图，如图7所示。可以看出：DES含水率与提取温度交互作用(图7a)。在提取时间30min、料液比20mg/mL条件下，当提取温度为一定值时，烟碱得率随DES含水率的升高逐渐增大，达到最高点后逐渐减小。表明提取温度为适宜值时，在较低的DES含水率条件下就能达到较高的烟碱提取效率；当DES含水率固定时，随着提取温度的升高，烟碱得率无明显变化。DES含水率与提取时间交互作用(图7b)。在提取温度50°C、料液比20mg/mL条件下，当提取时间为一定值时，烟碱得率随DES含水率的升高逐渐增大，达到最高点后逐渐减小。表明提取时间为适宜值时，在较低的DES含水率下就能达到较高的烟碱提取效率；当DES含水率固定时，随着提取时间的增加，烟碱得率无明显变化。表5回归模型方程的方差分析Tab.5Analysisofvarianceforregressionmodelequation方差来源模型平方和187.1199.3410.0990.8032.3480.0010.1040.4130.3430.0010.177163.8930.0760.1460.3344.8154.2480.568R2=0.97自由度14ABCDAB显著性极显著极显著显著ACADBCBDCDA2极显著B2C2D2F值38.85827.1560.2862.3356.8270.0020.3031.2010.9980.0030.514476.4920.2200.4250.972P值v0.00010.00010.60090.14880.02050.96490.59050.29170.33480.95460.4853<0.00010.64640.52500.3409剩余项失拟项纯误差相关性1111111111111114104均方13.3669.3410.0990.8032.3480.0010.1040.4130.3430.0010.177163.8930.0760.1460.3340.3440.4250.1422.9940.1510DES含水率与料液比交互作用(图7c)。在提取温度50°C、提取时间30min条件下，当料液比为一定值时，烟碱得率随DES含水率的升高逐渐增大，达到最高点后逐渐减小。表明料液比为适宜值时，在较低的DES含水率下就能达到较高的烟碱提取效率；当含水率固定时，随着料液比的增加，烟碱得率略有下降，但变化不明显。(4)提取时间与提取温度交互作用(图7d)。在DES含水率25%、料液比20mg/mL条件下，当提取时间为一定值时，随着提取温度的升高，烟碱得率无明显变化。当提取温度为一定值时，随着提取时间的增长，烟碱得率也无明显变化。表明提取时间与提取温度交互作用不显著。(5)提取温度与料液比交互作用(图7e)。在DES含水率25%、提取时间30min条件下，当提取温度为一定值时，随着料液比的增加，烟碱得率先无明显变化后显著降低。当料液比固定时，随着提取温度的升高，烟碱得率缓慢增加。表明料液比对烟碱得率的影响更显著。(6)提取时间与料液比交互作用(图7f)。在DES含水率25%、提取温度50C条件下，当提取时间为一定值时，随着料液比的增加，烟碱得率先无显著变化后逐渐降低。当料液比固定时，随着提取时间的增加，烟碱得率逐渐增加。验证试验结果通过软件DesignExpert8.0.5求解方程(1),得到优化的提取条件：深共熔溶剂含水率32%，提取温度40工，提取时间30min，料液比10mg/mL。在此条件下，由响应面模型预测的烟碱得率为22.72mg/g。为检验模型的可靠性，采用优化的工艺条件进行3次验证试验，烟碱得率平均值为22.89mg/g，与理论预测值相比，相对偏差为0.75%。可见，该模型是可靠的，响应面法适用于烟草中烟碱提取工艺的回归分析和参数优化。图7烟碱提取的响应面Fig.7Responsesurfaceplotsofmodelfornicotineextraction3结论参考文献【相关文献】ChengJC，DaiF，ZhouB，etal.Antioxidantactivityofhydroxycinnamicacidderivativesinhumanlowdensitylipoprotein：Mechanismandstructure-activityrelationship[J].FoodChemistry，2007，104(1)：132-139.HanYZ，MamiyaA，NkyaE，etal.Purificationandcharacterizationofchlorogenicacidoxidasefromedibleburdock(ArctiumlappaL.)[J].FoodPreservationScience，2006，32(6)：275-281.[3]吴亿勤，刘秀明，秦云华，等.DART-MS/MS法测定烟草及烟草制品中的烟碱[J]•烟草科技，2017,50(8):46-51,74.WUYiqin，LIUXiuming，QINYunhua，etal.DeterminationofnicotineintobaccoandtobaccoproductsbyDART-MS/MS[J].TobaccoScience&Technology,2017,50(8)：46-51,74.AgrawalSS，RajagopalK.Nicotinecontentsinvarioustoothpowders(Dantmanjans)：measurementandsafetyevaluation[J].FoodandChemicalToxicology，2009，47(3)：511-524.LiZB，HuangDN，TangZX，etal.Fastdeterminationofchlorogenicacidintobaccoresiduesusingmicrowave-assistedextractionandcapillaryzoneelectrophoresistechnique[J].Talanta，2010，82(4)：1181-1185.CrooksPA.Chemicalpropertiesofnicotineandothertobacco-relatedcompounds[M]//GorrodJW，JacobIIIP.Analyticaldeterminationofnicotineandrelatedcompoundsandtheirmetabolites.Amsterdam：Elsevier，1999：69-147.IsaacPF，RandMJ.Bloodlevelsofnicotineandphysiologicaleffectsafterinhalationoftobaccosmoke[J].EuropeanJournalofPharmacology，1969，8(3)：269-283.KonoY，KobayashiK，TagawaS，etal.Antioxidantactivityofpolyphenolicsindiets：Rateconstantsofreactionsofchlorogenicacidandcaffeicacidwithreactivespeciesofoxygenandnitrogen[J].BiochimicaetBiophysicaActa(BBA)-GeneralSubjects1997，1335(3)：335-342.[9]JacobsonJS.Thebrownpigmentsofautolyzedtobaccoleaves:n.Incorporationoflabeledrutinandchlorogenicacid[J].ArchivesofBiochemistryandBiophysics，1961，93(3):591-597.GuoC，SunDW，YangS，etal.Cheminformabstract:Iridium-catalyzedasymmetrichydrogenationof2-pyridylcyclicimines:ahighlyenantioselectiveapproachtonicotinederivatives[J].JournaloftheAmericanChemicalSociety，2015，137(1):90-93.黄兰芳，胡伟，谢建伟，等•加速溶剂萃取法提取烟叶挥发性成分条件的优化[J]•光谱实验室，2010,27(4):1406-1410.HUANGLanfang,HUWei,XIEJianwei,etal.Optimizationofextractionconditionsfortheextractionofvolatilecomponentsincuttobaccowithacceleratedsolventextraction[J].ChineseJournalofSpectroscopyLaboratory，2010，27(4):1406-1410.AlagicS，StancicI，PalicP，etal.ChemicalcompositionofthesupercriticalCO2extractsoftheYaka，PrilepandOtljatobaccos[J].JournalofEssentialOilResearch，2006，18(2):185-188.[13]卫青，刘维涓，蔡卿，等.烟碱蒸馏简易装置及实验条件研究[J].云南化工，2004，31(2):47-48.WEIQing，LIUWeijuan，CAIQing，etal.Asimpledistillationsetfornicotine[J].YunnanChemicalTechnology，2004，31(2):47-48.[14]明宁宁，郭俊成，刘强，等.烟草中生物碱的提取和分析方法研究进展[J].中国烟草学报，2007，13(3):64-70.MINGNingning，GUOJuncheng，LIUQiang，etal.Extractionandanalysisofalkaloidsintobacco:areview[J].ActaTabacariaSinica，2007，13(3):64-70.[15]朱松，娄在祥，陈尚卫，等•超声辅助酶法提取废次烟叶中绿原酸、烟碱工艺研究[J].食品工业科技，2012,33(5):181-184.ZHUSong,LOUZaixiang,CHENShangwei,etal.Studyonultrasound-assistedenzymeextractionofchlorogenicacidandnicotinefromtobaccoleaves[J].ScienceandTechnologyofFoodIndustry，2012，33(5):181-184.AnastaspT，KirchhoffMM.Origins，currentstatus，andfuturechallengesofgreenchemistry[J].AccountsofChemicalResearch，2002，35(9):686-694.VenturaSPM，MarquesCS，RosatellaAA，etal.ToxicityassessmentofvariousionicliquidfamiliestowardsVibriofischerim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